Extracto
Antecedentes
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos, lo que sugiere que nuevas estrategias para la prevención y el tratamiento de la PDAC están Urgentemente necesitado. mutaciones K-ras se observan en & gt; 90% de cáncer de páncreas, lo que sugiere su papel en el inicio y etapas de desarrollo tempranas del PDAC. Con el fin de obtener una visión mecanicista en cuanto al papel de K-ras mutado, varios modelos de ratón han sido desarrollados por la orientación de un condicional K-ras mutado
G12D para recapitular PDAC. Un co-operatividad significativa se ha demostrado en el desarrollo de tumores y metástasis en un modelo de ratón compuesto con gen K-ras y Ink4a /deficiencia de Arf. Sin embargo, el mecanismo molecular (s) por el cual K-ras y Ink4a /deficiencia de Arf contribuyen a PDAC no ha sido completamente aclarada.
Metodología /Principales conclusiones
Para evaluar el mecanismo molecular (s ) que están involucrados en el desarrollo de PDAC en los ratones transgénicos compuesto con K-ras activados y Ink4a /deficiencia de Arf, hemos utilizado varios métodos, tales como real-time RT-PCR, ensayo de transferencia de Western, inmunohistoquímica, ensayo de MTT, invasión, EMSA y ELISA. Se encontró que la supresión de Ink4a /Arf en K-ras ratones que expresan
G12D conduce a PDAC, que está parcialmente mediada por la activación de vías de señalización Notch y NF-kB. Por otra parte, encontramos la baja regulación de miR-200 de la familia, que también podría desempeñar un papel importante en el desarrollo y progresión tumoral del PDAC en los ratones transgénicos compuestos.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados sugieren que la activación de Notch y NF-kappa B junto con la pérdida de miR-200 familia está mecánicamente vinculados con el desarrollo y progresión de la PDAC en el compuesto K-ras
G12D y Ink4a /Arf ratones transgénicos deficientes.
Visto: Wang Z, S Banerjee, Ahmad A, Li Y, Azmi AS, Gunn JR, et al. (2011) gen K-ras y INK4a /Arf Deficiencia cooperar durante el desarrollo de cáncer de páncreas mediante la activación de Notch y NF-kB vías de señalización. PLoS ONE 6 (6): e20537. doi: 10.1371 /journal.pone.0020537
Editor: S. K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Abril, 2011; Aceptado: 2 de mayo de 2011; Publicado: Junio del 3, 2011
Derechos de Autor © 2011 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de Salud subvenciones 5R01CA131151, 5R01CA131151-S02, y 5R01CA132794 (FH Sarkar) y CA-075059 de M. Korc. Los autores agradecen a Puschelberg Guido y fundaciones por su generosa contribución financiera. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es una enfermedad maligna muy agresiva, que está clasificada como la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer, con una supervivencia media de 6 meses, y con un estimado de 43.140 nuevos casos diagnosticados y una aproximadamente 36.800 muertes en los Estados Unidos en 2010 [1]. Se ha aceptado que el desarrollo de PDAC se produce a través de la progresión de las lesiones precursoras tales como neoplasia pancreática intraepitelial (PanIN), que van desde PanINs de bajo grado (PanIN-1A, PanIN-1B) a PanINs de alto grado (PanIN-2, PanIN-3) [2], [3]. PDAC se ha demostrado que tienen progresión molecular de varios pasos, incluyendo alta frecuencia de la activación de mutaciones K-ras y la posterior inactivación de p16
INK4a, p53, supresores tumorales SMAD4, p14ARF y otras anomalías genéticas adicionales en modelos de ratón [4] - [ ,,,0],6] y en humanos [7]. La mutación K-ras más común en PDAC humano está en el codón 12 (Kras
G12D), que está relacionada con la activación de la actividad GTPasa. Por lo tanto, varios modelos de ratón de PDAC se han generado por la orientación de un condicional K-ras mutado
G12D recapitular la progresión de la PDAC [8] - [12]. Un modelo de ratón compuesto que contiene K-ras activados y Ink4a /deficiencia de Arf mostró a cooperar en la producción de metástasis PDAC [13], [14]. Sin embargo, el mecanismo molecular (s) por el cual activa K-ras y Ink4a /deficiencia de Arf contribuyen a la agresividad PDAC no se ha dilucidado completamente.
