Extracto
Antecedentes
Las proteínas y anticuerpos matrices han emergido como una tecnología prometedora para estudiar la expresión de proteínas y función de las proteínas en una forma de alto rendimiento. Estas matrices también representan una nueva oportunidad para perfilar los niveles de expresión de proteínas en muestras de pacientes con cáncer e identificar las firmas biológicas útiles para el diagnóstico clínico, la clasificación de enfermedades, predicción, el desarrollo de medicamentos y atención al paciente. Se aplicaron los arrays de anticuerpos para descubrir un grupo de proteínas que pueden servir como biomarcadores para distinguir entre pacientes con cáncer de ovario y los controles normales.
Metodología /Principales conclusiones
El uso de un diseño de estudio de casos y controles de 34 pacientes con cáncer de ovario y 53 controles sanos emparejados por edad, que perfilan los niveles de expresión de 174 proteínas utilizando tecnología de matriz de anticuerpos y se determinó el nivel de CA125 usando ELISA. Los niveles de expresión de estas proteínas se analizaron mediante 3 métodos discriminantes, incluyendo la red neuronal artificial, árbol de clasificación y análisis de calificación de punto de división. Un panel de 5 marcadores de proteínas de suero (MSP-alfa, TIMP-4, PDGF-R alfa, y OPG y CA125) fue identificado, que podría detectar con eficacia el cáncer de ovario con alta especificidad (95%) y una alta sensibilidad (100%), con AUC = 0,98, mientras que el CA125 solo tenía una AUC de 0,87.
Conclusiones /Importancia
Nuestro estudio piloto ha mostrado el conjunto prometedor de 5 marcadores séricos para la detección del cáncer de ovario.
Visto: Jiang W, R Huang, Duan C, Fu L, Xi Y, Yang Y, et al. (2013) Identificación de los cinco marcadores de proteínas de suero para detección de cáncer de ovario por el anticuerpo matrices. PLoS ONE 8 (10): e76795. doi: 10.1371 /journal.pone.0076795
Editor: Rakesh K. Srivastava, la universidad del centro médico de Kansas, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Abril, 2013; Aceptado: 28 Agosto 2013; Publicado: 8 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado en parte por el descubrimiento de biomarcadores RayBiotech subvención piloto. Los autores desean expresar su agradecimiento por el apoyo del proyecto científico líder de Guangzhou distrito de desarrollo económico (2009L-P180); Programa de cientos de líderes innovadores y empresarios (LCY201111); Guangdong programa de investigación innovadora equipo (201001s0104659419), y ayudas a la investigación del distrito de desarrollo económico de Guangzhou (2010Q-P450). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Weidong Jiang, Huang Ruochun y Ruo-Pan Huang son empleados de RayBiotech, Inc. , que desarrolla y comercializa tecnologías y productos de matriz de proteínas. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de ovario representa el tercer cáncer más frecuente y es una de las principales causas de cáncer muerte entre las mujeres en los Estados Unidos y Europa [1-3]. La mayoría de los síntomas del cáncer de ovario son vagos y similares a los que a menudo experimentan con las condiciones de salud más comunes, no amenazan la vida; estos pueden incluir hinchazón abdominal o hinchazón, dolor pélvico o malestar, dolor de espalda baja, pérdida del apetito o la sensación de saciedad rápida, indigestión persistente, gas o las náuseas y los cambios en los hábitos intestinales o de la vejiga. Como resultado, casi el 80% de los pacientes con cáncer de ovario se diagnostican en etapas posteriores. Por desgracia, la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con cáncer de ovario avanzado clínicamente es sólo el 15% al 20%, en fuerte contraste con una tasa de supervivencia a 5 años de más del 90% de los pacientes con enfermedad en estadio I. Por lo tanto, es urgente descubrir y desarrollar biomarcadores para la detección del cáncer de ovario y la detección temprana.
