Extracto
Pescadillo es una proteína nucleolar que se ha sugerido que participan en el desarrollo embrionario y la biogénesis de ribosomas. La expresión desregulada de pescadillo humana (PES1) fue descrito en algunos tumores, pero sus funciones precisas en la tumorigénesis sigue sin estar clara. En este estudio, se generaron tres anticuerpos monoclonales que reconocen PES1 con alta especificidad y sensibilidad, con el que se analizó la expresión PES1 en el cáncer de colon humano por inmunohistoquímica. Fuera de 265 tejidos de cáncer de colon, 89 (33,6%) mostraron expresión positiva PES1, que fue significativamente mayor que en los tejidos no cancerosos (P & lt; 0,001). El silenciamiento de PES1 en células de cáncer de colon dio lugar a disminución de la proliferación, crecimiento de xenoinjertos, y la detención del ciclo celular en la fase G1 reducida, indicando las funciones PES1 como un oncogén. A continuación, explorar el mecanismo por el que la expresión PES1 se controla en cánceres de colon humano y demostró que c-Jun, pero no JunB, Jund, c-Fos, o mutante c-Jun, regulado positivamente la actividad promotora de la transcripción PES1. Además, estudiamos -274 /-264 región del promotor PES1 como la secuencia de unión de c-Jun, el cual fue validado por inmunoprecipitación de la cromatina y ensayos de movilidad electroforética. Por otra parte, hemos demostrado una correlación positiva entre c-jun y la expresión PES1 en células de cáncer de colon y los tejidos de cáncer de colon. Aguas arriba de c-Jun, se reveló que el c-jun quinasas NH2-terminal (JNK) es esencial para controlar la expresión PES1. Nuestro estudio, en primer lugar, descubre el papel oncogénico de PES1 en el cáncer de colon y aclara el mecanismo molecular que dirige la expresión PES1
Visto:. Xie W, Q Feng, Su Y, Dong B, Wu J, Meng L, et al. (2012) La regulación transcripcional de la expresión PES1 por c-Jun en el cáncer de colon. PLoS ONE 7 (7): e42253. doi: 10.1371 /journal.pone.0042253
Editor: Antonio Moschetta, Universidad de Bari & amp; Consorzio Mario Negri Sud, Italia |
Recibido: 20 de enero de 2012; Aceptado: July 5, 2012; Publicado: July 30, 2012
Copyright: © Xie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional 973 de China (2009CB521805) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81172367). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Pescadillo
codifica una proteína nucleolar con varios motivos, entre ellos un dominio C-terminal de BRCA1 (BRCT), grupos de ácidos dominios amino ácidos, varias señales de localización nuclear, y un sitio conservado de Sumoylation [1]. Se identificó inicialmente como un gen esencial para el desarrollo embrionario de pez cebra [2]. Los estudios posteriores encontraron que pescadillo fue altamente conservadas de la levadura a humanos [1], [3] - [5]. ortólogo humano de Pescadillo (PES1) forma un complejo estable con Bop1 y WDR12 (complejo PeBoW), que es crucial para la localización nucleolar y su función en el procesamiento de rRNA [6] - [8]. BRCT-elimina o forma -mutated de PES1 es menos estable y no puede ser incorporado en el complejo PeBoW [9]. Otra B23 proteína nucleolar interacciona físicamente con PES1 y está implicado en el control de la localización nucleolar Pes1 [10]. Pescadillo se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en el desarrollo normal embrionario, la biogénesis de ribosomas, la replicación del ADN, la estabilidad cromosómica, y la progresión del ciclo celular. La interrupción de pescadillo o sus ortólogos en la levadura, zebrefish, y el ratón deteriora el desarrollo embrionario [2], [3], [11], [12]. PES1 juega un papel crítico en el procesamiento de pre-rRNA y 60S maduración subunidad ribosómica, a través de la formación del complejo PeBoW [3], [7], [9], [13]. Además, desmontables de PES1 induce la detención del ciclo celular y disminución de la fosforilación de la proteína retinoblastoma (Rb) [14]. Por otra parte, se ha demostrado PES1 de unirse al ADN directamente y para regular la transcripción de genes [15], lo que sugiere que PES1 es una proteína multifuncional que contribuye a diversos procesos biológicos.