En los últimos años, muchas vías de señalización, incluyendo vía de Notch se han investigado y encontrado jugar un papel importante en PDAC [15]. la señalización de Notch tiene funciones críticas en el control del crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis, migración, invasión y metástasis en PDAC [16]. genes Notch codifican proteínas que pueden ser activados mediante la interacción con una familia de sus ligandos. Hasta la fecha, se han identificado cuatro receptores Notch (Notch1-4) y cinco ligandos (DLL-1, DLL-3, DLL-4, Jagged-1, Jagged-2) [17]. Curiosamente, se ha informado de que la función de la señalización de Notch en la tumorigénesis puede ser oncogénico o oncosuppressive, y la función es también dependiente del contexto en PDAC [18], [19]. señalización Notch es frecuentemente desregulado con la expresión regulada en marcha de los receptores Notch y sus ligandos en PDAC [20]. Hemos demostrado que la baja regulación de Notch-1 utilizando siRNA se correlacionó con las tasas de proliferación disminución, aumento de la apoptosis, la migración reducida, y la disminución de las propiedades invasivas de las células de cáncer de páncreas [21], [22]. Recientemente, se ha encontrado que la señalización Notch activo puede sinergizar con K-ras en la iniciación y la progresión a PanIN adenocarcinoma invasivo [8], [23]. La inhibición de la vía de señalización de Notch como resultado la inhibición de la progresión tumoral en un modelo de ratón (K-ras, p53 L /+ ratones) de PDAC [24]. Más recientemente, Mazur et al. encontrado que la deficiencia de Notch-2 se detiene la progresión PanIN, prolonga la supervivencia a través de la inhibición de la señalización de Myc en K-ras impulsada carcinogénesis pancreática [25]. Sorprendentemente, Notch-1 se ha descubierto recientemente como un supresor tumoral en un modelo de PDAC, lo que sugiere que se requieren estudios adicionales para determinar el papel de la señalización Notch en PDAC
vía de Notch inducida por K-ras [18]. se ha informado que la diafonía con NF-kappa B, uno de los principales factores de la transcripción asociado con el crecimiento celular y las vías de regulación de apoptosis en el cáncer de páncreas. Estudios de nuestro grupo revelaron que la señalización Notch podría inducir la actividad de NF-kB en el cáncer de páncreas [21]. Recientemente, se demostró que se requiere ruta de NF-KB para el desarrollo de tumores en un modelo de ratón (K-ras, p53 L /L ratones) de adenocarcinoma de pulmón [26]. Por otra parte, se encontró que la eliminación genética de la subunidad p65 de NF-kappa B en un modelo de ratón de cáncer de pulmón inducida por K-ras reduce la tumorigénesis de pulmón en presencia y en ausencia de la p53 supresora de tumores [27]. Sin embargo, es en gran medida incierto si NF-kB es necesario para K-ras-inducidos progresión PDAC.
En el presente estudio, se evaluaron las alteraciones moleculares en tumores de ratón desarrollados en los ratones transgénicos compuesto con K- activado ras y Ink4a /deficiencia de Arf. Aquí, se muestra, por primera vez, que la supresión de Ink4a /Arf en K-ras expresando ratones conduce a la PDAC, que es en parte mediada por la activación de vías de señalización Notch y NF-kB. Por otra parte, encontramos una alteración en la expresión de miR-200 de la familia, que también podría desempeñar un papel importante en el desarrollo y progresión tumoral del PDAC en los ratones transgénicos compuesto con K-ras activados y Ink4a /deficiencia de Arf.