En la actualidad, CA-125 y la imagen son los 2 enfoques más comunes para las pruebas de detección del cáncer de ovario. Sin embargo, estos 2 marcadores, ya sea utilizado solo o en combinación, no son de detección útil o propósitos de diagnóstico debido a la baja especificidad y /o sensibilidad. Por ejemplo, el suero CA-125 ha demostrado tener una sensibilidad de & gt;. 98% pero una especificidad de sólo el 50-60% para la enfermedad en estadio temprano [4-6]
Se han reportado múltiples estudios para identificar biomarcadores séricos de cáncer de ovario usando la tecnología de multiplexación matriz de anticuerpos [7-9]. El grupo del Dr. Lokshin identificado un grupo de marcadores de proteínas 6 en suero, incluyendo la interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), proteína quimioatrayente de monocitos -1 (MCP-1), y CA-125, que muestra una diferencia significativa en las concentraciones en suero entre los grupos de cáncer de ovario y de control con una sensibilidad del 84% a 95% de especificidad [7]. El grupo del Dr. Gil Mor identificado un panel de 6 biomarcadores, CA-125, osteopontina (OPN), factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF-II), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), la leptina y la prolactina, que demostró una sensibilidad de 95,3 % y una especificidad del 99,4% para la detección de cáncer [8] de ovario. El uso de arrays de anticuerpos basados en biotina humanos, hemos examinado los perfiles de expresión sérica de 507 proteínas en muestras de suero de 47 pacientes con cáncer de ovario, 33 pacientes con masas ováricas benignas y 39 controles sanos, emparejados por edad y identificado diferencias significativas en la expresión de proteínas entre individuos normales controles y los pacientes con cáncer de ovario (
P Hotel & lt; 0,05). Por análisis de clasificación y análisis de calificación de punto de división de estos 2 grupos, un panel de 6 marcador de proteínas, que consistía en la interleucina-2 receptor alfa (IL2Rα), endotelina, osteoprotegerina (OPG), factor de crecimiento D endotelial vascular (VEGF-D ) y betacelulina (BTC), se puede utilizar para distinguir a los pacientes con cáncer de ovario de sujetos normales [9]. Estos estudios sugieren fuertemente que la tecnología de matriz de anticuerpos ha demostrado una gran promesa en el descubrimiento y desarrollo de perfiles de biomarcadores de cáncer de ovario en suero y fuertemente sugieren que los grupos de citocinas en suero pueden ser útiles como biomarcadores para la detección precoz de los cánceres de ovario.
En este estudio, hemos utilizado nuestra 174-marcador, paneles matriz de anticuerpos de pantalla de muestras de suero de 34 pacientes con cáncer de ovario y 53 sujetos sanos normales con el fin de identificar un panel de marcadores de proteína de suero para la detección del cáncer de ovario ELISA sandwich-based.
resultados
Validación de 174 marcadores de citoquinas matrices semi-cuantitativos (Figuras 1, 2)
Panel a (izquierda) muestra una fuerte correlación intra-ensayo (misma muestra ensayada en el mismo portaobjetos de vidrio , probado en el mismo día); Grupo B (medio) muestra una fuerte correlación entre ensayos (misma muestra ensayada en diferentes láminas de vidrio, probado en diferentes días); Panel C (derecha) muestra pobre correlación entre el cáncer y muestras normales ensayadas en los mismos portaobjetos de vidrio, probado en el mismo día
Panel A (izquierda) muestra imágenes de señal fluorescentes representativos de matriz G6.; Grupo B (medio) muestra imágenes de señales fluorescentes representativos de matriz G7; Grupo C (derecha) muestra imágenes de señales fluorescentes representativos de matriz G-8.
