Extracto
Antecedentes
reacción tumor de estroma está asociada con la activación de los fibroblastos. Nemosis es un nuevo tipo de activación de los fibroblastos. Esto conduce a un aumento de la producción de factores de crecimiento y proteínas proinflamatorias y proteolíticas, mientras que al mismo tiempo las proteínas del citoesqueleto se degradan. Aquí hemos utilizado emparejado células recurrentes de carcinoma oral de células escamosas (SCC) normal de fibroblastos de la piel y de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y el primario y para estudiar la respuesta nemosis.
Principales conclusiones
fibroblastos era nemosis analizada por la proteína y la expresión génica y la regulación paracrina con ensayo de formación de colonias. Una de las cepas de fibroblastos normales, FB-43, upregulated la COX-2 en nemosis, pero FB-74 células no lo hicieron. Por el contrario, la CAF-74 esferoides expresan la COX-2, pero CAF-43 células no lo hicieron. proteína alfa-SMA se expresó en ambas cepas CAF y en células FB-74, pero no en FB-43 fibroblastos. Sus niveles de mRNA fueron regulados a la baja en nemosis, pero las CAF comenzaron a recuperar la expresión. FSP1 ARNm se downregulated en los fibroblastos normales y células CAF-74, pero no en CAF-43 fibroblastos. Serina proteasa FAP fue aumentada en todos los fibroblastos, más aún en los CAF nemotic. VEGF, HGF /SF y ARNm se upregulated FGF7 niveles de grado variable en nemosis. CAF aumentó la formación de colonias de líneas de células tumorales primarias UT-SCC-43A y UT-SCC-74A, pero los fibroblastos normales inhibieron el crecimiento independiente de anclaje de células UT-SCC-43B y UT-SCC-74B recurrentes.
Conclusiones
respuesta Nemosis, como se observa por la COX-2 y factor de crecimiento de inducción, y la expresión de marcadores de CAF a-SMA, FSP1 y FAP, varía entre poblaciones de fibroblastos. La expresión de marcadores de CAF difiere entre los fibroblastos normales y CAF en nemosis. Estos resultados ponen de manifiesto la heterogeneidad de los fibroblastos y las propiedades cambiantes promotores de tumores de CAF
Visto:. Räsänen K, Virtanen I, Salmenperä P, R Grenman, Vaheri A (2009) Las diferencias en la respuesta de la normal y Nemosis asociada a cáncer fibroblastos de pacientes con carcinoma de células escamosas oral. PLoS ONE 4 (9): e6879. doi: 10.1371 /journal.pone.0006879
Editor: Immo A. Hansen, de la Universidad Estatal de Nuevo México, Estados Unidos de América
Recibido: June 9, 2009; Aceptado: 6 Agosto de 2009; Publicado: 1 de septiembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Räsänen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Cultural de Finlandia, Fundación Magnus Ehrnrooth, el finlandés Diabetes Research Foundation, EVO Beca de Investigación, Organizaciones de cáncer de Finlandia y la Academia de Finlandia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
microambiente tumoral juega un papel importante en la progresión del cáncer y los fibroblastos se sabe que son componentes clave de la estroma tumoral. Recientemente se ha sugerido que los fibroblastos estromales inicialmente inhiben las primeras etapas de la carcinogénesis y más tarde bajo la influencia paracrina de los epitelios transformado se activan conduce a la promoción del crecimiento del cáncer. La dependencia de carcinomas en los fibroblastos del estroma disminuye a medida que progresa el cáncer, en parte a través de un interruptor en las células epiteliales de paracrina a autocrinos regulación [1], [2]. Entre los fibroblastos activados son fibroblastos asociados con el cáncer (CAF), que se caracterizan por el aumento del índice mitótico, las mutaciones en genes supresores de tumores tales como p53 y por aumento de la secreción de factores de crecimiento, quimiocinas y componentes de la matriz extracelular (ECM) [2], [3], los cambios que todos están implicados en el crecimiento y la invasión tumoral [4] marcadores CAF utilizados .Widely incluyen actina α-músculo liso (α-SMA), fibroblastos proteína específica 1 (FSP1, también conocido como S100A4) y la proteína de activación de fibroblastos (FAP, también conocido como seprase) [5]. a-SMA, un componente del citoesqueleto, es el marcador más utilizado para los fibroblastos activados. Se se incorpora en las fibras de estrés aumentando así la actividad contráctil de los fibroblastos [6]. FSP1 pertenece a la S100 super-familia de proteínas de unión a calcio. Promueve el crecimiento del tumor mediante el control de la progresión del ciclo celular y la integridad del citoesqueleto [7]. FAP es una serina proteasa que no se expresa en los tejidos adultos normales, pero se induce su expresión en fibroblastos activados en respuesta a la herida reacción de curación y tumor de estroma [8]. Sin embargo, está bien establecido que los fibroblastos son heterogéneos [9], [10] y que los CAF expresan de forma diferente estos marcadores [11], [12].
