Extracto
Objetivos
Debido a que se cree que las células madre del cáncer hepático (HCSCs) que se derivan de la conversión de las células madre normales hepáticas (hNSCs), la identificación de las diferencias que distinguen a partir HCSCs hNSCs es importante.
Métodos
El modelo HCC se estableció en ratas F344 por inducción DEN. Utilizando el análisis FACS, las células de población lateral de HCC (SP-HCC) fueron aisladas de las células epiteliales como de tejidos HCC, y las células de población lateral a partir de hígado normal (SP-CEN) fueron aisladas de las células normales del hígado singénicos. La expresión de marcadores de células madre se detectó en ambas subpoblaciones recién aisladas y amplificadas. Después de la inducción con HGF, la diferenciación de cada subpoblación se analizó por detección de marcadores de hígado tempranos y tardíos. In vivo, las características biológicas de SP-HCC y SP-CEN se analizaron mediante la reparación de los hígados lesionados o la formación de tumores en ratones desnudos. Además, la expresión de miRNAs se examinó en ambas poblaciones de matriz miARN y QRT-PCR.
Resultados
SP-CEN y SP-HCC fueron 4,30 ± 0,011% y 2,100 ± 0,010% de toda la población, respectivamente. Tanto SP-CEN y SP-HCC muestran una mayor expresión de marcadores de células madre (CD133 y EpCAM) que NSP-CEN y NSP-HCC, respectivamente (
P
& lt; 0,01), tanto después del aislamiento fresco y amplificación. Tras la inducción de HGF, SP-CEN generó muchas células positivas ALB y unos 7 CK-células positivas, pero NSP-CEN podría generar sólo las células positivas ALB. Por el contrario, SP-HCC dio lugar a sólo las células positivas para AFP. Como pocos como 5 × 10
5 SP-CEN eran capaces de reparar la lesión hepática, mientras que el mismo número de NSP-CEN no podía reparar el hígado. Además, sólo el 1 × 10
4 SP-HCC eran necesarias para iniciar un tumor, mientras que NSP-HCC no podía formar un tumor. En comparación con SP-CEN, 68 arriba-regulados y 10 miRNAs-regulado estaban presentes en el SP-HCC (
P Hotel & lt; 0,01).
Conclusión
Basado en los papeles decisivos de algunos miRNAs en la génesis de HCSCs, miRNAs pueden contribuir a las diferentes características que distinguen a los HCC SP-SP-CEN de
Visto:. Liu Wh, Tao Ks, Usted N, Liu Zc, Zhang ht, Dou Kf (2011) las diferencias en los perfiles de propiedades y Mirna de expresión entre las poblaciones secundarios de las células del cáncer hepático y las células normales del hígado. PLoS ONE 6 (8): e23311. doi: 10.1371 /journal.pone.0023311
Editor: Xin Wei Wang, del Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Septiembre 2010; Aceptado: July 15, 2011; Publicado: 3 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30.772.102) y la Naturaleza Fundación de Ciencias de la provincia de Shaanxi (núm 2007K09-05 (7)). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
aumento de la evidencia ha demostrado que los cánceres contienen un pequeño subconjunto de sus propias células madre similares, llamadas "células madre del cáncer" (CSC) [1], [2], [3], que se ven afectados principalmente por ambos supresores de tumores e inductores de cáncer [4], [5], [6]. HCC también contiene células madre cancerosas hepáticas (HCSCs), que tienen el mayor potencial para proliferar e invadir el tejido circundante [7]. Publicaciones recientes han demostrado que HCSCs pueden originarse a partir de células madre normales hepáticas (hNSCs) [8]. Incluso el evento inicial que transforma hNSCs a HCSCs se propone ser una forma de desregulación de hNSCs auto-renovación [9]. Por lo tanto, la comparación de las características de hNSCs y HCSCs es importante. normal del hígado es rico en hNSCs [10], y la sugerencia de que estos hNSCs pueden servir como un control óptimo para el estudio de las características de HCSCs es razonable. Sin embargo, los marcadores moleculares que definen ambos HCSCs y hNSCs siguen siendo controvertidos; Por lo tanto, el aislamiento de células de población lateral (SP) ha sido ampliamente utilizado para enriquecer los dos tipos de células madre [11]. células SP se han demostrado para ser células inmaduras y no diferenciadas y de expresar altos niveles de algunos marcadores de células madre específicas [12]. Por lo tanto, el aislamiento de células SP es una fuente alternativa de células madre, que es particularmente útil en situaciones en las que los marcadores de células madre son desconocido [12]. En ratones y ratas, el fenotipo SP parece ser una característica común de las células madre, incluyendo células normales y cancerosas madre [13], [14], [15]. En el hígado, estas células SP se han demostrado para servir un papel central en la regeneración hepática y cáncer de hígado [16]. Por lo tanto, las células SP se pueden considerar alternativas apropiadas para estudiar hNSCs y HCSCs
.