En este estudio, hemos aplicado la tecnología de matriz de anticuerpos para determinar los perfiles de expresión de citoquinas 174 en el suero de pacientes con cáncer de ovario y la edad emparejados controles normales sanos. Las citoquinas en este estudio incluyen citocinas antiinflamatorias, citocinas proinflamatorias, factores de crecimiento, factores angiogénicos o citocinas quimiotácticas, entre otros. Algunas de estas citoquinas según los informes, están alterados en los pacientes con cáncer de ovario de nuestros propios estudios y la literatura, pero nuestra amplia pantalla de 174 proteínas también incluye muchos otros tipos de marcadores como parte de un enfoque "imparcial" de la utilización de alto contenido de citoquinas de alto rendimiento arrays de anticuerpos en el perfil de los niveles de citoquinas en suero de pacientes con cáncer de ovario 'con el objetivo de identificar potenciales biomarcadores de diagnóstico.
en primer lugar, se determinó además la reproducibilidad del ensayo en el análisis de suero humano utilizando el análisis de dispersión de las parcelas. reproducibilidad intra-tobogán para los arrays basados en vidrio de deslizamiento se evaluó mediante el ensayo replicar alícuotas de las mismas muestras con dos sub-series impresas en el mismo portaobjetos y se ensayaron al mismo tiempo. La reproducibilidad entre diapositivas se determinó utilizando dos diferentes diapositivas impresas con las mismas matrices se analizaron utilizando alícuotas duplicadas de las mismas muestras en dos días diferentes. Los coeficientes de correlación de Pearson para intra-diapositiva y diapositiva entre reproducibilidad fueron 0,923 (
P Hotel & lt; 0,001) y 0,899 (
P Hotel & lt; 0,001), respectivamente, lo que sugiere una alta reproducibilidad del ensayo. Por el contrario, el coeficiente de correlación de Pearson para el cáncer frente a las muestras normales fueron 0,226 (
P Hotel & lt; 0,005)., Lo que sugiere que las muestras de cáncer y muestras normales son de dos poblaciones diferentes
A continuación, suero de un total de 34 pacientes con cáncer de ovario y 53 controles sanos se analizaron los niveles de expresión de citoquinas 174 con el objetivo de descubrir nuevos marcadores de diagnóstico para el cáncer de ovario. Estas muestras de suero se obtuvieron principalmente de nuestros colaboradores y fueron edad y sexo emparejado (Tabla 1). El anticuerpo humano de citoquinas Las matrices se utiliza para perfilar los patrones de expresión de citoquinas en 174 muestras de suero de los 87 pacientes. La intensidad de la señal es proporcional al nivel de expresión de una proteína individual en cada muestra. El conjunto de datos se normalizaron luego en base a la intensidad de la señal de control positivo promedio de cada matriz. Las intensidades de señal medianas de cada lugar fueron corregidos para el fondo local. Para establecer un umbral de señal, intensidad de la señal de valor de corte se determina por +/- 2 DE de 10 tampón intensidades de señal de control en blanco, donde las matrices fueron incubar con tampón de bloqueo en lugar de las muestras de suero del paciente. Cualquier valores que exceden el umbral de señal fueron consideradas como señales reales (es decir, una detección positiva de la citoquina). Los valores más bajos de la señal de corte se le asigna un valor de 1. Si se miden los valores de intensidad de señal de todas las muestras de una citoquina particular, fueron 1, esas citoquinas fueron retirados de la lista para su posterior análisis.
Cáncer de ovario
control sano
Número total
3453Mean Age61.751.2Median Age6656.2Age Range26-7928-79
cáncer Propriedades
Histología
seroso Adenoocarcinoma29Mucous Adenocarcinoma4Germline tumor1
etapa
fase III I4Stage II3Stage & amp; 1. IV25NA2Table características de la población de estudio.
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Identificación de marcadores de proteínas de suero de análisis de red neuronal artificial (Figura 3)
3a. El análisis de redes neuronales artificiales de 174 marcadores resultados de la matriz de anticuerpos que comparan los cánceres de ovario y controles sanos. Las muestras que representan tanto el conjunto de entrenamiento y el conjunto de predicción se representan en el gráfico.