Nemosis, un fenómeno de activación de los fibroblastos (para revisión ver Vaheri . et al 2009 [13]), anteriormente se ha estudiado el uso de fibroblastos dérmicos normales [14] - [19]. La formación de un esferoide de fibroblastos causa miríada de genes diferencialmente expresados en estos fibroblastos activados. Dos patrones distintos pueden ser encontrados en la expresión: i) la expresión de factores de crecimiento y proteolíticas y proteínas proinflamatorias aumenta y ii) expresión de los componentes del citoesqueleto disminuye. Sobre la base de los resultados publicados anteriormente, la ciclooxigenasa-2 (COX-2), que es conocido por estar asociado con la inflamación y las primeras etapas de la carcinogénesis, y el factor de crecimiento de hepatocitos /factor de dispersión (HGF /SF), que se ha demostrado que la promoción de las células tumorales invasividad, se han considerado las proteínas característicos de nemosis. agrupación espontánea de fibroblastos en esferoides también puede ser inducida por células tumorales medio condicionado [14], [15]. Hemos demostrado previamente que el cultivo de esferoides de fibroblastos bajo la influencia de los queratinocitos HaCaT benignos inhibe nemosis, como se ve por la expresión suprimida de la COX-2, mientras que las células HaCaT malignas tienen un efecto nemosis promotoras en los fibroblastos normales, que se manifiesta como la regulación positiva mejorada sobre la COX-2 , HGF /SF y VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) [17].
carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) es el sexto cáncer más común en todo el mundo y la supervivencia global de pacientes es pobre. Esto se debe principalmente a las altas tasas de recurrencia del cáncer y la invasión local, en parte causadas por mutaciones en el gen p53, que se pueden encontrar en más de 70% de HNSCCs [20], [21]. La cirugía y la radioterapia son las líneas más utilizadas de tratamiento y en la actualidad la terapia molecular dirigida solamente aprobado para cáncer de cabeza y cuello es cetuximab (Erbitux; ImClone Systems Inc., Nueva York, Nueva York), un inhibidor de anticuerpo monoclonal del receptor del factor de crecimiento epidérmico ( EGFR). Sin embargo, no todos los pacientes HNSCC se benefician de terapias dirigidas a EGFR, ya que la sobreexpresión, pero no parece mutación para determinar la respuesta al tratamiento. Fase 3 para CECC están actualmente en curso para la orientación VEGF (bevacizumab, un anticuerpo monoclonal inhibidor) y para p53 (INGN 201, terapia génica) [22], [23]. Otro objetivo potencial es COX-2 que se ha encontrado para ser elevados en carcinoma de células escamosas oral (CCCA) y se ha demostrado que disminuye la radiosensibilidad del tumor [24]. Los estudios que utilizan cepas de células de pacientes emparejados han demostrado que existe una correlación en radiosensitivities entre las células CCCA, fibroblastos dérmicos y los fibroblastos asociados con el cáncer recogidos del mismo individuo y que estas diferencias individuales en la radiosensibilidad podría predecir el resultado de la radioterapia [25], [ ,,,0],26].
a partir de los resultados anteriores que bajo la influencia de las células malignas fibroblastos normales nemotic empiezan a parecerse a los CAF, el objetivo de este trabajo fue estudiar la respuesta nemosis de piel autóloga y fibroblastos asociados al cáncer, a la comparar la expresión de marcadores de CAF entre estos fibroblastos cepas y su destino en nemosis y para investigar cómo estas diferentes poblaciones de fibroblastos influyen en las células SCC orales de pacientes emparejados. Nuestro estudio muestra que tanto los fibroblastos normales y asociados con el cáncer muestran una variación entre individuos, vistos como diferentes niveles de expresión basales de CAF y las diferentes respuestas del factor de crecimiento en nemosis, y tienen un impacto diferencial en las células SCC. El comportamiento de los marcadores estudiados en CAF nemosis siguió la respuesta general nemosis: citoesqueleto α-SMA y FSP1 se downregulated y proteolítica FAP se upregulated. La única excepción fue una de las cepas de la CAF que upregulated FSP1 en nemosis. Las principales diferencias sistemáticas entre los fibroblastos normales y asociadas al cáncer fueron los niveles basales de factores de crecimiento disminuyó en los CAF y la capacidad de los CAF nemotic que comienzan a recuperar la expresión de α-SMA y el aumento de la expresión de FAP en nemosis en comparación con sus homólogos normales.
