Extracto
La comprensión de las bases moleculares de la quimio-resistencia es vital para diseñar terapias para restaurar la quimiosensibilidad . En particular, metadherin (MTDH) se ha demostrado que tiene un papel crítico en la quimiorresistencia. La sobreexpresión de la MTDH se correlaciona con un mal resultado clínico en cáncer de mama, neuroblastoma, carcinoma hepatocelular y cáncer de próstata. MTDH también es altamente expresado en el cáncer de endometrio avanzado, una enfermedad para la que se necesitan con urgencia nuevas terapias. En el presente estudio, nos hemos centrado en el beneficio terapéutico de agotamiento MTDH en células de cáncer de endometrio para restaurar la sensibilidad a la muerte celular. Las células fueron tratadas con una combinación de factor de necrosis tumoral-α-relacionados ligando inductor de apoptosis (TRAIL), que promueve la muerte de las células malignas del aparato reproductor humano, y los inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC), que se ha demostrado para aumentar la sensibilidad la apoptosis de las células cancerosas para inducida por TRAIL. Nuestros datos indican que el agotamiento de MTDH en células de cáncer de endometrio dio lugar a la sensibilización de las células que eran previamente resistente en respuesta al tratamiento con TRAIL combinatoria y la LBH589 inhibidor de HDAC. knockdown MTDH redujo la proporción de células en S y el aumento de la detención celular en G2 /M en las células tratadas con LBH589 solo o LBH589 en combinación con TRAIL, lo que sugiere que las funciones de MTDH en el puesto de control del ciclo celular para lograr resistencia. El uso de la tecnología de microarrays, hemos identificado 57 genes diana aguas abajo de MTDH, incluyendo calbindina 1 y galectina-1, lo que puede contribuir a la resistencia terapéutica MTDH mediada. Por otra parte, en células MTDH agotado, la inhibición de PDK1 y la fosforilación de AKT, junto con el aumento de expresión Bim y la degradación de XIAP correlacionado con una mayor sensibilidad a la muerte celular en respuesta a TRAIL y LBH589. Estos hallazgos indican que la orientación o el ozono es un MTDH potencialmente nueva vía para revertir la resistencia terapéutica en pacientes con cáncer de endometrio
Visto:. Meng X, Brachova P, S Yang, Xiong Z, Zhang Y, Thiel KW, et Alabama. (2011) Derribo de MTDH sensibiliza a las células del cáncer endometrial a la celda inducción de muerte por muerte ligando del receptor de TRAIL y del inhibidor de HDAC LBH589 co-tratamiento. PLoS ONE 6 (6): e20920. doi: 10.1371 /journal.pone.0020920
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 22, 2010; Aceptado: 16-may de 2011; Publicado: June 8, 2011
Derechos de Autor © 2011 Meng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) de subvención R01CA99908 al KKL, y en parte por el Departamento de Obstetricia y Ginecología Fondo de Desarrollo de la Investigación, la Investigación Institucional número de concesión GRI-77-004-31 de la Sociedad Americana del cáncer para XM, administrado a través del Centro de cáncer Integral de Holden en la Universidad de Iowa. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
un problema común con la terapia del cáncer es el desarrollo de resistencia, y una mejor comprensión de las vías subyacentes involucrados con resistencia a los medicamentos podría conducir al desarrollo de nuevas estrategias para superar esta resistencia. Un gen recientemente descubierto, metadherin (MTDH, también conocido como AEG-1 o LYRIC) ha surgido como un mediador potencialmente crucial de la progresión tumoral, metástasis y resistencia a quimioterapias [1], [2], [3], [4] . Se propone MTDH para promover la progresión tumoral a través de la integración de múltiples vías de señalización incluidos ras, myc, Wnt, PI3K /Akt y NF-kB en diversos tipos de células de cáncer [4], [5], [6], [7] , aunque el mecanismo por el cual MTDH controla estos eventos de señalización no está claro. En este estudio, se investigó el papel de MTDH en el cáncer de endometrio y su inhibición como un mecanismo para superar la resistencia a los medicamentos.