Recientemente, se encontró expresión desregulada de PES1 estar asociado con el desarrollo del cáncer [1], [16] - [18]. PES1 se reguló de manera anormal en glioblastomas humanos adultos [1], la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas (HNSCCs) [19], y el cáncer gástrico [20]. PES1 expresión también fue significativamente mayor en las células del cáncer de mama y tejidos, tanto en los niveles de proteína [21] y el ARNm, y posiblemente fue controlada por los estrógenos [22]. Además, PES1 se ha relacionado con la inestabilidad cromosómica [18], [23] y la transformación de células de mamífero [16]. A pesar de estos hallazgos, se sabe poco sobre el papel preciso de PES1 en la tumorigénesis y los factores que dirigen la expresión PES1 no se habían determinado.
En el presente estudio, hemos demostrado una alta expresión de PES1 en tejidos de cáncer de colon. Se encontró que PES1 juega un papel oncogénico en la promoción de la proliferación de células de cáncer de colon y la formación de tumores en el modelo de ratones desnudos. factor de transcripción c-Jun aumenta la expresión PES1 mediante la unión a la región promotora de PES1 y la correlación positiva entre la c-Jun y la expresión PES1 es evidente en las células de cáncer de colon y los tejidos.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
la colección de muestras de tejido fue aprobado y supervisado por el Comité de ética de Investigación de la Universidad de Pekín hospital Cancer & amp; Instituto. Consentimiento informado por escrito se obtuvieron de todos los pacientes antes de la operación. Los estudios en animales, incluyendo la generación de anticuerpos y modelo de tumor de xenoinjerto, fueron aprobados y supervisados por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad de Pekín Hospital Cancer & amp; Instituto.
Materiales
Los plásmidos de expresión de c-Jun, JunB, Jund y c-Fos fueron amablemente proporcionados por el Dr. Liu Zhihua (Peking Union Medical College, China). El doble mutante de c-Jun-S63A /S73A fue un regalo del Dr. Dirk Bohmann (Universidad de Rochester Medical Center). plásmidos pGL3-Basic y PRL-SV40 se adquirieron de Promega (Madison, WI, EE.UU.). Los anticuerpos contra c-Jun (H-79, SC-1694) y c-Fos (SC-52) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra JunB (D253, BS1196) y Jund (V249, BS1198) eran de Bioworld Tecnología (St. Louis Park, MN, EE.UU.). Anticuerpo contra JNK1 (ab27709) fue de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). Anti-β-actina fue adquirido de California Bioscience (Coachella, CA, EE.UU.). Anti-GAPDH fue de Proteintech (Chicago, IL, EE.UU.). inhibidores de la quinasa U0126 y LY294002 se adquirieron de Cell Signaling (Danvers, MA, EE.UU.). SP600125 se adquirió de Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.).
Generación de anticuerpo monoclonal
Los hibridomas que secretan anticuerpos anti-PES1 se generaron de acuerdo con un protocolo estándar. En resumen, cinco ratones Balb /c hembras (comprados desde el Centro de Animales de la Academia China de Ciencias Médicas) fueron inmunizados con la proteína GST-PES1 recombinante (50 mg por ratón) emulsionada en adyuvante de Freund (Sigma) cuatro veces a intervalos de 3 semanas. En el día 4 después de la inmunización final, se extirpó el bazo a partir de uno ratones inmunizados y las células se fusionaron con células Sp2 /0 de mieloma, utilizando 50% (v /v) de polietilenglicol 4000 (Merck, Darmstadt, Alemania). Los hibridomas se cultivaron en medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina, Sigma) de selección. Después de 14 días, los sobrenadantes se cosecharon y se seleccionaron para la presencia de anticuerpos monoclonales específicos anti-PES1 (mAbs) por ELISA. Los hibridomas estables se expandieron y los anticuerpos monoclonales se purificaron mediante perlas de proteína A /acoplados a G Sepharose (Invitrogen) de cromatografía.