Resultados
vía de señalización Notch es altamente expresado en Pdx1-Cre; LSL-K-ras
G12D; Ink4a /Arf ratón
Para delinear el papel mecanicista de K-ras mutado en el desarrollo y la progresión de PDAC, se evaluó la expresión de vía de Notch en el modelo murino. En este modelo, el oncogén K-ras (Kras
G12D) se golpea-in en su propio lugar y transcripcionalmente silenciados debido a la inserción de un elemento LoxP-Stop-LoxP (LSL). Cuando LSL- Kras
ratones G12D se crían con ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre bajo el control del promotor de Pdx1, la expresión de la recombinasa Cre en las células progenitoras pancreáticas permite la eliminación de la casete de PARADA transcripcional floxed, lo que lleva a la activación de la K-ras oncogénicas alelos. En este modelo, no hubo tumores que se encuentran fácilmente hasta 30 semanas de edad en LSL- K-ras
G12D; Pdx1-Cre (que llama KC en este manuscrito) los ratones, de acuerdo con el estudio anterior [13]. También se encontró ninguna evidencia de PDAC en el Ink4a /Arf; Pdx1-Cre (IC llamamos en este manuscrito) animales hasta una edad de 24 semanas, de forma similar a la observación documentada por otros grupos [13]. Sin embargo, los 25 ratones de LSL- K-ras
G12D; Pdx1-Cre; Ink4a /Arf (que llamamos KCI para este manuscrito) grupo se encontró que tenían tumores pancreáticos un diámetro de entre 4 a 10 mm entre 45 a 80 días (Fig. 1A). El compuesto de ratones con tumores de KCI se convirtieron moribundo (Fig. 1A, la curva de supervivencia). Los tumores fueron confirmados mediante examen histopatológico (fig. 1B). El Ki-67, un conocido marcador de proliferación, fue altamente expresado en KCI tumores pancreáticos (fig. 1B). Se ha informado de que la vía de señalización Notch tiene un papel crítico en el desarrollo y progresión del cáncer de páncreas. Por lo tanto, se evaluó la expresión de los genes Notch en estos tejidos de ratones transgénicos. Es importante señalar que nos centramos nuestros estudios sobre la Notch escindida, ya que es la forma funcional activa de Notch. Por lo tanto, la muesca en nuestras todas las leyendas de las figuras significa Notch escindida activo. Encontramos que la señalización Notch se activó en los tumores de los ratones KCI cuando se compara con los páncreas de ratones KC y CI, respectivamente (Fig. 1C, D). La expresión de Notch-2 y Notch-4 fue hasta reguladas tanto en los niveles de mRNA y proteína en ratones de KCI. Sin embargo, Notch-1 de expresión no mostró ningún cambio y Notch-3 de expresión se incrementó sólo en el nivel de ARNm en los tumores de los ratones de KCI, lo que sugiere que los roles de Notch-2, y Notch-4 podría ser más importante en la progresión del cáncer de páncreas. También se encontró que los cinco ligandos Notch fueron hasta reguladas en los tumores derivados de los ratones de KCI (Fig. 2A, B). Para confirmar estos resultados, se evaluó la expresión de Notch genes abajo como Hes-1 y Hey-1. Hemos encontrado que la expresión de Hes-1 y Hey-1 se aumentó en los tumores de los ratones de KCI (Fig. 2A, B), que se esperaba en base a la expresión regulada hasta de Notch-2, Notch-4 y sus ligandos.
a, Panel superior izquierdo: la incidencia de tumores en ratones KCI (N & gt; 25). Los ratones de control: ratones KC e IC. Panel superior derecho: Duración media de los tumores en los ratones KCI (N & gt; 20). Panel inferior: Kaplan-Meier de páncreas curva de supervivencia libre de tumor para los ratones de KCI y en los controles. Los ratones de control: combinaciones de ratones KC e IC. B, Panel superior: El examen microscópico de los tumores derivados de los ratones de KCI compuestas de células que se están formando los conductos en los lugares (flechas rojas). células tumorales focalmente están en hojas. Las células son grandes, muy atípica, con núcleos grandes, pleomórficas y prominente 2-3 nucleolos (flechas amarillas) por célula. El citoplasma es eosinófilo con inclusiones eosinofílicas pálido (flechas verdes) en pocas células que dan una característica rabdoide a las células. estroma circundante muestra células fusiformes con núcleos alargado (flechas negras) y infiltrado inflamatorio dispersa comprende de neutrófilos, linfocitos y algunas células plasmáticas. Panel inferior: Ki-67 fue altamente expresado en los tumores obtenidos de los ratones de KCI como se evaluó por inmunohistoquímica. C, vía de señalización Notch estaba regulada a nivel de ARNm según la evaluación de Real-time RT-PCR en los tumores derivados de los ratones de KCI. D, vía de Notch se expresa altamente en tumores derivados de los ratones de KCI según lo evaluado por el análisis Western Blot e inmunohistoquímica, respectivamente.