MiRNAs están surgiendo como importantes reguladores de la regulación de genes post-transcripcional. La importancia de miRNAs es subrayada por el hecho de que a menudo están desreguladas durante la carcinogénesis [17], [18], [19], [20]. Algunos miRNAs pueden promover el crecimiento del tumor a través de mecanismos comunes que contribuyen al control del ciclo celular regulados los genes miARN [21]. Además, miRNAs se han demostrado para ser un componente integral de la regulación de células madre, incluyendo células normales madre (NSC) y células madre cancerosas [22]. Una perturbación de las principales redes miARN-mRNA en células madre neurales se ha sugerido que es un sello distintivo de los CAC [23]. De hecho, un único oncogén (miRNA-145) se ha demostrado para reprogramar células primarias para mostrar un fenotipo CSC [24]. Por lo tanto, la identificación de patrones de expresión únicos y comunes de miRNAs entre HCSCs y hNSCs es esencial.
En este estudio, se aplicó el análisis de SP a dos poblaciones diferentes de células epiteliales en cultivo primario. Un tipo de células se aisló a partir de tejidos HCC rata inducidos por diethylinitrosamine (DEN) y el otro tipo de células se aisló de los tejidos de hígado de rata singénicos. poblaciones secundarios de las células normales del hígado (SP-CEN) y de los HCC (SP-HCC) marcadores de células madre altamente expresado.
In vitro
, ambas células SP tenían altas capacidades para proliferar y podían diferenciar en células maduras tras la inducción con el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).
In vivo
, SP-CEN podría ser de gran ayuda en la reparación de un hígado de rata lesionada. Por el contrario, SP-HCC podría iniciar tumores tanto en los tejidos subcutáneos y el hígado de ratones diabéticos no obesos /inmunodeficiencia combinada severa (NOD /SCID). Suponiendo que estas diferencias estaban relacionadas con las muy diferentes patrones de expresión de miRNAs entre estas dos poblaciones de células, se examinaron los perfiles de miARN de SP-CEN y SP-HCC. Debido a que se proponen HCSCs que se HCC células iniciando, la identificación de las diferencias entre los HCC-SP y SP-CEN, incluyendo miRNAs desregulados, pueden ser de gran ayuda en la comprensión de la génesis de HCSCs y el proceso tumoral de CHC.
Materiales y Métodos
1. Recogida de la muestra
Treinta ratas Fisher 344 machos (de la National Laboratory Animal Resource Roedor, Shanghai, China) se dividieron aleatoriamente en grupos de control y de prueba. Ratas en el grupo de prueba se trataron con 0,05% DEN (Sigma Co, EE.UU.) en el agua de bebida durante 6 semanas y luego se cambiaron a agua potable normal [25], mientras que las ratas del grupo de control se les dio una dieta normal. Tres ratas de cada grupo se sacrificaron bajo anestesia a los 2, 6, 10, 14 y 18 semanas después de la inducción DEN. Se recogieron dos nódulos HCC del grupo de ensayo y hígados normales del grupo control. Las porciones de estos tejidos se fijaron en 10% de formalina neutra tamponada con fosfato y rutinariamente procesan y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para examen histológico. Los tejidos restantes se utilizaron directamente en los experimentos detallados a continuación. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos de estudio de los animales [26] y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Investigación en la Cuarta Universidad Médica Militar. El número de protocolo animal era SYXK2008-005.