Cultivo de células y transfección
HCT116, células SW480, RKO, y eran AGS obtenido a partir de la colección americana de cultivos tipo (ATCC). Las células se mantuvieron en DMEM o medio RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en un 5% CO
2 medio ambiente. Para la transfección, las células se sembraron en placas de cultivo, que se cultiva a 50 hasta 80% de confluencia y se transfectaron con plásmidos o siRNA utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En el ADN plásmido de la transfección, se utilizó 1,6 g de ADN por pocillo de placa de cultivo de 12 pocillos. En siRNA transfección, se utilizó 50 siRNA pmol por pocillo para placa de cultivo de 12 pocillos. Después de la transfección, se incubaron las células durante otra 48-72 hr antes de ser cosechadas para el ensayo de luciferasa o pruebas de la expresión génica. Alternativamente, después de la transfección durante 48 horas, las células se trataron con los inhibidores de la quinasa indicado para otro 36 hr. secuencias de siRNA se utilizan para reducir la expresión de c-Jun y JNK1 fueron los siguientes: siRNA-c-Jun, GCAAAGAUGGAAACGACCUUCUAUGTT; siRNA-JNK, AAAGAAUGUCCUACCUUCUTT.
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron en un tampón RIPA modificado que contiene Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Na mM 1
3VO4, NaF 20 mM, 1% NP-40, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,1% SDS y 1 × cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Mannhelm, Alemania). Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear con 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2 hr a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a seguido de incubación con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano 4 ° C (Jackson, West Grove, PA). Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando detección de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). densidades ópticas relativas de las bandas de proteínas a la de control de carga (GAPDH) se cuantificaron por el software Scion Image.
inmunohistoquímico análisis
Para la tinción inmunohistoquímica, todas las muestras clínicas fueron fijadas en recién preparada neutra al 10% formalina tamponada, embebidos en parafina, y se corta en 5 micras secciones. Después de cocción a 60 ° C durante la noche, las secciones fueron desparafinados y rehidratada. A partir de entonces, retrievaling antígeno se llevó a cabo a través de la cocción de alta presión en EDTA (pH 8,0, Zymed). la actividad de peroxidasa endógena se bloqueó mediante incubación en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min a temperatura ambiente. Después de bloquear con 5% de leche sin grasa, las secciones se incubaron con mAb específico PES1 3B1 (1:500) a 4 ° C durante la noche seguido por incubación con anticuerpo secundario del kit EnvisionTM (Dako Cytomation, Cambridge, Reino Unido) durante 45 min a temperatura ambiente. El producto de reacción se visualizó con diaminobencidina (DAB, Sigma) durante 5 min a temperatura ambiente y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. IgG purificada a partir de suero de ratón normal se utilizó como control negativo. Los resultados fueron evaluados de forma independiente por dos patólogos (Q.F. y B. D.). La muestra con células inmunotinción más del 20% se clasificó como el caso positivo.
La inhibición de PES1 de interferencia por ARN
Para golpear de forma estable por la expresión endógena PES1, utilizamos el embalaje lentivirus vector de expresión de shRNA ( comprado a GenePharma, Shanghai, china) para infectar las células. Las células diana se infectan con lentivirus para 24 a 48 hr de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARNi oligonucleótidos de secuencia utilizada para derribar la expresión endógena PES1 es el siguiente: PES1-RNAi-1, GGAACACTGTAGAGCGTTTAA; y PES1-RNAi-2, GAAGATGCAGAGGCTGGTTCA.
Ensayo de proliferación
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad inicial de 1,0 × 10
3 por pocillo. En cada punto de tiempo, las células fueron teñidas con MTT estéril (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio, 0,5 mg /ml, Sigma) durante 4 horas a 37 ° C, seguido de la eliminación del medio de cultivo y la adición de 150 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO). La absorbancia se midió utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 490 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
ensayos de formación de colonias
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (1 x 10
3 células por pocillo) y se cultivaron durante dos semanas. Las colonias se tiñeron con 0,5% de cristal violeta durante 30 minutos después de la fijación con metanol durante 30 min a temperatura ambiente.
ciclo celular análisis
Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces con hielo frío PBS y se fijaron en etanol 75% (en PBS) a 4 ° C durante la noche. Después de lavar dos veces con PBS frío, las células se resuspendieron en PBS que contenía 0,1 mg /ml de RNasa (Sigma). Después de 30 min a 37 ° C, las células se resuspendieron en PBS que contenía 50 mg /ml de yoduro de propidio (PI) y luego se analizaron con un citómetro de flujo (BD, CALIBUR). La distribución del ciclo celular se calculó utilizando la célula de software Quest y Mod-ajuste.