El interés inicial en MTDH como un factor en la quimio-resistencia surgió como consecuencia de NCI60 datos de farmacogenómica, que encontró que la copia genómica número ganancia de 8q22 es un acontecimiento decisivo en la quimio-resistencia [8]. Un estudio anterior informó que la metástasis de los ganglios linfáticos se asocia significativamente con aumentos del número de copias en 8q22-q23 en los cánceres de endometrio [9]. Hasta el momento, MTDH es el único gen conocido en 8q22 que se ha demostrado que se correlaciona con pobres resultados clínicos en pacientes con tumores sólidos [8].
in vitro
y
in vivo
quimio-resistencia análisis confirmó que MTDH caída sensibiliza a varios tipos de tumores - incluyendo cáncer de mama, carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata, y neuroblastoma- a múltiples agentes de quimioterapia como 5- fluorouracilo (5-FU), cisplatino, paclitaxel y doxorrubicina [1], [10], [11]. Sin embargo, la capacidad de derribo MTDH para sensibilizar a las células para terapias dirigidas, que han llegado a simbolizar el futuro de la terapéutica del cáncer, aún no ha sido explorado.
Relacionados con -α
El factor de necrosis tumoral (TNF) inductor de apoptosis ligando (TRAIL) surgió recientemente como una estrategia terapéutica prometedora apuntado en varios tipos de cánceres debido a sus características pro-apoptóticos [12], [13]. Como miembro de la familia de TNF, TRAIL activa específicamente las vías de apoptosis en células de cáncer extrínsecos al unirse a los receptores de muerte. Es importante destacar que, TRAIL promueve selectivamente la apoptosis de las células tumorales, pero no tiene efecto sobre las células del tracto reproductivo humanos normales, incluyendo aquellos en el endometrio, ovario, cuello del útero, trompas de Falopio o [13]. Algunas células cancerosas son resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL [14], [15], [16], por lo tanto, los regímenes de combinatorias se han adoptado para restaurar la sensibilidad a [13], [17]. En varios estudios, inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC) se han demostrado para aumentar aún más la sensibilidad a la muerte celular por apoptosis inducida por TRAIL [18], [19], [20], [21]. Desgraciadamente, algunos quedan células cancerosas resistentes a TRAIL combinado y tratamiento inhibidor de HDAC [22], y los nuevos enfoques para restaurar la sensibilidad a estas terapias dirigidas son necesarios.
Se examinó el efecto de reducir los niveles MTDH en la restauración de la sensibilidad a TRAIL terapias dirigidas base. Los datos presentados en este documento demuestran que MTDH regula el ciclo celular y la supervivencia celular en respuesta al tratamiento con inhibidores de HDAC y TRAIL, lo que sugiere que MTDH es un objetivo terapéutico prometedor para aumentar la eficacia de TRAIL y el inhibidor de HDAC tratamiento combinatorio.
Resultados
MTDH expresión es elevada en líneas celulares de cáncer de endometrio y tejidos
MTDH fue altamente expresado en el nivel de proteína en las seis líneas celulares de cáncer de endometrio analizadas (RL95, AN3CA, la demandante, Ishikawa, y Hec50co ECC1, Figura 1A). En los tejidos de pacientes de cáncer de endometrio, la expresión MTDH fue elevado en comparación con endometrio normal (Figura 1 B). Específicamente, la expresión de 80 kDa y MTDH putativo 50-55 kDa isoformas MTDH fueron significativamente mayores en muestras de cáncer de endometrio incluyendo seroso papilar, sarcoma, y adenocarcinoma, mientras que MTDH era indetectable en los tejidos normales del endometrio (Figura 1B). Debido a que no MTDH se detectó en el tejido endometrial normal, borrados para el LKB1 supresor de tumor como un control (Figura 1B). El aumento de expresión de MTDH citoplásmica en el adenocarcinoma de endometrio y MTDH nuclear en algunos cáncer endometrial metastásico también se observó en los tejidos de cáncer de endometrio como se muestra en la Figura 1C por inmunohistoquímica con un anticuerpo-MTDH específico. XIAP y FLIP son dos proteínas pro-supervivencia relacionados con la vía extrínseca de apoptosis inducida por el receptor de muerte [12]. Por lo tanto, hemos examinado si existe una correlación entre la expresión de proteínas pro-supervivencia XIAP y FLIP con la expresión MTDH. Mientras que la expresión de XIAP MTDH y no se correlacionó, que se detectó una correlación con la expresión de FLIP (Figura 1B). El aumento de la expresión de MTDH en todas las células cancerosas y tejidos examinados sugiere que puede jugar un papel en la carcinogénesis endometrial