Resultados
las diferentes poblaciones de fibroblastos muestran diferencias en la respuesta a nemosis
en primer lugar hemos querido investigar la expresión del marcador nemosis utilizado previamente la COX-2 en las cuatro poblaciones de fibroblastos. No había ninguna expresión basal de la COX-2 en ninguna de las cepas de fibroblastos, y no se indujo en cultivo en monocapa. Sin embargo, cuando se cultivaron como esferoides los fibroblastos normales FB-43 comenzó a expresar COX-2 después de 48 horas (Figura 1A), pero esto no se observó en los otros fibroblastos normales cepa FB-74 (Figura 1C). resultados opuestos se observaron con los fibroblastos asociados al cáncer, donde hay la COX-2 se expresó en los CAF-43 esferoides de fibroblastos (Figura 1B), pero las células CAF-74 comenzaron a expresar la COX-2 después de 24 horas (Figura 1D). Estos resultados difieren de los publicados anteriormente e indican que la COX-2 no debe ser utilizado exclusivamente para medir la respuesta nemosis.
Los fibroblastos se cultivaron como esferoides o monocapa durante el tiempo indicado. (A) FB-43 esferoides comenzó a producir COX-2 después de 48 horas y no α-SMA fue producido, mientras que CAF-43 células (B) no indujeron la COX-2, pero expresó α-SMA. Tanto FB-74 (C) y CAF-74 (D) produjeron α-SMA, pero COX-2 sólo se indujo en CAF-74 esferoides. Todos los tipos de fibroblastos expresaron cantidades iguales de vimentina. (E) Todas las células UT-SCC expresan la COX-2, pero sólo 74A y 74B mostraron niveles de p53 inducida.
También analizaron los niveles de proteína de vimentina y α-SMA en estas células. Las cuatro poblaciones de fibroblastos expresan vimentina en cantidades iguales, como se esperaba, ya que los fibroblastos
in vitro
se consideran estar en un estado parecido cicatrización de heridas. Ambas cepas CAF expresado α-SMA, CAF-74 un poco más de CAF-43. Curiosamente, también las células normales FB-74 expresan α-SMA, pero no se detectó expresión de la proteína en la otra cepa de células de fibroblastos normales FB-43. regulación a la baja dependiente del tiempo de α-SMA se observó en esferoides pero no en los cultivos en monocapa, causada por la degradación del citoesqueleto en estos fibroblastos que pasan por nemosis. Esto está en consonancia con los resultados anteriores por Bizik et al. [14], donde se utilizaron disminución de los niveles de actina como marcador de la degradación de esferoide. GAPDH se utilizó como control de carga.
Figura 1E es una inmunotransferencia de las cuatro líneas celulares de carcinoma de UT-SCC. Todos ellos expresaron la COX-2, pero curiosamente sólo se UT-SCC 74A y 74B tenía un nivel de proteína p53 inducida, lo que sugiere una mutación p53. No hemos podido detectar p53 en cualquiera de las poblaciones de fibroblastos, una noción que está de acuerdo con el informe de Qiu et al. [27] en el que no pudieron detectar alteraciones genéticas somáticas en CAF.