A, la expresión de ligandos de Notch y abajo genes Notch se incrementó a nivel de ARNm según la evaluación de real-time RT-PCR en tumores derivados de los ratones de KCI. B, la expresión de ligandos de Notch y genes aguas abajo Notch fue altamente expresado en tumores derivados de los ratones de KCI como se evaluó por análisis de transferencia Western. C, la actividad de p65 NF-kB se incrementó en los tumores derivados de los ratones de KCI por ELISA. D, el panel izquierdo, p65 actividad de unión al ADN de NF-kappa B se incrementa en los tumores derivados de los ratones de KCI según la evaluación de la EMSA. Panel derecho, fosfo-p65 se expresa altamente en tumores obtenidos de los ratones de KCI como se evaluó por inmunohistoquímica.
actividad de unión a ADN de NF-kB se activó en KCI ratones tejido
NF kappa B se ha informado que la diafonía con vía de Notch [28]. Hemos informado anteriormente de que Notch-1 puede hasta de regular la actividad de unión a ADN de NF-kB en el cáncer de páncreas [22]. Por lo tanto, se investigó si el efecto aguas abajo de Notch regulación podría ser mecánica asociada con la activación de la vía NF-kappa B en los tumores de estos animales. Es bien sabido que la familia NF-kappa B está compuesto de homo y heterodímeros de proteínas Rel; NF-κB1 (p50); NF-kB (p52), de RelA (p65), RelB, y c-Rel (Rel). NF-kB (p50 /p65) es un heterodímero ubicua, constitutiva e inducible. En general, la actividad de unión a ADN de NF-kB se refiere tradicionalmente a la p50 /p65 (p50 /de RelA) heterodímero mediada por la unión al ADN, y es un regulador conocido de la supervivencia celular y la señalización anti-apoptosis. En el núcleo, el p65 de NF-kappa B subunidad es un fuerte activador de una amplia variedad de genes; Por lo tanto, se evaluó la expresión nuclear de la proteína p65 por inmunohistoquímica. proteínas nucleares de los tumores obtenidos de los ratones transgénicos fueron también objeto de NF-kB p65 ELISA, y la actividad de NF-kB p65 de unión a ADN, según lo determinado por la EMSA. Los resultados mostraron que la actividad de p65 NF-kappa B como se evaluó por ELISA, y la actividad de unión de ADN de p65 NF-kappa B se activa en los tumores derivados de los ratones de KCI compuestos (Fig. 2C, D). Estos resultados mostraron un aumento de la acumulación nuclear de la p65 en los tumores de los ratones de KCI, lo que sugiere que se requieren tanto la activación de K-ras y Ink4a /Arf deficiencia de la activación de NF-kB mejorada. Por otra parte, la inmunotinción también mostró que fosfo-p65 fue altamente expresado en el compartimiento nuclear en los tejidos tumorales de ratones de KCI (Fig. 2D).
NF-kB genes aguas abajo se activan en KCI ratones
se ha informado de que la vía Notch estimula la actividad de NF-kappa B en células de cáncer cervical mediante la asociación con el signalosome IKK a través de IKK [29]. estudio previo ha demostrado que la vía de Notch regula la expresión de IKK en el cáncer de páncreas [30]. Por lo tanto, se determinó la expresión de la proteína IKK en los tumores de los ratones de KCI. Se encontró que todos los miembros de la familia, tales como IKK IKK, IKKβ y IKKγ fueron activados en los tumores de los ratones KCI (Fig. 3A). Para explorar más a fondo los efectos de la activación de NF-kB, se examinaron los niveles de expresión de determinados genes diana NF-kappa B, incluyendo la COX-2, ciclina D1, MMP-9, MMP-2, Bcl-2, c-myc, y survivin de en tiempo real de RT-PCR y Western Blot, respectivamente, utilizando los tejidos tumorales obtenidas a partir del compuesto KCI animales transgénicos. Real-time RT-PCR y análisis de transferencia Western mostraron que la expresión de estos genes se activa en los tumores de los ratones de KCI (Fig. 3A, B). También se encontró que la expresión de Stat3 se activó en los tumores forman ratones KCI (datos no mostrados). Es bien sabido que estos genes juegan un papel crítico en el crecimiento celular, la invasión y la metástasis. Por lo tanto, estos resultados apoyan el papel de NF-KB en el crecimiento del tumor y la progresión en los ratones de KCI compuestos.