fue detectado (A) Expresión de MTDH en todas las seis líneas celulares de cáncer endometrial probados:. RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H (Ishi), KLE y Hec50 células. Se detectó (B) Expresión de MTDH en los tejidos del endometrio a partir de dos individuos normales, cuatro pacientes con papilares serosos, tres pacientes con adenocarcinoma, y dos pacientes con sarcoma endometrial. La expresión del supresor de tumores LKB1 gen y dos genes anti-apoptóticos, XIAP y FLIP, también se detectó mediante transferencia de Western en las mismas muestras. (C) la expresión MTDH se detectó mediante tinción inmunohistoquímica utilizando el espectro de la enfermedad (la progresión del cáncer de endometrio) matriz de tejido con más de 50 muestras de tejidos del endometrio de benigno a cáncer. (I) el tejido endometrial normal (ii) adenocarcinoma endometrial de bajo grado, (iii) adenocarcinoma endometrial de alto grado, y (iv) el cáncer de endometrio metastásico a la cavidad abdominal. Aumento original, × 400.
Desmontables de MTDH reduce la formación de colonias
Debido a la elevada expresión de MTDH en las diversas líneas celulares de cáncer de endometrio y muestras de cáncer de endometrio humano, el próximo examinó el potencial tumorigénico de MTDH en el tipo II línea celular de cáncer de endometrio Hec50co utilizando un ARN corto horquilla (shRNA) específico para MTDH. Una reducción 3,49 veces en la expresión de genes MTDH fue detectado por cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) en células MTDH Hec50co shRNA transfectadas en comparación con el control mezclado células transfectadas con shRNA (Tabla S1). El agotamiento de MTDH disminuyó la formación de colonias en las células que expresan de forma estable MTDH shRNA comparación con el control shRNA (Figura 2A, B). Estos resultados fueron confirmados mediante tres construcciones shRNA dirigidos a diferentes regiones del MTDH. Un fenotipo similar se observó también en desmontables de MTDH en células de cáncer de endometrio Ishikawa H Tipo I, lo que indica que por lo general se requiere una elevada expresión MTDH para la formación de colonias de cáncer de endometrio.
Hec50co células fueron transfectadas con vectores de expresión de control o MTDH shRNA . Colonias (A) formadas por células transfectadas con shRNA Hec50co MTDH control o se muestran después de la transfección de shRNAs y después de la selección con 2 ug /ml de puromicina durante 3 semanas. (B) Cuantificación de la formación de colonias relativa en el control frente a las células Hec50co MTDH desmontables.
Identificación de genes regulados MTDH en líneas celulares de cáncer de endometrio
Para identificar genes abajo la mediación de la tumorigénico efectos de MTDH en líneas celulares de cáncer de endometrio, se utilizó un oligonucleótido de microarrays de Affymetrix (conjunto de genes humanos 1.0 ST) para detectar los genes expresados diferencialmente en las células Hec50co establemente transfectadas con cualquiera de MTDH shRNA o un control de shRNA (Los datos se han depositado sobre el GEO, GSE26134) . El agotamiento de MTDH por caída resultó en al menos dos veces la expresión de genes alteración de 57 genes (Figura 3A). Varios de estos genes fueron escogidos al azar para confirmar los cambios de QRT-PCR (Figura 3B)
.
(A) Mapa de calor de doble cambio de la expresión génica (como se determina a partir de Affymetrix serie de datos) entre el control y MTDH desmontables células Hec50co. (B) cambios de expresión génica fueron validados por qRT-PCR para los genes indicados identificados en el microarray (* p & lt; 0,05). (C) la expresión y /o la fosforilación de las proteínas indicadas se examinaron en las células que expresan establemente Hec50co ya sea de control o shRNA MTDH shRNA. PDK1 total y β-actina se utilizaron como controles de carga. (D, E) se detectó expresión de PIP3 en el control (D) o desmontables MTDH células (E) Hec50co por PIP3 tinción inmuno-fluorescencia.