xenoinjertos de tumores ensayo
nu /nu hembra (de Vital River Laboratories, Pekín, China) entre 7 y 8 semanas se utilizaron para
in vivo
estudios. Cada grupo experimental consistió de 4-5 ratones desnudos. 4 × 10
6 células en 100 l de PBS se inyectaron por vía subcutánea en la axila de ratones desnudos. Después de 22 días, los ratones fueron escarificada y los tumores fueron retirados y ponderados. Los datos mostrados son medias ± SD de los ratones en cada grupo.
microarrays de expresión génica
ARN fue extraído de las células con reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el proveedor. los perfiles de expresión de genes en células HCT116 y control silenciados-PES1 fueron examinadas usando Agilent Genoma Humano Microarray CGH 44K. Después de la normalización, se calculó la expresión factor de cambio. Un valor de p inferior a 0,05 y el factor de cambio umbral del 2 fueron elegidos para identificar las alteraciones de la transcripción estadísticamente significativas.
luciferasa ensayo
Para analizar la actividad del promotor de PES1, región 5'-acompañamiento más 172 pb de la secuencia transcrita PES1 se generó por PCR usando los siguientes cebadores: adelante, 5'-CCGCTCGAGCTGGCATTATCCTGGAGTCAC-3 '(sitio XhoI subrayado), inversa, 5'-CCCAAGCTTGAAAAGAGTCGACCCCATGC-3' (sitio HindIII subrayado). El fragmento amplificado a partir del ADN genómico de las células HCT116 se insertó en pGL3-basic plásmido vector, y el plásmido resultante se denominó como pGLB-PES1 (-2060 /+ 172). Los plásmidos informadores luciferasa, pGLB-PES1 (-1413 /+ 172), pGLB-PES1 (-902 /+ 172), pGLBPES11 (-416 /+ 172), pGLB-PES1 (-315 /+ 172), pGLB-PES1 (-282 /+ 172), pGLB-PES1 (-274 /+ 172), pGLB-PES1 (-264 /+ 172), pGLB-PES1 (-254 /+ 172) y pGLB-PES1 (-75 /+ 172 ) se generaron a partir pGLB-PES1 (-2060 /+ 172). pGLB-PES1-promotor o 5 'de deleción constructos se cotransfectaron con pRL-SV40 en las células. Después de la transfección durante 72 horas, se recogieron las células en tampón de lisis pasiva (Promega) y los lisados celulares se analizó la actividad de luciferasa con el sistema Dual Luciferase reportero de ensayo (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad de luciferasa se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla.
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP)
Las células se fijaron con 1% de formaldehído durante 10 min a 37 ° C, seguido de lavado dos veces con PBS enfriado en hielo y se recogieron por raspado. Después de la centrifugación, los sedimentos celulares se lisaron en 400 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 1% de SDS, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, 1 × inhibidores de la proteasa cóctel). Las muestras se incubaron en hielo durante 10 min y se sonicaron cuatro veces durante 15 segundos cada vez a intervalos de 15 segundos para obtener fragmentos de cromatina de alrededor de 200 a 1000 nucleótidos pb. Las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm, 4 ° C durante 10 min. Después de la eliminación de una parte alícuota de control (se diluyó 20 l de sobrenadantes en 80 l de tampón de dilución y se almacenaron a -20 ° C), los sobrenadantes se diluyeron con 9 volúmenes de tampón de dilución de chip (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, EDTA 2 mM, 1% NP-40, PMSF 1 mM, 1 × inhibidores de la proteasa cóctel). Las muestras se preincubaron con proteína /G cuentas A Plus DNA de esperma de salmón 10 g a 4 ° C durante 2 horas, y después se centrifugaron a 1000 rpm, 4 ° C durante 2 min. Los sobrenadantes se incubaron a 4 ° C durante la noche con anticuerpo o IgG 0,2 g c-Jun-específico que había sido preincubado con proteína /G cuentas A y ADN de esperma de salmón 10 mg. A continuación, las perlas se lavaron con TSE I (0,1% de SDS, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% NP-40), TSE II (0,1% de SDS, 1% NP-40, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 500 mM), TSE III (mM Tris-HCl, pH 8,0, LiCl 250 mM, EDTA 1 mM, 1% NP-40, 1% de desoxicolato) buffers 10 en a su vez por una vez, seguido de lavado dos veces con tampón TE (pH 8,0). Después del lavado final, los inmunoprecipitados se eluyeron y revertir reticulado por incubación durante la noche a 65 ° C en tampón de elución (1% SDS, 100 mM NaHCO