A, análisis de transferencia de Western que muestra la expresión regulada-up de IKK, p65 y NF-kappa B aguas abajo genes en los tumores derivados de ratones de KCI. B, Real-time RT-PCR que muestra una mayor expresión de NF-kB genes aguas abajo tales como la survivina, ciclina D1, Bcl-2, C-myc, MMP-2 y MMP-9 en los tumores derivados de los ratones de KCI. C, La expresión de la familia de miR-200 se había reducido regulado en los tumores de los ratones de KCI según la evaluación de tiempo real RT-PCR. D, Real-time RT-PCR que muestra disminución de la expresión de E-cadherina, y aumento de la expresión de vimentina, y un modesto aumento en la expresión de ZEB1 mientras que un 30 veces mayor expresión de ZEB2 en tumores derivados de los ratones de KCI.
La familia de miRNA-200 se redujo reguladas en ratones KCI
La familia de miR-200 se han encontrado para regular la vía de señalización Notch [31]. La familia de miR-200 tiene cinco miembros: el miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 y miR-429. Encontramos que Notch-1 podría ser uno de los genes diana de la familia miR-200 (miR-200b, miR-200c) debido a la sobre-expresión de estos miRNAs, inhibió Notch-1 de expresión en el cáncer de próstata [31] y el cáncer de páncreas ( datos no publicados). Para determinar si la familia miR-200 está implicado en los tumores de los ratones de KCI que mostraron alta expresión de Notch (Notch-2 y 4) la vía de señalización, se determinó la expresión de miR-200 de la familia. Como era de esperar, la expresión de miR-200a, miR-200b y MIR-200c fue significativamente menor en los tumores de los ratones de KCI (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que los tumores desarrollados en los ratones compuesto podría mostrar un comportamiento agresivo, la adquisición de la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) fenotipo, y por lo tanto hemos investigado más a fondo la composición molecular de los tumores derivados del compuesto de KCI transgénico los ratones como se detalla a continuación.
Evidencia de EMT fenotipo en los tumores derivados del compuesto de ratones transgénicos KCI
Recientemente, muchos estudios han demostrado que la familia miR-200 regula la EMT por la orientación dedo de zinc-E -box homeobox 1 (ZEB1) y ZEB2 vinculante. EMT es un proceso por el que las células epiteliales se someten a notables cambios morfológicos que se caracterizan por una transición de fenotipo epitelial de adoquines a fenotipo fibroblástico alargado. Nuestros estudios previos han demostrado que el miR-200a, miR-200b, 200c y miR-se redujeron regulado en las células de cáncer de páncreas gemcitabina-resistentes, consistente con el fenotipo observado EMT [32], [33]. Por otra parte, hemos demostrado que la familia miR-200 regula la expresión de ZEB1, babosa, E-cadherina, y vimentina, y por lo tanto sugerimos la re-expresión de miR-200 podría ser útil para la reversión de la EMT fenotipo mesenquimal-a transición epitelial (MET), que ha sido documentado en parte en nuestro reciente publicación [34]. Dado que hemos encontrado una baja expresión de la familia miR-200 en los tumores de los ratones de KCI, se evaluaron los marcadores de EMT para investigar si los tumores en los ratones se sometieron a KCI EMT o no. Encontramos pérdida de expresión de E-cadherina y elevada expresión de vimentina y ZEB2 en los tumores de los ratones de KCI aunque la expresión de ZEB1 mostró modesto aumento (Fig. 3D), lo que sugiere que la expresión de estos factores pueden ser importantes para inducir EMT fenotipo en los tumores de los ratones de KCI, lo que parece ser consistente con el comportamiento agresivo de los tumores desarrollados en ratones transgénicos compuesto de KCI.