Los datos de la matriz indicó que MTDH regula la expresión de genes involucrada en la invasión, las uniones estrechas, así como la quimiorresistencia (Tabla S1 y S2). Por ejemplo, la galectina-1 (LGALS1) y calbindina 1 (Calb1) fueron células Hec50co marcadamente transfectadas con shRNA las reguladas en el ARNm (Figura 3B) y los niveles de proteína (Figura 3C) en MTDH. Calb1 y galectina-1 son dos genes aguas abajo MTDH putativas que pueden regular el metabolismo de fosfatidilinositol, que es parte de la PI3K /AKT señalización vía comúnmente upregulated en el cáncer de endometrio [23]. También se examinaron los cambios en la expresión génica en células de cáncer de endometrio Ishikawa H en respuesta al silenciamiento MTDH y observamos cierta superposición con los genes que se han alterado en las células Hec50co (Tabla S3 y S4).
A continuación trató de entender cómo MTDH regula la vía PI3K /Akt. La expresión de galectina-1 está regulada positivamente en diversos tipos de tumores y se informa para mediar en la invasión tumoral y la metástasis aumentando la expresión de la metaloproteinasa de matriz MMP-9 y MMP-2 y promover la reorganización del citoesqueleto de actina [24]. De acuerdo con un estudio previo en el que la sobreexpresión de MTDH promueve la activación de la vía PI3K /AKT en el neuroblastoma [7], se detectó una inhibición de los componentes de PI3K vía de señalización /AKT en las células Hec50co con MTDH empobrecido en comparación con el control (Figura 3C) . Específicamente, una dramática reducción en la fosforilación de PDK1 en S241 y la fosforilación de AKT en tanto T308 y S473 se produjeron en células MTDH desmontables, aunque no se detectó ningún cambio significativo del nivel total de proteínas PDK1 (Figura 3C). Además, como se muestra en la figura 3D y E, se detectó una reducción dramática en el nivel de PIP3 en las células Hec50co con MTDH shRNA en comparación con células de control con shRNA. Estos hallazgos demuestran que MTDH puede activar las vías de pro-supervivencia PI3K /AKT a través de la regulación de PIP3.
caída MTDH sensibiliza a las células a las terapias dirigidas cáncer
Para superar la resistencia a las terapias, HDAC inhibidores tales como LBH589 se han utilizado para restaurar la apoptosis inducida por TRAIL en diversos tipos de cáncer [18], [19]. células Hec50co anteriormente se muestra para ser resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL [13]. Por lo tanto, para probar la influencia de MTDH sobre la sensibilidad a TRAIL en estas células, las células tratadas con o sin Hec50co MTDH (control frente a caída MTDH) con RUTA y el tratamiento combinado LBH589 durante tres días y luego examinamos la viabilidad celular. En comparación con shRNA revueltos transfectaron células Hec50co, desmontables MTDH estable aumentó moderadamente la sensibilidad de las células Hec50co a la terapia de agente único (ya sea LBH589 o TRAIL solo, Figura 4A, B). Sin embargo, como se muestra en la Figura 4B, una inducción más dramático de la sensibilidad se produjo en células Hec50co desmontables MTDH estable con la combinación de LBH589 y TRAIL. Estos datos sugieren que la expresión MTDH es un factor importante la resistencia a el régimen combinado subyacente.
(A) inducción de muerte celular por LBH589 como se detectó un único agente en el control o MTDH células Hec50co caída. Después de 3 días, la muerte celular se determinó por el método WST-1. (B) La muerte celular resultante de diferentes concentraciones de TRAIL (5 a 50 ng /ml) solo o en combinación con 5 nM LBH589 se analizó en el control o MTDH desmontables células Hec50co.
reguladores de la apoptosis implicados en MTDH mediada por la muerte celular
Para estudiar el mecanismo molecular de la muerte celular en las células MTDH desmontables, la expresión de proteínas asociadas con la apoptosis (tanto de factores pro- y anti-apoptóticas) se ensayaron en el control MTDH y desmontables células después de solo tratamiento (LBH589 o TRAIL) o después del tratamiento combinado (LBH589 y TRAIL). El tratamiento de combinación no aumentó la expresión de los receptores de TRAIL DR4 y DR5. Además, no hubo cambios en la expresión de los genes anti-apoptóticos de Bcl-XL, Mcl-1, o en el control de la FLIP MTDH y células Hec50co desmontables después del tratamiento combinatorio (Figura 5).