Different expresión de marcadores de CAF en cepas de fibroblastos
Dado que los niveles de proteína de α-SMA variar según las diferentes poblaciones de fibroblastos, que decidió investigar también la expresión de otros marcadores CAF FSP1 y FAP ampliamente utilizado. patrón de expresión génica de estos tres genes en los fibroblastos cultivados como esferoides para 0, 24, 48 y 72 horas se analizó utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. Q-PCR fue elegido como el método sobre inmunotransferencia debido a su mayor sensibilidad. GAPDH se utilizó como gen de referencia que la expresión de los genes diana se normalizó a, después de lo cual se calcularon los coeficientes de expresión pliegue relativas. El nivel de expresión basal de α-SMA, FSP1 y FAP fue (P & lt; 0,01) significativamente menor en las células CAF-43 que en normales FB-43 fibroblastos (Figura 2A). Sin embargo, como se ve en la Figura 2B, este no era el caso con CAF-74 fibroblastos, donde en comparación con células FB-74 α-SMA expresión ratio era igual, FSP1 1,4 veces más alta y la relación de la expresión de FAP sorprendentemente 10 veces más alta (P & lt ; 0,01)
La expresión de genes marcadores de la CAF fue estudiada mediante Q-PCR.. (A) α-SMA, FSP1 y FAP ratios de expresión fueron significativamente menores (P & lt; 0,01) en las células CAF-43 en comparación con FB-43 células, pero igual o superior en CAF-74 fibroblastos. (B) Cuando se cultiva como esferoides todos los fibroblastos la expresión de α-SMA regulados a la baja, pero los CAF comenzó a recuperar la expresión a las 72 h (P & lt; 0,05 en FB-43 vs CAF-43 y en el FB-74 vs CAF-74) ( C) FSP1 se downregulated en los fibroblastos normales y en células CAF-74, pero no en células CAF-43, (D) y FAP se upregulated en todas las líneas celulares que van a través de nemosis, más aún en los CAF (P & lt; 0,05 en 72 h CAF -43 en comparación con 72 h FB-43). Columnas: media; barras de error; SEM.
Respuesta
Nemosis de los marcadores de la CAF entre estas poblaciones de fibroblastos mostró también la variación. El nivel de α-SMA se downregulated drásticamente en esferoides, lo que refleja los niveles de proteína e indicando la descomposición del citoesqueleto en estos esferoides. Esto también es cierto para FB-43 células, para los que no hemos podido detectar la expresión de proteínas. A diferencia de los fibroblastos normales, los CAF comenzaron a recuperar la expresión α-SMA a las 72 horas; en comparación con los fibroblastos normales, el aumento fue estadísticamente significativa (P & lt; 0,05) (Figura 2C). FSP1 mRNA disminuyó, como se esperaba, en ambas cepas de células de fibroblastos normales y en células CAF-74, pero, sorprendentemente, aumenta en CAF-43 esferoides (Figura 2D). La tercera FAP marcador CAF fue inducida en nemosis en todas las poblaciones de fibroblastos, después de la huella digital en general nemosis. Esta inducción fue mayor en esferoides CAF que en esferoides de fibroblastos normales (P & lt; 0,05 en CAF-43 vs. FB-43, no es estadísticamente significativa en 73 células debido a la alta variación entre las muestras) (Figura 2E)
. expresión diferencial de los factores de crecimiento en fibroblastos normales y asociadas a cáncer
el otro sello de nemosis es el aumento de la producción de varios factores de crecimiento, incluyendo VEGF, HGF /SF y FGF7 (KGF). Por lo tanto utilizamos Q-PCR para estudiar los niveles de expresión de estos genes en las cuatro poblaciones de fibroblastos. Ambas cepas CAF tuvieron menores niveles de expresión basales de VEGF, HGF /SF (P & lt; 0,05) y FGF7 (P & lt; 0,01) mRNA en comparación con los fibroblastos normales emparejados (Figura 3A y 3B). Cuando se cultiva como esferoides las cuatro poblaciones de fibroblastos mostraron regulados por incremento de VEGF, HGF /SF y la expresión de ARNm FGF7. la inducción de VEGF fue más alta en CAF-74 células (más de 15 veces) (Figura 3C), mientras más alto el HGF /SF de inducción se observó en CAF-43 células (más de 30 veces) (Figura 3D). FGF7 niveles estaban regulados de forma ligeramente diferente; más se observó en 6 veces la inducción de células FB-43, otras células tenían una media de inducción 5 veces, y curiosamente en las células de la CAF-74 en el punto de 72 horas esta inducción habían bajado a 2,5 veces (Figura 3E) .
expresión del gen del factor de crecimiento se ha estudiado el uso de Q-PCR. (A y B) Ambas líneas celulares CAF habían reducido la expresión de HGF /SF (P & lt; 0,05) y FGF7 (P & lt; 0,01) y se upregulated los tres factores de crecimiento en un grado variable en nemosis (C - VEGF, D - HGF /SF y e - FGF7). Columnas: media; barras de error; SEM.