la inhibición de la vía de Notch causó crecimiento de células cancerosas reducida en una línea celular PDAC ratón
a fin de evaluar el papel potencial de la vía de Notch en el cáncer de páncreas, se utilizó Pista-1 línea celular que se deriva de los tejidos pancreáticos de KCI y estudiaron los efectos de los inhibidores de la vía de Notch. Estudios anteriores han demostrado que las células de Rink-1 mostraron un rápido crecimiento
in vitro
y tumores formados en ratones desnudos [14]. Desde la señalización Notch se activa
vía
la actividad de γ-secretasa, varias formas de γ secretasa inhibidores incluyendo DAPT y L-685.458 se han usado para inactivar vía de Notch. Por lo tanto, se determinó la viabilidad celular de las células Rink-1 tratados con GSI mediante el ensayo de MTT, y los datos se presentan en la Figura 4A. El tratamiento de las células de Rink-1 durante 72 horas con DAPT, y L-685458 dio como resultado la inhibición del crecimiento celular. Para determinar qué receptor Notch podría ser una diana terapéutica eficaz para el cáncer de páncreas, se examinó el efecto de Notch 1-4 siRNA sobre el crecimiento celular de las células de cáncer de páncreas. La eficacia de GSI y Notch siRNA para la caída de la proteína Notch se confirmó a través de Western Blot. Hemos observado que el nivel de proteína Notch fue apenas detectable en las células tratadas GSI o Notch siRNA transfectadas (Fig. 4B). Muy interesante, solamente la inactivación del receptor Notch solo no inhibió significativamente el crecimiento celular (Fig. 4A). Estos resultados sugieren que la inactivación de múltiples receptores Notch de GSI son buena manera de tratar PDAC. Para confirmar esta conclusión, hemos probado la expresión de los genes diana de Notch en las células Rink-1 tratados con GSI o Notch siRNA. Debido a que sólo Notch-2 y Notch-4 siRNA crecimiento celular ligeramente inhibido, se detectó la expresión de los genes diana en las células Notch Rink-1 tratados con estos dos siRNAs. Tal y como esperábamos, encontramos que GSI inhibe la expresión de los genes diana de Notch incluyendo Hes-1, survivina, Bcl-2, c-myc, UPA que más grado, en comparación con Notch-2 siRNA o Notch-4 siRNA transfección (Fig. 4C). Por lo tanto, hemos utilizado GSI en los siguientes experimentos. A continuación, probamos los efectos del tratamiento sobre la viabilidad celular mediante el ensayo clonogénico. tratamiento GSI dio como resultado una inhibición significativa de la formación de colonias de células de Rink-1 en comparación con el control (Fig. 5A). En general, los resultados de ensayo clonogénico fueron consistentes con los datos de MTT, lo que sugiere que la inactivación de la vía de Notch podría inhibir el crecimiento celular de las células de Rink-1.
A, panel izquierdo, la inhibición de Pista-1 de crecimiento de células por Notch 1-4 siRNA ensayó mediante el ensayo de MTT. Los resultados se representan como media ± desviación estándar de tres experimentos separados que tienen seis determinaciones por experimento para cada condición experimental. el panel central y derecha: L-685458 y DAPT eran inhibidores de la gamma-secretasa (GSI), que impiden que la escisión del receptor Notch, el bloqueo de la transducción de señales Notch. GSI inhibió significativamente Pista-1 de crecimiento celular. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 5.000 células por pocillo y se trataron con GSI durante 72 horas. Después del tratamiento, las densidades de células se determinaron por el ensayo de MTT. Cada valor representa la media ± desviación estándar (n = 6) de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, en comparación con el control. B, La expresión de la vía de Notch se había reducido regulado en las células Rink-1 tratados con GSI o transfectadas con Notch 1-4 siRNA como se evaluó mediante análisis de Western Blot. C, La expresión de los genes diana de Notch se había reducido regulado en las células Rink-1 tratados con GSI o transfectadas con Notch-2 siRNA o Notch-4 siRNA según la evaluación de lo evaluado por tiempo real RT-PCR.
A, Arriba, Panel izquierdo: la supervivencia celular de las células Rink-1 tratados con GSI. Las células tratadas con GSI durante 72 horas se evaluó mediante el ensayo clonogénico. diferencia fotomicrográfico en la formación de colonias en las células no tratadas y tratadas con GSI. Panel derecho: Hubo una reducción significativa en la formación de colonias en células Rink-1 tratados con GSI comparación con las células de control.