control o MTDH desmontables Hec50co las células fueron tratadas durante 24 horas con el control del vehículo, 20 nM LBH589, 25 ng /ml de TRAIL o LBH589 y TRAIL en las concentraciones señalaron. Se recogieron lisados. La expresión de DR4, DR5, y relacionados con la apoptosis PARP-1, BID, FLIP, XIAP, Bim, MCL-1 y Bcl-XL se analizó por Western Blot. Caspasa-3, caspasa-8,
Curiosamente, la única BH3-pro-apoptóticos proteína Bim fue hasta reguladas en MTDH sin tratar células Hec50co desmontables en comparación con las células control (Figura 5), lo que indica que el agotamiento de MTDH por sí sola puede conducir a la inducción de factores pro-apoptóticos. Cuando las células Hec50co control se trataron con LBH589 solo o en combinación con TRAIL, la expresión de Bim aumentó. Por el contrario, la expresión de Bim fue significativamente mayor en las células desmontables MTDH Hec50co sin ningún tratamiento, mientras que el tratamiento con TRAIL o LBH589 mejora aún más la expresión de Bim. Sin embargo, la expresión Bim se redujo ligeramente en células MTDH desmontables después de co-tratamiento con LBH589 y TRAIL.
En las células de control, modificación posterior a la traducción de XIAP se produjo tras el tratamiento con LBH589, como se demuestra por una especie más alta que migran, y la reducción de XIAP tanto total como modificada sólo se detectó con LBH589 y TRAIL tratamiento de combinación (Figura 5). Este efecto se acentúa cuando MTDH fue derribado, de tal manera que se detectó una mayor reducción de XIAP modificación posterior a la traducción en las células Hec50co MTDH desmontables en comparación con las células control y tratamiento después de LBH589 TRAIL. Además, se detectó una inducción significativa de la escisión de la caspasa-8, caspasa-3 y PARP-1 después del tratamiento único con LBH589 o TRAIL, o la combinación en MTDH desmontables células Hec50co comparación con las células de control. Reducción de la oferta también se observó en las células MTDH desmontables tratados con la combinación de LBH589 y TRAIL. En conjunto, estos datos demuestran que desmontables de MTDH puede aumentar la apoptosis inducida por TRAIL extrínseca y LBH589, y el principal mecanismo es a través de la regulación de Bim. Baja regulación de XIAP y la posterior activación de la caspasa-8 y la caspasa-3, así como sustratos aguas abajo tales como la PARP-1 también se produce.
regulación del ciclo celular puesto de control por MTDH
Con el fin de determinar el mecanismo exacto por el cual MTDH confiere resistencia a TRAIL y tratamiento LBH589, el próximo investigó el papel de MTDH en el control del ciclo celular. Control y MTDH desmontables células Hec50co que estaban sin tratar o tratados con TRAIL solo tuvieron perfiles similares del ciclo celular (Figura 6A). En contraste, el tratamiento con el inhibidor de HDAC LBH589 en las células que carecen de MTDH resultó en una mayor proporción de células persistentemente en la fase G2 /M. Cuando desmontables células Hec50co MTDH se trataron con ambos LBH589 y TRAIL, una proporción reducida de las células estaban en fase S y un aumento de la proporción de células fueron detenidos en G2 /M (Fig. 6A). Estos datos muestran que MTDH tiene un papel importante en la regulación del punto de control del ciclo celular en el contexto de TRAIL combinatoria y tratamiento inhibidor de HDAC.