3b. Se presentan los 8 mejores marcadores de mayor impacto en el análisis de redes neuronales artificiales de arrays de anticuerpos de 174 marcadores en los cánceres de ovario y controles sanos.
Después de la normalización y la filtración, los datos fueron sometidos a neuronal artificial red (ANN) análisis. Los datos de intensidad de la señal para los pacientes individuales fueron divididos al azar en el conjunto de entrenamiento (N = 51) o el conjunto de predicción (N = 36). En fase de descubrimiento de predicción, el conjunto de entrenamiento se analizó utilizando la licencia-un enfoque de validación cruzada. A través de este análisis, se identificaron un total de 8 predictores. Estos 8 predictores fueron utilizados para predecir el estado de la enfermedad en el conjunto de predicción. El acuerdo correcta del estado de la enfermedad predicho mediante el panel de 8-marcador con diagnóstico clínico en el conjunto de entrenamiento y la predicción conjunto fue del 82% y 80%, respectivamente.
Identificación de panel 5-marcador para la detección de cáncer de ovario (Figuras 4 y 5)
Panel A (arriba a la izquierda): histograma de puntos con 5-analito de punto de división clasificación de puntuación de los sueros de controles sanos (N) y el cáncer de ovario (CA). Clasificado correctamente las muestras de suero normales deberían tener una puntuación de 0 a 2, mientras que las muestras de pacientes con cáncer de ovario deben tener una puntuación de 3 a 5; Grupo B (arriba a la derecha): La curva ROC para el panel 5-marcador de análisis de fracciones de puntuación de cáncer de ovario frente a controles sanos. La República de China es la curva trazada de la sensibilidad (verdaderos positivos) en contra de los valores de 1-especificidad (falsos positivos); Grupo C (abajo a la derecha): Tabla utilizando cinco marcador de puntuación del punto de división para clasificar a los pacientes con cáncer de ovario. Se utilizó un punto de corte de 3.
A continuación, de estos 8 marcadores, se optó por 4, macrófagos estimulante de la proteína alfa (MSP-alfa), el inhibidor tisular de las metaloproteinasas-4 (TIMP-4 ), derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento alfa (PDGF-R alfa), y la osteoprotegerina (OPG), para el análisis de agrupamiento jerárquico usando el software SPSS. Uso del panel de los 4 marcadores anteriormente, el 83% de las muestras se identificaron correctamente (95% de los controles sanos y el 62% de los cánceres de ovario).
Por último, todas las 87 muestras fueron analizadas por los 4 marcadores séricos más arriba identificados CA125 utilizando el análisis de la puntuación del punto de división. Utilizando el punto de corte de 3, cáncer de ovario 100% y el 95% de muestras de control sanos fueron identificados correctamente, dando el acuerdo correcta total de 96,6%.
Desde el CA125 es el marcador más ampliamente utilizado para el cáncer de ovario, se compararon el AUC entre CA125 sola a la de nuestro panel 5-marcador, como se determina por las curvas ROC. CA125 el único que tiene una AUC de 0,87. Por otro lado, nuestro recién identificado panel 5-marcador tiene un AUC de 0,98. Por lo tanto, nuestro estudio piloto ha identificado un conjunto prometedor de 5 marcadores séricos para la detección precoz del cáncer de ovario.
Validación del panel 5-marcador para la detección de cáncer de ovario con el ensayo ELISA (Figura 6)
Los niveles de dos marcadores de proteínas (MSP-alfa y TIMP-4) identificados como diferencialmente expresado en las muestras de cáncer de ovario utilizando arrays de anticuerpos fueron confirmados con ELISA. Los datos de la matriz de anticuerpos fueron completamente concordantes con los datos de ELISA en la clasificación de los sueros de pacientes con cáncer de ovario y controles sanos. datos de la matriz de anticuerpos se muestran como la intensidad de señal de la serie mediana (FI), y los datos de ELISA se muestran como la media de concentración de proteínas (ng /ml).