regulación paracrina entre los fibroblastos y las células SCC
independiente de anclaje crecimiento de líneas celulares de carcinoma UT-SCC se ensayó usando el ensayo de soft-agarosa. Durante el período de observación de tres semanas todas las líneas celulares de carcinoma de cuatro formaron colonias, pero clara diferencia entre las líneas celulares de tumores primarios y recurrentes se observó (Figura 4). Cuando se cultivan solas, las dos líneas celulares de tumores recurrentes UT-SCC-43B y UT-SCC-74B forman el doble de la cantidad de colonias en comparación con líneas celulares de tumores primarios UT-SCC-43a y UT-SCC-74A; la diferencia fue estadísticamente significativa en ambos casos (P & lt; 0,05). La monocapa subyacente de fibroblastos normales FB-43 y FB-74 aumentó ligeramente el número de colonias de células de carcinoma de 43A y 74A, respectivamente. Incremento en el número de colonias se aumentó aún más cuando las células fueron cultivadas 43A y 74A SCC bajo la influencia de CAF-43 y CAF-74 (P & lt; 0,05), respectivamente. Curiosamente, cuando el cultivo de las células 43B y 74B SCC más invasivos con FB-43 y FB-74 fibroblastos, se observó una disminución en el número de colonias; este efecto fue más pronunciado con 74B células (P & lt; 0,05 en FB-74 en comparación con el control). CAF-43 y CAF-74 fibroblastos restauraron el número de colonias a mismo nivel que el control, pero no mejoran aún más la formación de colonias de células SCC recurrentes.
formación de colonias UT-SCC se estudió con el ensayo soft-agarosa . Todas las células UT-SCC forman colonias en agarosa blanda, SCC recurrente (B y D) dos veces más que las células SCC primarios (A y C) (P & lt; 0,05). fibroblastos normales aumentaron el número de colonias de células carcinomas primarios y esto fue aumentada aún más con las células CAF (P & lt; 0,05) (A y C). la formación de colonias de células SCC recurrente se inhiben con fibroblastos normales (P & lt; 0,05 en FB-74 en comparación con el control) y restaurado para controlar el nivel de los CAF (B y C). Columnas: media; barras de error; SEM
Las UT-SCC de colonias de formación resultados estaban en línea entre las células obtenidas a partir de los dos individuos.; Sin embargo, hubo una variación entre los individuos al observar de cerca los cultivos monocapa de fibroblastos subyacentes. la formación de esferoides espontáneo se observó en el cultivo monocapa subyacente de FB-43 y CAF-43 fibroblastos cuando se co-cultivaron con células tanto 43B SCC (Figura 5A-D) 43A y. FB-74 y CAF-74 no se forman espontáneamente esferoides bajo cualquiera de las condiciones anteriores, pero ellos crecen más rápido cuando se co-cultivaron con más 74B células malignas (Figura 5G-H). Figuras 5I-J se presenta la formación de esferoides espontánea de 43 fibroblastos con células 43A y 43B SCC. Con ambas líneas celulares UT-SCC, la CAF-43 células formaron esferoides significativamente más que los FB-43 fibroblastos (P & lt; 0,05). Las dos líneas celulares diferentes SCC no influyó significativamente en la formación de fibroblastos esferoide; a pesar de un ligero aumento se observó en CAF-43 esferoides con células 43B SCC recurrentes. Ninguno de los tipos de fibroblastos (FB-43, CAF-43, FB-74 y CAF-74) colonias en agarosa blanda formados.
imágenes representativas de los cultivos de fibroblastos en monocapa subyacentes. agrupación espontánea (flechas) se observa en FB-43 y las células CAF-43 bajo la influencia de pares de SCC células 43A (A y B) y 43B (C y D). Por el contrario, FB-74 (E y G) y CAF-74 (F y H) no formaron esferoides. La barra de escala 60 micras. El número de esferoides se formó se calcula a partir de los cultivos en monocapa de fibroblastos (I y J). CAF-43 células formadas significativamente más esferoides de FB-43 células (P & lt; 0,05). Columnas: media; barras de error; SEM.