3). a continuación, el ADN se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen, Hilden, Alemania). ADN eluido se amplificó por PCR con cebadores que abarcan el sitio de unión de c-Jun promotor PES1. El ADN de entrada y chip de ADN cromosómico con no específica IgG fueron sometidos a la misma amplificación PCR. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 2% que contiene bromuro de etidio y se detectaron mediante iluminación ultravioleta. Los siguientes cebadores fueron utilizados para la PCR. primers específicos para la unión de c-Jun (Primer-S, 139 bp fragmento, -363 a -225 región del promotor PES1), cebador directo, CTTGACAACGCAATCCTATCG; cebador inverso, CCTGATGACGATTCATTGACTGT; y los cebadores de control negativo (Primer-N, 110 bp fragmento, -1,473 a -1,364 región del promotor PES1), cebador directo, CAACTAGCTGGGGTTACAGG; Cebador inverso, GAGATCAGGAGTTTGAGAC. Se utilizaron los siguientes anticuerpos:. policlonales de conejo anti-c-Jun (H-79, Santa Cruz) y IgG de conejo normal (Santa cruz): perfil
ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA): perfil
Las células se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo y se recogieron por raspado. Después de la centrifugación, los sedimentos celulares se resuspendieron en 160 l enfriado en hielo tampón A (Hepes 10 mM, KCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0,5 mM) y se incubaron en hielo durante 20 min. Y luego otros 40 l de tampón A que contiene 2,5% de NP-40 se añadió a la muestra con agitación intermitente durante 10 s. Después de la centrifugación 12.000 rpm a 4 ° C durante 5 min, los pellets celulares se resuspendieron en 40 enfriado con hielo tampón B l (Hepes 20 mM, KCl 400 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM) y se colocaron en hielo con agitación intermitente durante 25 min. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Los sobrenadantes que contienen proteína nuclear se almacenaron a -70 ° C. Los ensayos de unión se realizaron incubando 8 g de proteína nuclear en el tampón de unión (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, KCl 50 mM, DTT 1 mM, 10 g de salmón de ADN de esperma) con 30 fmol oligonucleótidos marcados con biotina en un volumen final de 20 l durante 20 min a temperatura ambiente. Para que la competencia en frío, se añadió un pliegue exceso de los oligonucleótidos no marcados 1000 a la unión de reacción 20 min antes de la adición de los oligonucleótidos marcados. Para los ensayos de supershift, 0,1 mg de anticuerpo se incubó con mezclas de unión que contienen la sonda marcada con biotina 10 fmol durante 40 min a temperatura ambiente. complejos de ADN-proteína se separaron por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida nativo al 6% en 0,5 × TBE a 100 V durante 180 min a 4 ° C. Los geles se transfirieron a una membrana de nylon cargada positivamente. Las sondas unidas se visualizaron por conjugado HRP-estreptavidina y sustrato quimioluminiscente (Thermo quimioluminiscente kit de detección de ácido nucleico). Las sondas de oligonucleótidos utilizadas en EMSA fueron como sigue: PROBE1, CTTCCGCCCCTCTCCGTCCCAACATGCAAC (-284 /-255 secuencia de promotor PES1); Sonda-W (que contiene previamente identificados de tipo salvaje secuencias de unión a c-Jun), GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCTGACTCACCCGGGCCCGGG; Sonda-Am (que contiene secuencias de unión de AP-1 mutados), GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCGTCGGATCCCGGGCCCGGG [24]. Las sondas se sintetizaron y se marcaron con biotina por la SBS Genetech (Pekín, China). Los oligonucleótidos complementarios se hibridaron en Tris 20 mM (pH 7,6), NaCl 50 mM, MgCl 10 mM
2, y 1 mM de DTT.