Para confirmar la detección múltiple de la matriz de datos, se realizó solo objetivo ensayos ELISA para medir cuantitativamente los niveles de expresión de estas citoquinas individualmente, y estos resultados se compararon con los datos de la matriz. Los niveles relativos de expresión para las proteínas medidos por la matriz y ELISA fueron similares (ver Figura 6). Los 4 marcadores (MSP-alfa, TIMP-4, R-PDGF alfa, y OPG) identificadas por el análisis y la fracción de punto de análisis de calificación ANN se confirmaron mediante kits de ELISA. La Figura 6 muestra los datos representativos de los dos de estos marcadores, MSP-α y TIMP-4.
Discusión
CA125 es uno de los biomarcadores más importantes para el cáncer de ovario. A menudo se utiliza de manera efectiva para el control de la respuesta al tratamiento y la detección de la recurrencia del cáncer de ovario. Sin embargo, CA125 por sí sola no es un marcador de diagnóstico útil para la aplicación clínica debido a su baja especificidad; con un valor de corte de referencia de 35 UI /ml, CA125 mostró especificidad limitada de 50-60% con la sensibilidad de & gt; 98% para la enfermedad en estadio temprano [4-6]. La elevación de CA125 es detectable en aproximadamente 0,2 a 5,9% mujeres sanos y 2.2-27.8% de los pacientes con enfermedades benignas de ovario [10]. se observó la elevación de CA125 en sólo el 50% de la etapa I pacientes con cáncer de ovario y aumentó a 90% o superior en la etapa III y IV pacientes cáncer de ovario [11].
Debido a la complejidad y la heterogeneidad de cáncer de ovario, es poco probable que un único biomarcador será capaz de detectar todos los subtipos y las etapas de la enfermedad con una alta especificidad y sensibilidad. Mediante la búsqueda en la literatura y otra fuente, los Dres. Polanski y Anderson tienen compilar una lista de 1261 proteínas que se cree están expresados diferencialmente en el cáncer humano [12]. Entre ellos, 260 biomarcadores candidatos son considerados como "de alta prioridad", ya que han sido implicados como posibles marcadores de cáncer en múltiples publicaciones en la literatura y porque la mayoría de ellos se han notificado a ser detectable en el suero o plasma. Se incluyeron muchos de estos biomarcadores en nuestra detección de biomarcadores basados en anticuerpos.
Las citoquinas son un grupo diverso de proteínas compuestas de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, interferones, adipoquinas y linfoquinas y juegan muchos papeles críticos de fisiológicos y patológicos procesos. También es bien conocido que las citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, factores de angiogénesis, proteasas, factores apoptóticos, receptores, moléculas de adhesión y adipoquinas desempeñan papeles importantes en el desarrollo del cáncer, la progresión y la metástasis. La creciente evidencia sugiere que una compleja red de citoquinas está implicada en el cáncer de ovario. Un número de bucles de citoquinas autocrinos y paracrinos han sido identificados en el cáncer de ovario y de influir en la biología de este tumor. La detección de los patrones de expresión de múltiples citoquinas puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología del cáncer, identificar nuevas dianas moleculares para el tratamiento del cáncer y descubrir nuevos biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad [13,14].
En este estudio, tenemos demostrado la eficacia de la detección de una matriz de anticuerpos semi-cuantitativa, basada en sándwich de la detección de un panel de 174 marcadores en el suero de 34 pacientes con cáncer de ovario y 53 controles sanos emparejados por edad para identificar un panel de marcadores de proteínas 5 de suero, incluyendo CA125, que puede detectar con eficacia el cáncer de ovario con alta especificidad (95%) y una alta sensibilidad (100%) con AUC de 0,98. Estos marcadores fueron validados con el ensayo ELISA.