2. aislamiento de células y la cultura
células de cáncer hepático (HCC) se aislaron de acuerdo con Hohne et al. [27], con modificaciones menores, y las células normales del hígado (CEN) se aislaron de acuerdo con Oertel et al. [28]. Tanto HCC y normal del hígado (NL) tejidos se picada en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen Co, EE.UU.) con 0,1% de colagenasa tipo IV y 0,005% de tripsina (Sigma Co, EE.UU.) y después se incubó durante 20 min a 37 ° C en un baño de agua con agitación. Después de la incubación, los sobrenadantes que contienen las células liberadas se pasaron a través de una malla de nylon 100 micras y se centrifugaron a 1000 xg durante 8 min. Los sedimentos se lavaron dos veces con solución salina equilibrada con fosfato (PBS) (Invitrogen Co, EE.UU.), y suspensiones de células individuales se recogieron. La suspensión de células individuales NL se centrifugó durante 5 min a 100 x g en DMEM, y se recogió el sobrenadante. Un gradiente de Percoll (Invitrogen Co, EE.UU.) se preparó en un tubo de 50 ml por capas secuencialmente 10 ml de 70%, 50% y 30% de Percoll. Se añadió un total de 20 ml de CEN en PBS, y el tubo se centrifugó a 1.000 xg durante 10 min. Se recogió la fracción de células en la interfaz entre 30% y 50% de Percoll. Ambos CEN y los HCC se cultivaron en placas de 6 pocillos que contienen medio E de William (Sigma Co, EE.UU.) suplementado con /vol de suero fetal bovino (Invitrogen Co, EE.UU.), 5 mg /ml de insulina (Sigma Co, EE.UU.) 10% vol, 5 hidrocortisona mu M, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. Las células adherentes proliferado y extendidas como una colonia monocapa después de 20 días de cultivo. Hemos recogido la población de células monoclonales mediante digestión local con la clonación de cilindros y trasladado a las células en una placa de cultivo nuevo para continuar con el proceso de cultivo.
3. SP clasificación de células
Las células se dividieron en dos porciones: un medio se utilizó directamente como una población ordenados simulado (SSP), mientras que la otra mitad se utiliza para la clasificación de células en un clasificador de células FACS Vantage II (Becton Dickinson Co , ESTADOS UNIDOS). La siguiente información describe el protocolo de aislamiento. Las células se marcaron con colorante Hoechst 33342 (Sigma Co, EE.UU.) a una concentración final de 4 mg /ml en la presencia o ausencia de 50 mM verapamil (Sigma Co, EE.UU.) y se incubaron a 37 ° C durante 90 min de acuerdo con los métodos descrito por Goodell et al. [11]. Las células teñidas se lavaron con PBS enfriado en hielo que contiene 2% de albúmina de suero bovino (BSA) y HEPES 10 mM, se centrifugó a 4 ° C y se resuspendieron en el mismo tampón. El yoduro de propidio (PI) (Sigma Co, EE.UU.) se utilizó para detectar la viabilidad celular. Hoechst 33342 se excitó a 355 nm y su fluorescencia se analizó en dos longitudes de onda: Hoechst 33342 azul a 450 nm y Hoechst 33342 rojo a 675 nm. Un segundo láser de argón de 488 nm (100 mW) se utilizó para excitar la fluorescencia PI para excluir las células muertas. SP células mostraron baja tinción con células población no lateral (NSP) Hoechst y se tiñeron con más intensidad.
4. ensayo de crecimiento celular
Se empleó este experimento para evaluar la capacidad proliferativa de las células de cada subpoblación, incluyendo SP, NSP y SSP. Las células en cada subpoblación se ajustaron a 2 × 10
6 /ml y se sembraron en 32 matraces (0.5 × 10
5 células por matraz). El medio de cultivo se suplementó con el factor inhibidor de la leucemia (LIF) a una concentración de 10 mg /ml. Todos los días durante un período de 7 días, 4 muestras de células paralelas de cada subpoblación se tripsinizaron y contaron con un microscopio invertido (BX50-32E01, Olympus, Tokio, Japón).
5. La detección de marcadores de células madre de células activadas fluorescentes (FACS) guía
La expresión de marcadores de células madre se analizó mediante un sistema FACSCaliburTM (BD Sistemas Immunocytometry, San Jose, CA) en ambas subpoblaciones recién aisladas y amplificadas subpoblaciones. Brevemente, las células se incubaron en medio E de William (que contiene 20% de FBS) a 10
6 células /ml durante 15-30 minutos a temperatura ambiente para bloquear los sitios no específicos de unión del anticuerpo. Las células de diferentes subpoblaciones se lavaron dos veces con PBS y re-suspenden en 990 l de PBS. Posteriormente, 10 l de anticuerpos, incluyendo CD133 (PE conjugado, Biolegend, EE.UU.) y EpCAM (isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado, Biolegend, EE.UU.), se añadieron a cada suspensión celular. Después de 30 min de incubación a 4 ° C en la oscuridad, las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en 0,1% de formaldehído y se analizaron por citometría de flujo.