(A) los perfiles del ciclo celular se determinaron en el control o MTDH desmontables células Hec50co a las 24 horas después del tratamiento con 20 nM LBH589, 25 TRAIL ng /ml, o LBH589 y TRAIL en combinación. El porcentaje de células en el G1, se determinaron las fases S y G2 /M. (B) El cambio en la Aurora A, Aurora B, p21, acetilación de histonas H3 en la lisina 9, histona H3 fosforilación en la serina 10 y H3 total de la histona se evaluó mediante transferencia Western después de 24 horas de tratamiento con los reactivos indicados. H3 histona total se utilizó como control de carga. (C) Un modelo para el mecanismo por el cual dilucidado desmontables de MTDH aumenta la muerte celular por TRAIL y el inhibidor de HDAC LBH589. knockdown MTDH disminuye la fosforilación de PDK1 y su AKT sustrato, lo que resulta en el aumento de expresión de la proteína proapoptótico Bim. XIAP expresión es downregulated en respuesta a LBH589 combinado y tratamiento TRAIL, liberando de este modo la inhibición mediada por XIAP de la caspasa-3 y -8 activación. En conjunto, la regulación de estas vías promueve la muerte celular por apoptosis.
Para investigar el mecanismo por el cual MTDH regula el ciclo celular, se midió la expresión de los reguladores del ciclo celular. Se observó un aumento de Aurora A en el nivel de proteínas en las células MTDH desmontables en comparación con las células control (Figura 6B). Cuando el control y las células Hec50co MTDH desmontables se expusieron a LBH589, hubo un aumento de la Aurora A, Aurora B, la acetilación de la histona H3 en la lisina 9, la fosforilación de la histona H3 en serina 10, y independiente de p53 sobre regulación de p21 WAF1, el inhibidor de las quinasas dependientes de ciclina (Figura 6B). Curiosamente, el tratamiento TRAIL resultó en una disminución sustancial en la fosforilación de la histona H3, que corresponde a una disminución en el porcentaje de células en fase G2 /M en comparación con las células no tratadas. En general estos datos implican un nuevo papel para MTDH en la regulación de puntos de control del ciclo celular.
Discusión
Aunque MTDH se ha relacionado con tanto la metástasis y la resistencia a la quimioterapia en varios tipos de cánceres [1], [ ,,,0],25], el mecanismo y la función biológica de MTDH es en gran parte desconocida. El agotamiento de MTDH puede aumentar los efectos de los fármacos quimioterapéuticos como doxorrubicina, paclitaxel y 5-FU [10], [11]. Aquí mostramos que la expresión de MTDH es muy elevado en los tejidos de cáncer de endometrio en comparación con endometrio normal. Nuestros datos demuestran que el agotamiento de MTDH con un shRNA específico también puede aumentar la sensibilidad celular a las terapias dirigidas, incluyendo el inhibidor de HDAC LBH589, TRAIL y un régimen de combinación con ambos agentes. Como se muestra en la Figura 6C, hemos identificado el mecanismo potencial por el que desmontables de MTDH aumenta la muerte celular en respuesta al tratamiento con TRAIL y el LBH589 inhibidor de HDAC. En concreto, las células que carecen MTDH han disminución de la fosforilación de PDK1 y su sustrato AKT, que a su vez estimula la expresión de la proteína proapoptótico Bim. Combinadas LBH589 y tratamiento TRAIL resultados en la regulación negativa de XIAP, permitiendo de este modo la activación de la caspasa-3 y -8. Estos cambios moleculares dan como resultado la muerte celular apoptótica en células que carecen de MTDH. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la resistencia mediada por MTDH se produce a través de la activación de pro-supervivencia de las vías de señalización y, potencialmente, por la regulación aberrante de punto de control.