Hemos observado que el CA125 solo tiene una AUC de 0,87, por el contrario, nuestra recién identificado panel 5-marcador tiene una AUC de 0,98, lo que indica una mayor eficiencia cuando la detección de CA125 se combina con otros 4 biomarcadores de proteínas putativas para la detección de cáncer de ovario (TIMP-4, OPG, PDGF-R alfa, y MSP-alfa).
TIMP-4 pertenece a la metaloproteinasa de matriz (MMP) superfamilia. MMPs son elementos esenciales en la matriz extraceullular degradación (ECM), incluyendo la regulación de la liberación de citoquinas con destino a ECM y factores de crecimiento, que conduce a la angiogénesis, la invasión celular y, con el tiempo en muchos tipos de cáncer, la metástasis. Estas MMPs están estrechamente controlados y regulados por varios TIMPs, varios de los cuales parecen jugar un papel crítico en la tumorigénesis. Laboratorio de Chegini ha informado elevada expresión de TIMP-4 en tejidos de cáncer de ovario mediante el análisis IHC, lo que indica su posible papel en la tumorigénesis del cáncer de ovario [15].
OPG pertenece a la superfamilia de TNF y puede ser ligado al factor nuclear potenciador de la cadena ligera kappa de células activadas B (NFkB) y de necrosis tumoral apoptosis relacionado con el factor ligando inductor (TRAIL) vías de señalización. OPG se identificó por primera vez por su capacidad para regular la homeostasis de la remodelación ósea. Sin embargo, el laboratorio de Piche informó que OPG puede servir como tal factor de supervivencia mediante la protección de la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de ovario, lo que indica su papel potencial en el desarrollo y progresión de cáncer de ovario [16].
PDGF-R alfa es un receptor en la superfamilia de PDGF. Sirviendo como factores de crecimiento angiogénicos, PDGF desempeñan un papel importante en el crecimiento celular, la quimiotaxis, la angiogénesis y, en el contexto del cáncer, la reconstrucción de los microambientes del estroma tumoral. Lab de Jakobsen informó de que PDGF-R alfa mostró una mayor expresión en tejidos de cáncer de ovario en comparación con tejidos normales adyacentes [17]. También se informó que el PDGF-R alfa se expresa con más frecuencia en los carcinomas serosos que en endometriod y los tumores mucinosos [18], lo cual es consistente con los hallazgos de nuestro estudio, en el que la mayoría de los tumores ensayados (29 de 34) fueron serosa .
MSP es un factor de crecimiento implicados en la activación de los macrófagos estimulante de los receptores-1 (MSTR1). La cadena alfa de MSP (MSP-alfa) es secretada por la escisión de pro-MSP. Existen informes que muestran que la vía de MSP juega un papel importante en la metástasis del tumor [19].
En resumen, el uso de 174-marcador de la tecnología de matriz de anticuerpos de citoquinas, hemos identificado un panel de marcadores de proteínas de suero 5 que puede detectar de ovario cáncer tanto con una alta especificidad y alta sensibilidad, lo que indica su aplicación prometedora en la medicina personalizada para la detección del cáncer de ovario. Además, teniendo en cuenta que una muestra relativamente pequeña (N & lt; 100) utilizado en esta investigación logra una sensibilidad extremadamente alta (100%) y relativamente alta especificidad (95%), ofrecemos un poco de esperanza de que la validación del panel de múltiples biomarcadores puede ser algún día útil para la detección de un cáncer mortal que rara vez se diagnostica en sus primeras etapas.