Los valores P
representan comparaciones entre las células tratadas con GSI y el control utilizando el emparejado
t
prueba. Parte inferior, el panel de la izquierda: Caracterización de la apoptosis Se llevó a cabo después de yoduro de propidio (PI) y la tinción con anexina V-FITC con kit de detección de apoptosis seguido por análisis de citometría de flujo después de 48 h de tratamiento GSI de las células de Rink-1. El porcentaje de células apoptóticas aumentó de 10% en el control al 28 a 33% en GSI células tratadas. Panel derecho: la apoptosis inducida por GSI en las células de Rink-1. células de Rink-1 fueron expuestos a GSI durante 72 horas. La apoptosis se midió por histona DNA ELISA. Los valores se presentan como media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05, en comparación con el control. B, Arriba, el panel izquierdo, ensayo de invasión utilizando GSI células que muestran una baja penetración de las células a través de la membrana recubierta con Matrigel tratados, en comparación con las células control. Panel derecho: Los gráficos que muestran el valor de la fluorescencia de las células de Rink-1 invadidas. Los valores indican la cantidad comparativa de las células de Rink-1 invadidas. En pocas palabras, ensayo de cicatrización de la herida se realizó para evaluar la capacidad de la migración celular. tratamiento GSI disminuyó la migración celular en las células de Rink-1. C, GSI inhibió la actividad de unión a ADN de NF-kB en las células de Rink-1 según la evaluación de la EMSA. D, Real-time RT-PCR y Western blot mostró que la L-685458 inhibe la expresión de survivina, c-myc, Bcl-2, y los genes de uPA.
La inhibición de la vía de Notch causada por apoptosis la muerte celular en Pista-1 línea celular
a continuación, se investigó si los efectos inhibidores del crecimiento general de GSI son, en parte debido a la inducción de la apoptosis, que fue examinado por el uso de un ensayo basado en ELISA. Estos resultados proporcionan datos convincentes de que GSI indujo apoptosis en Pista-1 línea celular (Fig. 5A). Para confirmar estos resultados, también se utiliza la anexina V-FITC método para detectar la apoptosis inducida por GSI para los que se trataron células de Rink-1 con GSI durante 48 horas. Por tinción de las células con anexina V-FITC y PI, se utilizó el análisis FACS para distinguir y cuantitativamente determinar el porcentaje de células muertas, viables y apoptóticas después del tratamiento. Se encontró que el porcentaje de células apoptóticas aumentó de 10% en el control al 28 a 33% en las células de Rink-1 después del tratamiento GSI (Fig. 5A). Estos resultados proporcionaron datos convincentes que muestran que la inactivación de la vía de Notch podría inducir la apoptosis en 1 pista de células de cáncer pancreático.
La inhibición de la vía de Notch disminuyó la migración de células de cáncer y la invasión
vía de Notch se cree que es involucrado críticamente con los procesos de invasión de células tumorales y la metástasis. Estudios anteriores han demostrado que los tumores pancreáticos que surgen en el compuesto ratones KCI tienen una amplia invasión de los órganos adyacentes, incluyendo el duodeno, estómago, hígado, y el bazo [13]. Con el fin de comprender mejor si vía de Notch tiene un papel crítico en la invasión, hemos probado los efectos de la inactivación de la vía de Notch en la invasión de células de cáncer. Encontramos que las células GSI tratados mostraron un nivel más bajo de penetración a través de la membrana matrigel recubierto en comparación con las células de control. El valor de la fluorescencia de las células de cáncer de Rink-1 invadidas se redujo alrededor de 5-7 veces en comparación con la de las células control (Fig. 5B). Con el fin de examinar más a fondo el efecto de GSI en la migración celular y la invasión, se realizó herida ensayo de curación en las células de Rink-1. Los resultados muestran que el tratamiento GSI inhibe la capacidad de cicatrización de heridas en células de Rink-1 (Fig. 5B), lo que sugiere que GSI puede inhibir la migración celular y la invasión. Estos resultados sugieren un papel directo de la señalización de Notch en la migración celular de Rink-1 de cáncer y la invasión, y estos resultados son consistentes con la agresividad de los tumores desarrollados en el compuesto KCI animal transgénico.