6. la inducción de células por HGF
Las células de cada subpoblación se cultivaron en medio de inducción, que era un medio libre de suero comercial (Sigma Co, EE.UU.) suplementado con HGF (20 ng /ml). La diferenciación de las células se evaluó mediante la detección de la expresión de marcadores específicos del hígado tal como se describe a continuación.
7. La detección de marcadores de hígado por inmunofluorescencia (IF)
Después de la inducción por HGF, IF se realizó para evaluar cualitativamente si las células inducidas expresan marcadores hepáticos específicos. Para identificar la diferenciación bidireccional de las diferentes poblaciones de CEN (CEN-SP, NSP-CEN y SSP-CEN), se seleccionaron dos marcadores primarios específicos: la albúmina madura hepática marcador (ALB) (dilución 1:200; Santa Cruz, CA) y el marcador biliar citoquina 7 (CK-7) (dilución 1:200; Santa Cruz, CA). Para identificar la maduración de las diferentes poblaciones en los HCC (SP-HCC, NSP-HCC y SSP-HCC), la fetoproteína marcadores tumorales alfa (AFP) (dilución 1:200; Santa Cruz, CA) y CK-19 (dilución 1:200 ; se seleccionaron Santa Cruz, CA). En resumen, con el medio de cultivo retirado, las células en el portaobjetos de cultivo fueron lavadas dos veces con PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 20 min y luego se sumerge en PBS durante 10 min, seguido de exposición a 0,01% de Triton X-100 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Para el bloqueo de las reacciones inmunes no específicos, se trataron las células con 6% de suero de cabra (Santa Cruz, CA) a temperatura ambiente durante 30 min. Las células cultivadas en cada portaobjetos se sometieron a anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche y se lavaron tres veces con PBS frío. se añadió y se incubó durante 2 h; El anticuerpo secundario fluorescente de cabra conjugado con FITC anti-conejo (Santa Cruz, CA dilución 1:100). Posteriormente, las células fueron tratadas con 2- (4-amidinofenil) dihidrocloruro -6-indolecarbamidine (DAPI) (dilución 1:100; Sigma) durante 15 min. Se observó la fluorescencia a través de un filtro apropiado usando un microscopio de fluorescencia (FV1000MPE, Olympus Co, Tokio, Japón).
8. La detección de marcadores de hígado por Western Blot
Después de la inducción por HGF, el Western Blot se realizó para detectar cuantitativamente marcadores específicos del hígado en las células inducidas. ALB y CK-7 fueron examinados en el SP-CEN, NSP-CEN y SSP-CEN; AFP y CK-19 se analizaron en el SP-HCC, NSP-HCC y SSP-HCC. Las células se lisaron en tampón de extracción de células enteras (tampón RIPA) que contiene una tableta de cóctel inhibidor de proteasa (Complete Mini-, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Los homogeneizados se centrifugaron a 3000 xg durante 20 min a 4 ° C, y se recogieron los sobrenadantes. Las proteínas se separaron sobre 12% de gel de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana Immobilon-P PVDF (fluoruro de polivinilideno) (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Las transferencias se saturaron con tampón de bloqueo (5% de leche desnatada en TBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos de conejo anti-humano /rata /ratón monoclonales (1:600; Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA) y un anticuerpo de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1:600; Sigma, Saint Louis, MO). Después de lavados en TBS-T, las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con IgG HRP-cabra anti-conejo (1:2000; Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA). La detección de las proteínas se realizó utilizando un sistema ECL (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.). Los valores de escala de grises de cada banda sobre las transferencias se miden utilizando BandScan4.3.