Para dilucidar la razón del diferente comportamiento de las cepas de fibroblastos en cultivos en monocapa, y en particular la lenta tasa de crecimiento de las células de la CAF-74, se realizó la senescencia asociada a beta-galactosidasa (SA- ß-gal) tinción. actividad SA-β-gal es el marcador más utilizado para la senescencia celular. la senescencia inducida por estrés prematuro es causada por el estrés oxidativo, el daño del ADN y la activación de oncogenes [28]. Como era de esperar, la CAF-74 células mostraron una fuerte tinción SA-β-gal. CAF-43 fibroblastos eran así positivo, pero CAF-74 tuvieron significativamente más (P & lt; 0,01). Células senescentes (Figura 6) guía
imágenes representativas de los cultivos de fibroblastos en monocapa teñidas para la actividad de SA-β-gal. FB-43 (A) y FB-74 (C) muestran poca o ninguna tinción; CAF son positivos (B y D). Barra de escala de 200 micras. CAF-74 tenía significativamente más (P & lt; 0,01) de las células SA-β-gal en comparación con CAF-43 (E). Columnas: media; barras de error; SEM.
Discusión
carcinomas primarios se considera que los órganos no organizados que están compuestos de varios tipos de células, incluyendo las células de cáncer, fibroblastos y otras células mesenquimales, y células relacionadas con la inmunidad y vasculatura. El microentorno del tumor de estroma lleva a fibroblastos de activación y paracrina de señalización entre los fibroblastos y las células del cáncer [29]. En nemosis, fibroblastos activados comienzan a producir las proteínas implicadas en la inflamación, la proteólisis y la progresión del cáncer y, al mismo tiempo regular a la baja la expresión de las proteínas del citoesqueleto [14] - [19].
El objetivo de este trabajo fue investigar la respuesta del paciente nemosis con ajuste normal y fibroblastos asociados al cáncer, y para estudiar el patrón de expresión de los marcadores de la CAF y su comportamiento en nemosis. Sólo una de las cepas normales de fibroblastos (FB-43) y uno de los CAF (FB-74) inducidas COX-2 en nemosis. Esto está en contraste con los resultados publicados previamente, en los que la COX-2 de inducción se ha considerado una característica distintiva de nemosis. Sin embargo, en estos estudios fibroblastos han sido de origen neonatal y fibroblastos Aquí hemos utilizado obtenida de los adultos. Por lo tanto, este resultado conflictivo indica que la COX-2 no debe ser utilizado exclusivamente para medir la respuesta nemosis, pero otros marcadores, como el perfil de proteínas secretadas, se debe investigar también.
La otra característica clave de nemosis es la degradación dependiente del tiempo de citoesqueleto. El nivel de proteína tres de las cepas de fibroblastos expresan α-SMA, sorprendentemente también los fibroblastos normales de la piel FB-74. La otra cepa de fibroblastos normales FB-43 no expresó α-SMA a nivel de proteínas. Sin embargo, cuando la medición de los niveles de ARNm con el método de Q-PCR más sensible, las cuatro poblaciones de fibroblastos mostraron expresión α-SMA y esto se downregulated en nemosis. La regulación a la baja en función del tiempo tanto en el nivel de proteína y ARNm está en línea con los resultados anteriores sobre nemosis, lo que indica la descomposición del citoesqueleto. Curiosamente los CAF comenzaron a recuperar la expresión de ARNm de α-SMA a las 72 h, la diferencia fue significativa en comparación con sus homólogos normales. En contraste con nuestros resultados, un estudio realizado por Shannon et al. [30] demostraron que los fibroblastos de la piel normal, pero no los fibroblastos orales expresan α-SMA. Sin embargo, los resultados más recientes muestran, de acuerdo con nuestros resultados, que los fibroblastos orales normales expresan α-SMA y esta expresión se incrementaron cuando estas células fueron cultivadas en medio condicionado obtenido de las células CCCA [31]. Estos resultados contradictorios pueden venir en parte del método que se utilizó para medir la expresión α-SMA; se utilizó en la primera una inmunotransferencia, en el segundo el método era inmunohistoquímica ligeramente más sensible.