las proteínas y anticuerpos matrices han emergido como una tecnología prometedora para estudiar la expresión de proteínas y función de las proteínas en un alto rendimiento manera. Estos arrays de proteínas y anticuerpos presentan una nueva oportunidad para perfilar los niveles de expresión de proteínas en muestras de pacientes con cáncer e identificar las firmas biológicas útiles para el desarrollo de medicamentos y atención al paciente. Nuestro panel 5-marcador podría distinguir efectivamente cánceres de ovario de controles sanos Estos 5 marcadores individuales no son exclusivos de los cánceres de ovario, como se muestra por su expresión en otros tipos de cáncer, incluyendo cánceres de mama [18-22], los cánceres de pulmón [23], colorrectal tipos de cáncer [24], los cánceres de próstata [25,26], carcinomas hepatocelulares [27], los cánceres de páncreas [28], etc. Por lo tanto, será muy importante y interesante investigar si esta combinación de 5-marcadores puede detectar otros tipos de cáncer así como. Dos de los componentes más importantes en el programa de descubrimiento de biomarcadores son de alta calidad de las muestras de los pacientes y tecnologías de alto contenido de detección y de alto rendimiento. Por lo tanto, la combinación de la tecnología probada y plataformas de nosotros y bien caracterizados muestras de pre-diagnóstico de PLCO en el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de detección basado en anticuerpos proporcionará una oportunidad única para el descubrimiento y validación de biomarcadores [29,30]. Estas investigaciones no sólo servirán para validar el panel de biomarcadores específicos identificados en este estudio; que le ayudará a validar el uso de arrays de anticuerpos como un enfoque de alto throuput para identificar biomarcadores de cáncer para el cribado de la enfermedad y la detección.
Materiales y Métodos
Este protocolo ha sido aprobado por la revisión institucional de ley tablero. IRB ID: 3303. La junta de revisión independiente es el servicio de ley, Inc. ubicada en 6300 Powers Ferry Road, Suite 600 a 351, Atlanta, GA 30339. Se obtuvo consentimiento escrito en la recogida de muestras de los pacientes y controles sanos
ética Declaración
se obtuvo el consentimiento por escrito en la recogida de muestras de los pacientes y controles sanos.
recogida de muestras
Las muestras de suero de 34 pacientes con diagnóstico de estadio temprano (I y II) o de la última etapa (III y IV) los cánceres de ovario y 53 controles sanos emparejados por edad incluidos en el estudio fueron recogidos desde el hospital afiliado, la Universidad Sun Yat-sen. En pocas palabras, se señaló a aproximadamente 2 ml de sangre venosa de los pacientes. Se recogió el suero y se almacenó a -80 ° C hasta que se necesite. Información sobre el diagnóstico de cáncer de ovario, puesta en escena, la histología, grado y edad estaba disponible para nosotros, pero los identificadores de los pacientes únicos, tales como nombre, dirección, fecha de nacimiento, no se proporcionó.
array Antibody Technology
arrays de anticuerpos basados en sándwich semi-cuantitativos (RayBio
® matriz de citoquinas humana G-Series 2000) se desarrolló como 3 matrices distintas (G6 humano citoquinas matrices, G7 y G8), cada uno representando un conjunto único de 54 60 anticuerpos específicos de antígeno para detectar un total de 174 marcadores séricos en una matriz de portaobjetos de vidrio. Se requiere un par de anticuerpos para detectar cada analito. Los portaobjetos de vidrio se imprimen como 4 u 8 sub-series idénticas que consisten en puntos de cada anticuerpo Apture-antígeno específico de dicho array. Los anticuerpos de detección correspondientes fueron marcados con biotina y se combinan como un solo reactivo cóctel para su uso posterior. diapositivas impresas fueron colocados en conjuntos de cámara para permitir la incubación de cada sub-matriz con una muestra diferente. Después de bloquear cada sub-matriz con un tampón de bloqueo, subarreglos se incubaron con las muestras de suero. Después de un lavado extensivo para eliminar la unión no específica, el cóctel de anticuerpos de detección biotinilados se añadieron a las matrices. Después de un extenso lavado, las diapositivas de matriz se incubaron con una fluor conjugada con estreptavidina (HiLyte Fluor ™ 532, de Anaspec, Fremont, CA). Las señales fluorescentes se visualizaron después usando el sistema de escáner basado en láser (GenePix 4200A, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) utilizando el canal verde. Para aumentar la precisión, dos réplicas por anticuerpos fueron vistos, y las medias de las intensidades de señal promedio para los dos puntos (menos sustracción de fondo locales) se utilizaron para todos los cálculos. A través de estas mejoras, podemos obtener un coeficiente de variación (CV) de alrededor de 10% utilizando nuestra plataforma portaobjetos de vidrio.