9. modelo de lesión hepática y trasplante de células
SP-CEN y NSP-CEN se lavaron con PBS de forma independiente en la oscuridad y se volvió a suspender en 2 ml de solución colorante para etiquetar la membrana celular con fluorescencia roja a 37 ° C, de acuerdo con la protocolo suministrado con el kit rojo enlazador celular fluorescente PKH26 (Sigma Corp., EE.UU.). se añadió medio que contenía suero a la solución de tinción para terminar la tinción de 5 min más tarde. Las células teñidas se lavaron tres veces con PBS y se suspendieron en 0,5 ml de PBS para el trasplante. Para inducir la lesión hepática, 20 ratas F344 normales (10 para SP-CEN trasplante, 10 para la inyección NSP-CEN) se les administró CCl
4 por vía intraperitoneal a una dosis de 1,2 ml /kg de peso corporal y recibieron una hepatectomía parcial de dos tercios (2/3 HP) tres días después. Inmediatamente después de PH, las células preparadas (5 × 10
5 células por rata) fueron inyectados por separado en estas ratas a través de la vena porta.
Para cada hígado, que cortan al azar cuatro secciones congeladas. Para evaluar los efectos de colonización de SP-CEN y NSP-CEN, las secciones de hígado restaurados se observaron bajo un microscopio invertido. Cuando se observaron áreas rojas en secciones, el resultado fue identificado como positivo. Debajo de cada campo de visión, se contaron las áreas positivas, y se calculó el porcentaje de la zona positiva con respecto a toda la zona. Un porcentaje de área roja de & lt; 5% se definió como negativo (-), 5 a 25% como positivo (+), 25-50% como moderadamente positivo (++) y & gt; 50% como fuertemente positiva (++ +).
10. NOD /SCID experimentos de trasplante de xenoinjertos
Los diferentes números (1 × 10
7, 1 × 10
6, 1 × 10
5 y 1 × 10
4) de SP- HCC o NSP-HCC se inyectaron en ratones NOD /SCID mediante inyección subcutánea. Cada grupo contenía 4 ratones; Por lo tanto, se utilizaron 32 ratones para xenotrasplantes. Cada mouce se realizaron con 4 inyecciones, simétricamente 2 inyecciones en el lateral izquierdo y derecho 2 inyecciones en la espalda. El crecimiento tumoral se monitorizó cada 2 días después de la segunda semana de la inoculación. Todos los ratones fueron sacrificados en el día 60. Todos los tejidos tumorales se recogieron, se fijaron en 4% de formaldehído, y embebidos en parafina para H & amp; E tinción para evaluar la histología del tumor. Todos los resultados fueron evaluados por tres investigadores diferentes de forma independiente. Se resumieron los datos y se calculó el diámetro medio de los tumores en cada grupo (por ejemplo, 1 × 10
7 Grupo SP-HCC). De acuerdo con el tamaño medio de los tumores, se dividieron en cuatro categorías diferentes: grado 1 (-), no hay tumor macroscópico; grado 2 (+), el diámetro del tumor & lt; 0,2 cm; grado 3 (++), 0,2-0,5 cm; grado 4 (+++), & gt;. 0,5 cm
11. La expresión de miRNAs en células SP
ARN totales se obtuvieron a partir tanto de SP-CEN y SP-HCC por el kit de aislamiento de ARN Totalmente (Ambion, Austin, TX). La calidad y la cantidad de ARN totales se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y cuantificación ultravioleta. Los perfiles de expresión de miRNAs fueron detectados por el miRCURY LNA ™ (ácido nucleico bloqueado) Kit de microARN matrices (Exiqon Co, Dinamarca), que cubre todos los humanos, de ratón y de rata miARN secuencias antisentido. Además, el kit también incorpora 144 sondas miRPlus ™, que fueron proporcionados por Exiqon Corporación para la detección de los genes miARN novela. Un microgramo de ARN a partir de SP-HCC, SP-CEN y piscinas de referencia fueron co-hibridizada en la matriz Exiqon miARN durante 16 horas a 56 ° C. Después de la incubación con los dendrímeros marcados con Cy3 (Genisphere Inc, Hatfield, PA) [29], los microarrays se lavaron consecutivamente con tampones de lavado A, B y C. Las señales fluorescentes en la matriz hibridado fueron capturados por un escáner GenePix 4000B y cuantificaron utilizando GenePix Pro4.0 (Axon Instruments, Burlingame, CA). La manipulación de datos se facilitó con la normalización suite v1.63 (Instituto del Cáncer de Ontario, Toronto, Canadá) [30]. La prueba de proporción de referencia para cada miARN fue en promedio de puntos por triplicado y entre replicar los experimentos. Proporciones mayores o menores de dos veces fueron considerados como hasta reguladas o hacia abajo-regulada, respectivamente.