inversa en tiempo real de reacción en cadena de polimerasa de transcripción
ARN celular total se extrajo de las células con el reactivo TRIzol (Invitrogen) y transcripción inversa en ADNc usando ImProm-II ™ Reverse Transcription System (Promega). La PCR cuantitativa se llevó a cabo con el sistema de PCR en tiempo real ABI StepOne (Applied Biosystems) utilizando SYBR Green PCR Master Mix en tiempo real (TOYOBO, Osaka, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. la expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2
-ΔΔCt siguiendo las instrucciones del fabricante. limpieza de genes gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH)
se utilizó como control interno para normalizar
PES1
la expresión del ARNm. Se utilizaron los siguientes cebadores:
PES1
, CCCAAGCAGAGGCAAAGG hacia adelante, CTGACATCTCCCCATCGG inversa;
c-Jun
, delantero CGCCCCTGTCCCCCATCG, invierta TGTGCCACCTGTTCCCTG;
GAPDH
, CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG adelante, marcha atrás CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG. Los cebadores de RT-PCR cuantitativa para la validación de los resultados de microarrays se enumeran en la Tabla S1.
El análisis estadístico
El análisis de datos se realizó con el programa SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). A-muestra independiente de dos colas
se utilizó t
prueba para determinar la significación de las diferencias entre los diferentes grupos experimentales. La correlación de c-Jun y PES1 en tejidos de cáncer de colon se analizó mediante el coeficiente de correlación de Pearson con el software SPSS. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P & lt; 0,05
Resultados
PES1 se sobreexpresa en el cáncer de colon
En primer lugar nos generamos tres anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen PES1 humana.. A través de ELISA y análisis de transferencia Western, se mostró que estos tres mAbs de unirse específicamente a la proteína GST-PES1, pero no a GST (Fig. S1A y S1B). Además, estos mAbs pudieron reconocer PES1 endógeno en ensayo de transferencia Western (Fig. S1C). A continuación, se confirmó la especificidad del anticuerpo monoclonal 3B1 mediante el análisis de los lisados de células totales de control y células de cáncer gástrico AGS transfectadas con shRNA PES1. Una banda de proteína correspondiente al tamaño molecular esperado Pes1 (69 kDa) se realizó ablación por un corto horquilla RNA (shRNA) contra PES1 (Fig. S1D). Además, hemos demostrado que el mAb 3B1 se podría utilizar en ELISA, Western blot y análisis de inmunocitoquímica con mayor sensibilidad y de afinidad, en comparación con un anticuerpo comercial (Fig. S1E-G).
Para examinar la expresión de PES1 en tejidos de cáncer de colon, se realizó un análisis de los tejidos immunohistochemistical cáncer de colon humano e igualó los tejidos adyacentes con el mAb 3B1. Como se muestra en la Figura 1A y 1B, PES1 exhibió una fuerte tinción nuclear (núcleos marrón) en las células cancerosas y los ganglios linfáticos, respectivamente. De los 265 tejidos de cáncer de colon, 89 (33,6%) fueron positivos para la expresión PES1, mientras que sólo el 2,7% (7/265) de los tejidos adyacentes mostró tinción PES1 (Fig. 1E). La diferencia de expresión PES1 entre los tejidos de cáncer de colon y los tejidos no cancerosos fue significativa (P & lt; 0,001). Además, 20/40 (50%) de los ganglios linfáticos mostró tinción positiva PES1, también significativamente mayor (P & lt; 0,001) que en los tejidos no cancerosos. Por lo tanto, estos resultados indican expresión PES1 fue hasta reguladas en tejidos de cáncer de colon humano.
El análisis inmunohistoquímico de la expresión PES1 en tejidos de cáncer de colon humano. Las figuras muestran la tinción fuertemente núcleos de PES1 en tejidos de cáncer de colon (A) y ganglios linfáticos (B). tinción negativa de PES1 en los tejidos no cancerosos adyacentes al tumor se muestra en (C). IgG de ratón normal se utilizó como control negativo en tejidos de cáncer de colon y se muestra en (D). se muestran Representante baja (× 100) y alta (x400) de aumento. (E) Resumen de expresión PES1 en tejidos de cáncer de colon humano, los tejidos adyacentes emparejados, y los ganglios linfáticos. a indica una diferencia significativa entre el cáncer de colon en comparación con tejido adyacente emparejado. b indica una diferencia significativa entre los ganglios linfáticos en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes.