análisis ELISA
ELISA se realizó de acuerdo con el manual de RayBio® ELISA (RayBiotech , Inc., Norcross, GA, EE.UU.). En breve, pre-recubiertas de 96 pocillos placas de ELISA con anticuerpos capturados se bloquearon primero usando un tampón de bloqueo. partes alícuotas duplicadas (100 microlitros por pocillo) de suero diluido y múltiples diluciones (es decir, concentraciones) de proteína estándar se cargaron en la placa de ELISA. Las placas se incubaron después durante 2 h a temperatura ambiente (RT). los materiales no unidos se lavaron y se añadió anticuerpo de detección anti-citoquina biotinilado a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 h a TA. Después del lavado, se añadieron 100 microlitros de reactivo HRP conjugada con estreptavidina a los pocillos, y la placa se incubó durante 30 minutos a TA. Después de un extenso lavado, el desarrollo del color se llevó a cabo por incubación con sustrato HRP. Después de la adición de solución de parada, se determinó la densidad óptica (DO) a 450 nm para cada pocillo utilizando un lector de microplacas, y las concentraciones de las muestras se determinó por comparación de las curvas de concentración estándar.
Análisis
Datos
se utilizó una prueba t ajustada para probar la significación entre los niveles de expresión de proteínas en el cáncer de ovario y muestras de control sanas.
P
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
Para determinar el umbral de la señal, las señales de las matrices se midieron en ausencia de muestras (utilizando buffer como solución neutra de bloqueo) y repetido 10 veces. Las señales generadas utilizando los espacios en blanco se promediaron y se calculó la desviación estándar (SD). Las señales con valores inferiores a la señal en blanco promedio + 2xSD se consideraron como fondo.
Los datos fueron también analizados utilizando redes neuronales. Esta poderosa herramienta permite la encontramos perfiles de expresión de proteínas común para predecir el cáncer. En un estudio de fase, el 80% de las muestras fueron asignados aleatoriamente al conjunto de entrenamiento y el 20% restante de las muestras se utilizaron como prueba de conjunto. La ventaja de este enfoque es el éxito de la predicción será más preciso con el tiempo, a medida que se disponga de más datos.
Los datos también se analizaron por análisis de puntuación del punto de división. El punto de división divide el espacio en dos intervalos de muestra, uno para el cáncer de ovario y otro para los controles normales. La mejor puntuación del punto de división de cada marcador fue elegido para garantizar la reducción al mínimo de las muestras mal clasificadas. Para cada marcador, una puntuación de 0 fue asignado a una muestra si cayera en el intervalo de control normal para ese marcador; una puntuación de 1 se asigna a una muestra si cayera en el intervalo de cáncer de ovario. En general, un individuo se le asignó una puntuación como la suma de estas puntuaciones asignadas para
N
diferentes marcadores. Por lo tanto, la gama de tales cosas estaban entre 0 a
N
. Un umbral dado (
T
) fue elegido para el cáncer de ovario de forma óptima independiente de controles sanos, es decir, un individuo dado con una puntuación total & lt;
T
se predice que tienen el estado normal, mientras que un individuo con una puntuación total de & gt;.
T
fue diagnosticado como cáncer de ovario
a partir de los datos anteriores, se calculó la especificidad, sensibilidad, valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN) . La República de China también se determinó.
Reconocimientos
Agradecemos a Brett Burkholder para un debate constructivo y la edición de este documento.