Dos altamente regulados hasta miRNAs, tres ligeramente hasta reguladas miRNAs, una gran medida las reguladas miARN y uno moderadamente fueron seleccionados miARN reguladas por los miRNAs como representativas para ser validados por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR). ARNs totales se transcrito de forma inversa por MultiScribe (Applied Biosystems) en mezclas de reacción que contienen cebadores específicos miR-tallo-bucle de transcripción inversa (RT) (Tabla 1). Los cebadores de PCR se listan en la Tabla 1, y los parámetros del ciclo para la reacción de PCR fueron 95 ° C durante 15 min seguido de 40 ciclos de una etapa de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s y una etapa de hibridación /extensión a 60 ° C durante 60 seg. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. La cantidad relativa de cada uno de los genes miARN a U6 RNA fue descrito por la ecuación? C
T = (C
TmiRNA-C
Tu6) [31]. El cambio a veces la miRNAs de SP-HCC en comparación con SP-CEN se muestran utilizando la ecuación 2
-ΔΔCT, donde ΔΔC
T = (? C
T SP-HCC-? C
T SP- CEN).
12. Objetivos de miRNAs desregulados
12.1. . Predicción de posibles objetivos de miRNAs desregulados
Los objetivos potenciales de los miRNAs se encuentran desregulados por los métodos anteriores fueron predichas por dos algoritmos disponibles públicamente, incluyendo MiRBase Objetivos versión 5 (disponible en: http: //microrna.sanger .ac.uk /) y TargetScan versión 4.2 (http://www.targetscan.org/).
12.2 identificación de los objetivos de tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa semicuantitativa (sqrt-PCR).
Se resumieron los objetivos probados de siete miRNAs desregulados validados. Entre estos objetivos, los miR-200a genes diana * ZEB1 y ZEB2 [32], [33] se analizaron tanto en los HCC-SP y SP-CEN por sqrt-PCR. El ARN total se extrajo de células usando el reactivo Trizol (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), y transcripción inversa en ADNc por transcriptasa inversa Superscript II de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cantidades iguales de cDNA a partir de estas dos muestras se amplificaron con los siguientes cebadores específicos: ZEB1 (Sentido 5 'AAGAAAGTGTTACAGATGCAGCTG-3', 5'-antisentido CCCTGGTAACACTGTCTGGTC-3 '); y ZEB2 (Sense 5'-ATACCAGCGGAAACAAGGATTTCA-3 ', 5'-antisentido CAGGAATCGGAGTCTGTCAAGTCA-3'). El número de ciclos de PCR fue 35. Cada ciclo consistió en paso de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, etapa de hibridación del cebador a 65 ° C durante 30 s y etapa de extensión a 72 ° C durante 45 s. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio.
13. Los análisis estadísticos
Los datos se expresan como la media ± error estándar de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las diferencias entre grupos se analizaron con el software SAM versión 3.0 utilizando de Student de doble cara
t-test
cuando sólo dos grupos estaban presentes, y la hipótesis nula fue rechazada al nivel de 0,05.
Resultados
1. Los tejidos y la preparación de células de cultivo
NL tejidos obtenidos a partir del grupo de control eran de color rojo brillante y se muestran las superficies lisas (Figura 1A-i). Cuando estos hígados se cortaron en secciones delgadas, tejido hepático completamente normal fue revelado (Figura 1A-ii). A H & amp; E tinción, se observaron los lóbulos del hígado para estar en buenas condiciones (Figura 1 A-III). CEN pequeños fueron seleccionados por centrifugación de Percoll discontinuo gradiente (PDGC) y cultivadas. CEN formó clones después de aproximadamente 8 días de cultivo (Figura 1A-IV). Después de cultivar durante 15 días, estas pequeñas células cubiertas aproximadamente el 65% de la placa (Figura 1A-v). Después de 25 días, estas células homogéneas casi totalmente cubiertas las placas (Figura 1 A-VI).