PES1 promueve la proliferación de células de cáncer de colon y el crecimiento
in vitro
y
in vivo
Para investigar la función biológica de PES1 en la patogénesis de cáncer de colon, lentiviral mediada ablación estable de PES1 se realizó en HCT116, RKO, y las células de cáncer de colon SW480 con dos pares de shRNAs. Tanto shRNA silenciada efectivamente la expresión de PES1 endógena en estas líneas celulares (Fig. 2A). Los ensayos in vitro revelaron que el agotamiento de Pes1 endógeno resultó en inhibiciones significativa de la proliferación celular (Fig. 2B) y la formación de colonias (Fig. 2C). Análisis del ciclo celular demostró, además, que las células tienden a acumularse en la fase G1, pero menos en la fase S, en PES1 ablación (Fig. 2D), indicativo de arresto G1 /S. Sin embargo, no se encontró diferencia significativa en los niveles estables de células apoptóticas entre el control shRNA y las células transfectadas con shRNAs PES1-específicos (datos no mostrados). Además, se inocularon el HCT116 ablación-PES1 y células RKO en ratones desnudos para examinar el efecto de PES1 en la formación de tumores de xenoinjerto. Como se muestra en la Fig. 2E, el silenciamiento de PES1 inhibió el crecimiento del tumor
in vivo
.
(A) Western blot para la proteína PES1 en HCT116, RKO, y las células SW480 transducidas con shRNA-control y PES1 shRNA construye ( PES1-shRNA-1 y PES1-shRNA-2), respectivamente. curvas (B) crecimiento de las células transducidas con indicados PES1 shRNAs, como se examinó mediante ensayo de MTT. Los valores presentados representan las medias ± SD de tres experimentos independientes. (C) El silenciamiento de PES1 disminución de la formación de colonias. Las fotografías demuestran resultados de ensayo de colonias de formación de las células en la placa (panel izquierdo). Los números de colonias relativos (panel derecho) se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes. (D) El silenciamiento de PES1 dio lugar a la detención del ciclo celular. La cuantificación de la distribución del ciclo celular se deriva de tres experimentos independientes. Los valores representan las medias ± SD. (E) Silenciamiento de Pes1 endógeno inhibe el crecimiento del tumor de HCT116 y células RKO en ratones desnudos. El panel derecho muestra el peso del tumor del shRNA-control y shRNA-1. Los valores presentados representan las medias ± SD.
Para conocer mejor las funciones biológicas de PES1, se realizó un análisis de microarrays con células HCT116 PES1 silenciados de forma estable y control de las células. Los genes con el mismo patrón de cambios en ambas células transfectadas con shRNA-2 shRNA-1 y fueron recogidos. Se identificaron un total de 633 genes que se expresa de forma diferente (ya sea aumento o disminución de 2 veces) en PES1 silenciamiento, incluyendo 305 hasta regulados y 328 genes regulados. bioinformatical análisis se llevó a cabo para identificar las vías afectadas por la ablación PES1 con la herramienta de Gene ontología análisis (Fig. S2A). Estas vías se clasifican de acuerdo con el significado (valores de p). Consistente con los resultados del análisis funcional, los genes relacionados con el control de la proliferación celular constituyen la categoría principal afectada por PES1 ablación (Fig. S2A). A continuación, examinó la expresión de cuatro genes regulados (
BCL2
,
FGF9
,
SATB1
, y
AVP
) y cuatro genes regulados (
ID3
,
MSX2
,
gdf11
, y
Smad3
) por RT-PCR cuantitativa en células HCT116 y SW480, y se confirmaron los resultados el análisis de microarrays (Fig. S2 B).