El uso de un enfoque de microarrays, hemos identificado muchos genes candidatos que son regulados diferencialmente en las células que carece (MTDH shRNA) o expresar (control shRNA) MTDH. De particular interés fueron calbindina 1 (CALB1) y la galectina-1, dos proteínas que han sido relacionados con las vías de señalización pro-supervivencia. CALB1 es una proteína de unión de calcio con cuatro dominios de unión de calcio activa. CALB1 se informó de interactuar con monofosfatasa Myo-inositol (IMPA) usando presentación en fagos y para inducir la actividad IMPA hasta 250 veces [26], [27]. IMPA es una enzima que desfosforila monofosfato de myo-inositol, mio-inositol-1,3-difosfato, y mio-inositol-1,4-difosfato para generar libre de myo-inositol que juega un papel importante en la muerte celular programada [28]. La galectina-1, una proteína de unión de beta-galactosidasa, se expresa fuertemente en una variedad de cánceres humanos y se ha demostrado que desempeñan un papel en la señalización de PI3K y la activación de Akt [29]. En las células de glioblastoma, desmontables de galectina-1 deteriora la capacidad de estimulación similar a la insulina factor de crecimiento (IGF-1) para elevar los niveles de PIP3 celulares (Perry et al., 2010, AACR 101
st abstracta reunión anual 301). Nuestros datos indican que MTDH mediada por la regulación de la galectina-1 y CALB1 puede ser el mecanismo por el cual MTDH estimula un aumento en los niveles de PIP3, activando de este modo la vía PI3K /AKT /mTOR. Esta vía juega un papel importante en la carcinogénesis endometrial, ya sea por la mutación de PTEN o por otros mecanismos, la activación constitutiva es la regla. Nuestra identificación de la expresión excesiva de MTDH conduce a mayores niveles de PIP3 ofrece otra posible explicación para la alta actividad de PI3K y AKT se encuentra con frecuencia en los cánceres endometriales.
La inhibición de MTDH ha demostrado aumentar la muerte celular inducida por LBH589 y tratamiento de combinación de TRAIL (Figura 4). TRAIL puede inducir la apoptosis extrínseca mediante la unión directa con los receptores de muerte. Sin embargo, mientras que TRAIL puede inducir selectivamente la apoptosis en células de cáncer de endometrio, no puede inducir la apoptosis en los tejidos normales del endometrio a la misma concentración. Además, la concentración de TRAIL (200 ng /ml) necesaria para inducir la apoptosis en células de cáncer de endometrio es mucho mayor que la utilizada anteriormente para las células de otros tumores sólidos (por ejemplo, 25-50 ng /ml en el cáncer de páncreas) [13], [ ,,,0],30]. Esto indica la posible resistencia de línea de base de TRAIL en el cáncer de endometrio, que podría estar relacionado con la expresión de alto MTDH. Para superar la resistencia, varios agentes quimioterapéuticos o inhibidores específicos que se han reportado para aumentar la sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL se han utilizado en los regímenes de combinatorias [12]. Aquí demostramos que el inhibidor de HDAC LBH589 puede aumentar mediada por TRAIL caspasa-8 y la posterior activación de la muerte celular extrínseca en las células de cáncer de endometrio. Desmontables de MTDH puede estimular aún más la caspasa-8 división inducida por LBH589, TRAIL, o la combinación de los dos. Un aumento de la modificación post-traducción XIAP, una reducción en el total de XIAP, y la inducción de la Bim gen pro-apoptosis se observaron en las células tratadas con el LBH589 solo. No se observó pérdida de la subasta en desmontables células después del tratamiento MTDH LBH589 y TRAIL combinación, que es probablemente debido a la activación de la subasta a través de la escisión. El hallazgo de la disminución de Bim con el mismo tratamiento fue algo inesperado. Sin embargo, nuestros datos de la Figura 3 indican que MTDH knockdown regula negativamente la vía de Akt, que inicialmente puede resultar en la expresión elevada de Bim. A medida que las células progresan a través de la apoptosis, las proteínas son menos estables pueden estar sujetos a la degradación. Dado que las células MTDH desmontables han acelerado la muerte celular en respuesta al tratamiento de combinación (Figura 4), es posible que la disminución de Bim es un reflejo de recambio de proteínas rápida.
En respuesta al tratamiento LBH589 solo o con TRAIL , los dos efectos principales de MTDH desmontables en el ciclo celular fueron una disminución en el porcentaje de células en S y un aumento concomitante en el porcentaje de células en G2 /M, donde las células parecen ser detenido. A nivel celular, sin embargo, desmontables MTDH solo, en ausencia de la terapia no afectó a la expresión de las proteínas reguladoras del ciclo celular canónico. Por ejemplo, LBH589 mejora de forma significativa la acetilación de histonas H3 en la lisina 9 (Figura 6B) que puede permitir la activación transcripcional del gen p21 [31]. Sin embargo, la modificación H3 no se vio afectada por shRNA desmontables de MTDH. la degradación mediada por proteasoma de Aurora A, Aurora B y c-FLIP se informó a ser responsable del aumento en la sensibilidad a TRAIL mediante el tratamiento inhibidor de HDAC en algunas células de cáncer [15], [32]. Sin embargo, no se observaron cambios significativos en Aurora A y B o C-FLIP niveles en células de cáncer de endometrio tratados con LBH589 en nuestros estudios.