Se investigaron también los niveles de ARNm de otros dos marcadores CAF, FSP1 y FAP. En nemosis FSP1 niveles disminuyeron en FB-43, FB-74 y CAF-74 esferoides, pero aumentaron en CAF-43 células. La tercera investigado FAP marcador CAF se upregulated en nemosis, más en CAF que en los fibroblastos normales, la diferencia fue significativa a las 43 cepas de fibroblastos. Con los tres marcadores CAF la respuesta nemosis siguió el patrón de disminución de la expresión de genes del citoesqueleto (α-SMA y FSP1) y aumento de la expresión de genes proteolítica (FAP). Claramente diferente respuesta se observó con la CAF-43 celdas en las que, en lugar de regulación a la baja de FSP1, los niveles aumentaron en nemosis.The heterogeneidad de los fibroblastos se hace evidente cuando se mira en los niveles basales de la expresión de marcadores de la CAF; CAF-43 células tenían niveles más bajos de los tres marcadores, CAF-74 tenían menos α-SMA, un poco más FSP1 y más de 10 veces más FAP. Estos resultados también hacen hincapié en que α-SMA, el marcador CAF /miofibroblastos más comúnmente utilizado, no debe ser utilizado exclusivamente para definir fibroblastos activados.
Otra característica distintiva de nemosis es la inducción de factores de crecimiento. Se ha demostrado que los fibroblastos orales producen significativamente más FGF7 y HGF /SF en comparación con fibroblastos de la piel [30]. Estos dos factores de crecimiento, junto con VEGF, son conocidos por ser importante en la reparación de heridas y la progresión del cáncer [32], [33]. La expresión basal de VEGF, HGF /SF y mRNA FGF7 fue menor en los CAF que en los fibroblastos normales, y esto es en contraste con los resultados anteriores [30]. Sin embargo, la tasa de crecimiento de estas células fue más lenta que la de sus homólogos normales, que podrían reflejar su disminución en la producción de factores de crecimiento. La actividad SA-β-gal de los CAF apoya esta teoría, que indica que estas células son senescentes. La necesidad de estos factores de crecimiento para ser secretada por los fibroblastos podría reducirse en los CAF ya que las mismas células tumorales, junto con los macrófagos infiltrados y las células endoteliales, son capaces de producir estos factores. Como era de esperar, VEGF, HGF /SF y FGF7 mRNAs se upregulated en nemosis de fibroblastos, y el nivel de inducción variaba entre poblaciones de fibroblastos. la inducción de VEGF fue más alta en CAF-74 esferoides, HGF /SF en CAF-43 esferoides y FGF7 en FB-43 esferoides.
Sobre la base de estos resultados, parece que la capacidad de los fibroblastos normales y de cáncer asociados para producir estos factores de crecimiento en nemosis es algo relacionado con la medida en que son necesarios en la progresión del cáncer. La dependencia de los tumores en los fibroblastos del estroma, y en particular sobre los factores de crecimiento que producen, disminuye en el curso de la progresión tumoral. Las células epiteliales requieren FGF7 para romper la polarización epitelial. FGF7 sólo se expresa por las células del estroma y su receptor FGFR2IIb solamente por las células epiteliales, lo que indica la FGF7 papel en el inicio de la progresión del tumor [34]. De las poblaciones de fibroblastos estudiados las células FB-43, que parecen ser más normal de las cepas estudiadas (en base de la inducción de la COX-2 y la falta de α-SMA), tenía el más alto de inducción FGF7 en nemosis. HGF /SF se requiere para la migración /dispersión de las células epiteliales del punto de equilibrio inicial. Nemotic células CAF-43 produjeron más HGF /SF que las otras tres cepas de células. En apoyo de esta Kankuri et al. [15] han demostrado que el HGF /SF producido por fibroblastos esferoides promueve directamente la invasión de las células cancerosas. También otro estudio ha demostrado que los fibroblastos orales coche invasión de células CCCA mediante el aumento de la secreción de HGF /SF [35]. VEGF se requiere más tarde en la progresión del tumor cuando la masa de células de cáncer se extiende el punto en que ya no puede crecer sin suministro de oxígeno. VEGF, secretada por los fibroblastos, induce la angiogénesis mediante el reclutamiento de células endoteliales para formar nuevos vasos sanguíneos [36]. células. CAF-74, que son senescentes, tienen, con mucho, el más alto nivel de VEGF en nemosis
Ha sido bien establecido que los CAF, pero no los fibroblastos normales, son capaces de promover la progresión del tumor [37] - [ ,,,0],39]. Los resultados más recientes han demostrado que inicialmente los fibroblastos normales inhiben el crecimiento de células de cáncer [2], y nuestros resultados actuales estar de acuerdo con esta noción. Mostramos aquí que los fibroblastos normales de hecho inhiben la formación de colonias de células SCC recurrentes, pero curiosamente no se observó con células tumorales primarias. Los CAF parecen ser capaces de influir en sólo las células SCC primarios y no las células recurrentes. Las CAF producen niveles más bajos de factores de crecimiento, y podría ser que por esta razón que son capaces de influir en el SCC primaria más sensible, pero las células recurrentes menos sensibles no responden a esta menor cantidad de factores de crecimiento secretados.