PES1 expresión está regulada por c-Jun en las células de cáncer de colon
Nos estábamos interesados para averiguar el factor (s) que controla la sobreexpresión PES1 en tejidos de cáncer de colon . Los datos preliminares sugirieron que había un mayor nivel de expresión PES1 mRNA en tejidos de cáncer de colon que en los tejidos adyacentes de los partidos, pero no metilación desregulado se encontró en la región promotora del gen PES1 (datos no mostrados). Además, se identificaron los sitios de unión múltiple potencial factor de transcripción dentro de promotor PES1, incluyendo activador de la proteína-1 (AP-1) sitios de unión. Para entender mejor la regulación transcripcional de PES1, 2060 pb de la secuencia flanqueante 5 'del gen PES1 y 172 pb de la secuencia transcrita fueron clonados a partir de células HCT116 y se subclonaron en pGLB plásmido indicador de luciferasa. A continuación se investigó si la AP-1 podría regular la transcripción PES1. El factor de transcripción AP-1 se compone de varios componentes, tales como c-Jun, JunB, Jund y c-Fos, que forman homo- o hetero-dímero para unir las secuencias promotoras de genes aguas abajo [25]. La regulación de estas AP-1 subunidades de promotor PES1 se examinó mediante ensayo indicador de luciferasa. El pGLB-PES1-promotor (-2060 /+ 172) fue co-transfectadas con c-Jun, JunB, Jund o c-Fos en células HCT116 y SW480, cuya expresión fue validado por Western blot (Fig. 3A). la actividad del promotor PES1 se incrementó en gran medida por c-Jun, pero mínimamente por otras subunidades (Fig. 3B). También hemos probado los efectos sinérgicos de c-Jun y c-Fos en la actividad promotora PES1. Con este fin, pGLB-PES1-promotor (-2060 /+ 172) fue co-transfectadas con c-Jun además de c-Fos. La actividad de la luciferasa inducida por la co-transfección con c-Jun además de c-Fos no se incrementó de manera significativa e incluso inferior a la de c-Jun sola (Fig. 3B), sugiriendo que la heterodimerización entre c-Jun y c-Fos es inadecuada para fomentar la actividad del promotor de PES1. La fosforilación de la serina-63 y la serina-73 en el NH
2-terminal de dominio de transactivación de c-Jun por JNK (c-Jun NH
quinasas 2-terminales) es esencial para la actividad transcripcional de c-Jun [ ,,,0],26]. Nos dimos cuenta de que la sustitución de estos residuos de serina con alaninas (c-Jun-S63A /S73A) con deficiencias en gran medida la fosforilación (Fig. 3C) y la actividad del promotor PES1 (Fig. 3D), lo que sugiere que la fosforilación de c-Jun es esencial para la activación de PES1 expresión.
(a) Western blot para detectar la ectópico c-jun, JunB, Jund y c-Fos en las células HCT116 y SW480. GAPDH se muestra como control de carga. (B) ensayo de indicador de luciferasa en células de cáncer de colon. pGLB-PES1-promotor (-2060 /+ 172) fue co-transfectadas con plásmidos indicados en las células SW480 HCT116and. la actividad relativa de luciferasa se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. El vector vacío se utilizó como control y la actividad de luciferasa relativa se establece en 1. (C) Expresión de tipo salvaje y c-Jun-S63A /S73A en células HCT116 y SW480. También se detectó la fosforilación de c-jun. (D) pGLB-PES1-promotor (-2060 /+ 172) fue co-transfectadas con c-Jun o c-Jun-S63A /S73A en células HCT116 y SW480, entonces el ensayo de indicador se realizó como en (B).
c-Jun a regular la actividad del promotor PES1 uniéndose directamente a PES1 promotor
para asignar el sitio de unión de c-Jun en el promotor PES1, se generaron una serie de mutantes de deleción 5 ' y se analizaron mediante co-transfección con c-jun. En comparación con la región -2060 /+ 172, más la eliminación,
es decir
-1413 /+ 172, -902 /+ 172, -416 /+ 172, -315 /+ 172, -282 /+ 172, y -274 /+ 172, no marcadamente cambiar la actividad de reportero, pero aún más a la supresión del -274 -264 causó una reducción de ~ 80% en la actividad de la luciferasa (Fig. 4A). Mientras tanto, se analizaron los mutantes de supresión en ausencia de exógenos c-Jun, y también se encontró que la deleción -274 a -264 marcadamente redujo la actividad de reportero (Fig. 4A) .Estas datos sugieren -274 /-264 es un potencial c -jun secuencia de unión en el promotor PES1. A continuación llevó a cabo el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para corroborar c-Jun de unión al promotor PES1. Como se muestra en la Fig.