Este es el primer informe de impacto de MTDH sobre la resistencia de la terapia dirigida para el cáncer de endometrio . Para estos estudios, se optó por la combinación de LBH589 y TRAIL debido a los efectos de estos agentes sobre las vías pro-apoptóticos. Se demuestra en el presente documento que desmontables de MTDH sensibiliza a las células a la muerte celular programada a través de un mecanismo que implica la inhibición de la PDK1 y Akt fosforilación, aumento de Bim, y la reducción de XIAP. Por lo tanto, podemos apuntar MTDH para mejorar la sensibilidad a la quimioterapia, pero no sólo agentes también dirigidas que funcionan a través de la muerte celular programada. Estos datos proporcionan evidencia convincente de que, mediante la regulación negativa MTDH en el cáncer de endometrio, podemos magnificar las vías y la respuesta a la terapia pro-apoptóticos.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
endometrio normal los tejidos y los tejidos del endometrio de los cánceres endometriales se recogieron con el consentimiento de los pacientes bajo la Universidad de Iowa Juntas de Revisión Institucional protocolo aprobado. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes involucrados en este estudio.
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de cáncer de endometrio humano Hec50co, RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H, y se mantuvieron KLE como se describe anteriormente [33]. Las células se cultivaron en medio DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina /estreptomicina (todos de Gibco BRL, Carlsbad, CA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire. Para generar un modelo de caída MTDH, las células fueron transfectadas con Hec50co MTDH ARN sh o controlan no silenciar shRNA construye según las instrucciones del fabricante (Origene, Rockville, MD). clones de células individuales resistentes a puromicina se expandieron y se someten a un examen para la expresión MTDH por Western Blot.
endometriales Los tejidos y las matrices tisulares
se recogieron los tejidos del endometrio normal y los tejidos del endometrio de los cánceres endometriales de la Universidad de hospitales y clínicas de Iowa. La matriz de tejido endometrial espectro de la enfermedad (la progresión del cáncer de endometrio) (801 UT) fue adquirido de los Estados Unidos Biomax, Inc. (Rockville, MD).
Reactivos, anticuerpos y Western Blot
TRAIL recombinante humana (apoptosis ligando relacionados con la inducción de TNF-) se adquirió de R amp y; D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). LBH589 se adquirió de Selleck (Houston, TX). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-MTDH y los anticuerpos anti-β-actina fueron de Sigma (St Louis, MO, EE.UU.); y anti-exfoliados caspasa-3, caspasa-8, DR4, DR5, Bim, Bid, FLIP, XIAP, p21, PARP-1 P-Akt S473, p-AKT T308, PDK1, p-PDK1 S204, la histona 3, p -histone 3 anticuerpos serine10 y la histona 3 lisina 9 de acetilación eran de Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA). De células enteras lisados de proteínas se prepararon y analizaron por Western Blot como se describe anteriormente [34].
Array Expresión y análisis de RT-qPCR
El ARN total se aisló de caída MTDH y controlar celular cáncer de endometrio líneas (por triplicado biológicos para el control y células MTDH knockdown) utilizando el
mir Vana
miARN Kit de aislamiento (Ambion, Austin, TX), y cDNA se generó mediante el alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Un gen humano gama ST 1.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA) fue interrogado el uso de los triplicados biológicos en el Fondo para el núcleo de ADN en la Universidad de Iowa, y Partek Genómica Suite (Partek Inc., St. Louis, MO) de software se utilizó para generar los valores de la expresión génica. Toda la información es compatible con MIAME y los datos en bruto ha sido depositada en una base de datos de GEO MIAME queja, como detalle en la web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi?acc= GSE26134. El número de acceso para las células Hec50co es GSE26134 y para las células Ishikawa H es GSE27828. Varios genes abajo MTDH fueron elegidos al azar para validar los datos de microarrays utilizando cebadores y sondas TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) para el análisis RT-PCR cuantitativa.