(Ai) Morfología de hígados en el grupo tratado no DEN, (A-II) secciones finas cortadas revelan completamente tejido normal del hígado, (a-III) Las características histológicas de hígado normal con una estructura regular. CEN cultivo primario de (A-iv) 4 días, (A-V) 15 días y 25 días (A-VI). El panel medio: la segregación de tejido HCC primaria y cultivo celular. (Bi) múltiples nódulos HCC primarios en el hígado de la rata, una de las cuales está indicada por una flecha, (B-ii) nódulos metastásicos HCC en los pulmones de ratas, que se indican por las flechas, (B-iii) características histológicas de tejido HCC metastásico , en la que los lóbulos pulmonares normales fueron reemplazados por masas de carcinoma; Las células primarias cultivadas para HCC (B-iv) 4 días, (B-V) 15 días y 30 días (B-VI). Panel inferior: el aislamiento de las diferentes subpoblaciones. (C-i) Sin verapamilo: SP células fueron mostrados como un porcentaje de los CEN; (C-II) con verapamilo: el perfil de células SP disminuyó en gran medida. (C-III) Sin verapamilo: células SP se muestra con baja fluorescencia en los HCC; (C-iv) con verapamilo: fluorescencia de la fracción de células SP desplaza a un nivel más alto. (C-v) Los porcentajes de células SP en diferentes grupos se reflejan en un gráfico de columnas. Aumento original, 200 × (A, B-III), 100 × (A, B-iv, v, vi).
Los tumores pequeños se encontraron por primera vez en ratas se sacrificó 8 semanas después de la inducción DEN. Después de otros 10 semanas, dos tercios de los hígados contenían tejidos tumorales con superficies rugosas (Figura 1B-i). También encontramos numerosos nódulos metastásicos de cáncer en los pulmones (Figura 1 B-II). Tres patólogos diferentes evaluaron la H & amp; E tinción y verificaron que estos tumores eran todos de origen hepático (Figura 1B-iii). Las células aisladas de los tejidos HCC primarios crecieron lentamente al principio con sólo unos pocos clones formados (Figura 1B-IV). Después de 15 días, las células proliferaron rápidamente y se cubren 60% de cada placa (Figura 1B-v). Un mes más tarde, estas células cubren totalmente las placas (Figura 1 B-VI).
2. Aislamiento de células SP por FACS
En el grupo de los CEN, el porcentaje de células SP era 4,300% ± 0,011% (Figura 1C-i). Cuando la exclusión del colorante fue inhibida por verapamilo en el grupo de control, células SP fueron casi idénticos al resto de las células (Figura 1C-II). El porcentaje de células SP en el grupo de los HCC era 2,100% ± 0,010% (Figura 1C-iii). Cuando la exclusión del colorante fue inhibida por verapamil, estas células SP también podrían no ser discriminados de sus controles (Figura 1C-IV). El perfil de las células SP en CEN fue significativamente mayor que en los HCC (
P
& lt; 0,05). (Figura 1C-v)
3. Autorrenovación de las células SP
Dos características estándar son características de las células madre: la auto-renovación y multipotencia. Para auto-renovación, SP-HCC proliferó el más rápido entre 7 días de cultivo, seguido por SP-CEN, SSP-HCC, SSP-CEN y NSP-HCC (que proliferó de manera similar), y, por último, el NSP-CEN (Figura 2A ). En términos generales, las células SP proliferaron mucho más rápido que las dos células y células de NSP (SSP
P Hotel & lt; 0,01), y los HCC proliferaron un poco más rápido que los CEN. Debido a que el número inicial de cada población celular fue el mismo, totalmente diferentes números de células estaban presentes en cada grupo al final del periodo de cultivo (Figura 2B). células SP (Figura 2B-i, iv) se encontró que eran más homogénea y mucho más pequeño en tamaño que tanto las células de NSP (Figura 2B-ii, v) y las células de SSP (Figura 2B-iii, vi) (
P
& lt; 0,01). Sin embargo, no se observaron diferencias morfológicas significativas entre SP-CEN (Figura 2B-i) y SP-HCC (Figura 2B-iv). Por lo tanto, estas dos poblaciones no podían ser discriminados unos de otros en un microscopio invertido. Curva
(A) El crecimiento de las células durante 7 días de cultivo. (B) Después de la amplificación, se observaron densidades celulares distintas en las diferentes subpoblaciones. (C) La expresión de marcadores de células madre (CD133) y EpCAM fue diferente en cada subpoblación recién aisladas y amplificadas por FACS. (D) Los datos exactos se reflejan en un gráfico de columnas. CD133 /EpCAM-Fresh indica la expresión de CD133 /EpCAM en subpoblaciones recién aisladas, y CD133 /EpCAM-amplificado significa la expresión de CD133 /EpCAM en subpoblaciones amplificados. Aumento original, 100 × (B).