La formación de esferoides espontánea observada de FB-43 y CAF-43 en cultivos monocapa está en línea con los resultados de Kankuri et al. [15], donde la agrupación espontánea de los fibroblastos, es decir nemosis, se podría lograr mediante la adición de medio acondicionado derivado de células de tumor a una monocapa de fibroblastos. Sin embargo, no hemos encontrado esto con las cepas de fibroblastos desde el otro paciente SCC. Esto puede ser debido en parte a la inducción de p53 supresor de tumor en las células 74A y 74B SCC. Sin embargo, los fibroblastos hicieron crecer más rápido bajo la influencia de las células 74B SCC; esto también es cierto con las células CAF-74 que parecen estar en un estado de senescencia inducida por el estrés. Más aún, no hemos visto un crecimiento independiente de anclaje de los fibroblastos, en conflicto con los resultados obtenidos con carcinoma prostático asociado fibroblastos y de próstata [40]. Las posibles explicaciones para esto son las variaciones individuales y el origen de los fibroblastos. Vale la pena señalar que en los experimentos suaves-agarosa las células SCC y fibroblastos no estaban en contacto directo, pero separados por una capa sólida de agarosa, y los cultivos no fueron repuestas por medio fresco. Por tanto, la señalización paracrina entre estos dos tipos de células debe estar mediado por factores solubles.
En conclusión, este estudio demuestra claramente que los fibroblastos obtenidos de diferentes individuos varían en la expresión y el comportamiento de genes y que la expresión de marcadores de CAF difiere entre fibroblastos normales y CAF en nemosis. Tanto los fibroblastos normales y de cáncer asociados modulan las células tumorales, fibroblastos normales por inhibición del crecimiento de las células SCC invasoras y CAF mejorando aún más el crecimiento de las células SCC primarios. Nemosis, un
in vitro
modelo de activación de los fibroblastos, puede tener su
in vivo
contraparte en los fibroblastos asociados al cáncer y es una herramienta valiosa en el estudio de las variaciones entre los fibroblastos obtenidos de diferentes individuos. respuesta Nemosis, en particular de los marcadores CAF a-SMA y FAP, por lo tanto, podría ser utilizado como marcador pronóstico para predecir la reacción del estroma de los tumores.
Materiales y Métodos
cepas celulares y cultivo celular
Todas las cepas de células utilizadas habían sido establecidos previamente [25], [26], [41] y fueron proporcionados por el Dr. Reidar Grenman (hospital central de la Universidad de Turku, Finlandia). En resumen, las células UT-SCC-43A (43A) se obtuvieron de tumor primario de una mujer de 75 años con ulceración gingival y la metástasis. Histología (T4N1M0) fue un SCC bien diferenciado. UT-SCC-43B se establecieron células (43B) de la recidiva del tumor resecado. UT-SCC-74A células (74A) se obtuvieron a partir de un varón de 31 años de edad que tiene SCC en el margen derecho lingual (T3N1M0). UT-SCC-74B (74B) línea celular se estableció a partir de una metástasis más adelante en el cuello. Los fibroblastos de pacientes emparejados por FB-43 y FB-74 normales se obtuvieron de la piel y CAF-43 y CAF-74 fibroblastos se obtuvieron de la estroma de la respectiva SCC oral. El origen mesenquimal de cepas de fibroblastos se confirmó originalmente por tinción positiva para vimentina y tinción negativa para citoqueratina mediante inmunohistoquímica
.
Todas las poblaciones de células se cultivaron a + 37 ° C en 5% de CO
2 en atmósfera modificado por Dulbecco medio de eagle (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y suplementado con 5% de suero de ternera fetal (FCS) (Invitrogen), 0,3 mg /ml de glutamina, 100 mg /ml de estreptomicina y 100 U /ml de penicilina. Se formaron esferoides de fibroblastos como se describe anteriormente [17]. En resumen, 150-l alícuotas /pocillo de suspensiones de células individuales (1,3 x 10
5 células /ml) se sembraron en placas de fondo en U placas de 96 pocillos recubiertas de agarosa (Costar, Cambridge, MA).