En el comienzo de la cultura, tanto SP-CEN y SP-HCC expresaron más de los marcadores de células madre que NSP-NSP-CEN y los HCC, respectivamente (
P
& lt; 0,01) (Figura 2C). Se observaron los siguientes porcentajes de células positivas de cada subpoblación: porcentajes CD133 en el SP-CEN, NSP-CEN, SSP-CEN, SP-HCC, NSP-HCC y SSP-HCC fueron 81,2 ± 7,08, 11,4 ± 1,31, 30,3 ± 3,21 , 86,7 ± 8,32, 12,7 ± 1,39 y 31,6 ± 3,42, respectivamente; porcentajes EpCAM en estas subpoblaciones fueron 80,1 ± 8,10, 10,6 ± 1,21, 31,2 ± 3,18, 86,5 ± 3,28, 12,4 ± 1,31 y 32,6 ± 3,67, respectivamente. Al final del periodo de cultivo, SP-CEN y SP-HCC todavía expresaron más de los marcadores de células madre que NSP-CEN y NSP-HCC, respectivamente (
P
& lt; 0,01) (Figura 2D). Además, la expresión de marcadores de células madre disminuyó mucho más lentamente en células SP que en ambas células de SSP y células de NSP (
P
& lt; 0,01). Se observaron los siguientes porcentajes: porcentajes CD133 en el SP-CEN, NSP-CEN, SSP-CEN, SP-HCC, NSP-HCC y SSP-HCC fueron 78,6 ± 6,98, 3,4 ± 0,33, 20,2 ± 2,03, 80,5 ± 7,86, 3,6 ± 0,30 y 20,7 ± 2,38, respectivamente; porcentajes EpCAM en estas subpoblaciones fueron 78,1 ± 7,53, 0,28 ± 3,5, 21,5 ± 2,17, 80,3 ± 8,12, 2,3 ± 0,27 y 20,2 ± 2,28, respectivamente. Durante el período de proliferación, tanto SP-CEN y SP-HCC mantienen la alta expresión de marcadores de células madre; Por el contrario, tanto NSP-CEN y NSP-HCC perdieron gradualmente la expresión de los marcadores de células madre. Estos datos sugieren que las células SP son similares a las células en su capacidad de auto-renovación del tallo.
4. La diferenciación de las células SP inducidas por HGF in vitro
En condiciones de inducción, cada subpoblación genera excrecencias distintas. Debido a que los CEN deben diferenciarse en hepatocitos o células epiteliales biliares, seleccionamos un marcador madura hepática (ALB) y un marcador biliar (CK-7) para identificar células maduras. La mayoría de los SP-CEN expandido en láminas de células muy juntas que muestran la morfología típica de los hepatocitos y se identificaron como células positivas ALB (66,9 ± 5,34%). Una parte de la SP-CEN diferenciarse en células CK-7 positivos (24,6 ± 2,41%) (Figura 3A). Aunque tanto NSP-CEN y SSP-CEN también podrían generar ALB células positivas, solamente varios-7 CK células positivas se podrían encontrar en inducida SSP-CEN, y hay 7 CK-células positivas fueron encontrados en inducida NSP-CEN (Figura 3A) . Estos datos indican que sólo SP-CEN tenía un fuerte potencial de diferenciarse en diferentes tipos de células maduras. Western Blot demostró que a pesar de las células generadas por NSP-CEN expresaron mayor ALB que las células de los CEN-SP y SSP-CEN, hijas de SP-CEN expresaron niveles mucho más altos de CK-7 de las hijas de la SSP-CEN y NSP CEN (Figura 3C). En particular, la CK-7 muestra casi ninguna expresión en las hijas de NSP-CEN (Figura 3C). Estos datos fueron concordantes con las observaciones de FI.
(A) A través de SI, las células positivas ALB (verde, núcleos en azul) y 7 CK-células positivas (verde, núcleos en azul) se produjeron diferencialmente por SP- CEN, NSP-CEN y SSP-CEN. Los porcentajes de ALB o 7 CK-células positivas se muestran en un gráfico de columnas. (B) En contraste, las células positivas para AFP pudo encontrar después SP-HCC, NSP-HCC y la inducción SSP-HCC. Los datos se resumen en un gráfico de columnas. (C) por el Western Blot, pliegue diferencias en los marcadores específicos relativos a GAPDH fueron analizados en inducida por SP-CEN, NSP-CEN y SSP-CEN.