La inhibición de la vía de Notch disminuyó NF-kB ADN vinculante actividad
Hemos investigado si el efecto aguas abajo de Notch-1 baja regulación mecánica se asoció con la ruta de NF-kB. proteínas nucleares de células GSI tratados fueron sometidos a análisis para la actividad de unión al ADN de NF-kappa B p65 como se mide por la EMSA. Los resultados mostraron que la actividad de unión a ADN-GSI, inhibió NF-kappa B p65 en comparación con el control (Fig. 5C). Estos resultados proporcionan evidencia en apoyo de una interferencia mecánica entre Notch y NF-kB en el cáncer de páncreas. Por otra parte, también se encontró que GSI inhibe NF-kB expresión génica aguas abajo, tales como survivina, Bcl-2, c-myc, y UPA (Fig. 5D).
El exceso de expresión de miR-200b inhibió la el crecimiento celular a través de ligandos dentados
Recientemente, se ha informado de que miembros de la familia miR-200 se dirigen a componentes de la ruta Notch, tales como Jagged-1 [35], [36]. Con el fin de examinar si la familia miR-200 a regular la vía de Notch, transfectadas precursor de miR-200b en células de Rink-1. Se confirmó que la transfección de precursor miR-200b aumentó el nivel relativo de miR-200b en las células de Rink-1 (Fig. 6A). La sobreexpresión de miR-200b disminución de los niveles de ARNm relativos de Jagged-1, Jagged-2 y sus genes diana por el tiempo real el ensayo de RT-PCR (Fig. 6A). Los datos de análisis de transferencia Western demostraron que la sobre expresión de miR-200b disminuyó los niveles de proteína relativos de Jagged-1 y su gen diana tal como Hes-1, Hey-1, y Bcl-2 (Fig. 6B). Por otra parte, se encontró que la sobre expresión de miR-200b inhibió el crecimiento celular en las células de Rink-1 (Fig. 6B). A continuación, detectamos si la inhibición de Jagged-1 podría inhibir el crecimiento celular. Jagged-1 siRNA redujo significativamente la expresión de Jagged-1 y su objetivo de Hes-1 y Hey-1 en el ARNm y los niveles de proteína (Fig. 6C). Además, hemos encontrado que la inhibición de Jagged-1 por Jagged-1 siRNA inhibe la Pista-1 de crecimiento celular (Fig. 6C), lo que sugiere que Jagged-1 podría ser un objetivo potencial para el cáncer de páncreas.
A, Panel izquierdo, Re-expresión de miR-200b se estableció en las células de Rink-1 por transfección con su precursor. El panel medio, Re-expresión de miR-200b no regula la expresión de los receptores Notch en las células de Rink-1. Panel derecho, Re-expresión de miR-200b regula la expresión de Jagged-1 y Jagged 2-ARNm en células de Rink-1. B, izquierda y el panel medio, Re-expresión de miR-200b inhiben la expresión de los genes diana Jagged-1 en el mRNA y los niveles de proteína en las células de Rink-1. Panel derecho, Re-expresión de miR-200b inhibió de Rink-1 ensayo de crecimiento celular mediante el ensayo de MTT. C, izquierda y el panel medio, Jagged-1 siRNA inhibieron la expresión del gen Jagged-1 objetivo Hes-1 y Hey-1 en el ARNm y los niveles de proteína en las células de Rink-1. Panel derecho, Jagged-1 siRNA inhibe Pista-1 ensayo de crecimiento celular mediante el ensayo de MTT.
Discusión
PDAC es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos [ ,,,0],1]. A pesar de algunos avances en la quimioterapia, la radioterapia y la técnica quirúrgica, la tasa de supervivencia general de cinco años es menor del 4% de todos los pacientes con diagnóstico de PDAC [1]. Estos resultados decepcionantes sugieren que se necesitan con urgencia nuevos y alternativos enfoques para la comprensión de los mecanismos de progresión PDAC. Los ratones transgénicos que son buenos modelos para identificar el papel patogénico de mutaciones de genes específicos y las rutas de señalización principales asociados con el cáncer de páncreas.
Se ha sabido que las mutaciones K-ras se observan en el 80% -90% de cáncer de páncreas. Oncogén K-ras está implicado en la iniciación o las primeras etapas en el desarrollo de PDAC. Por lo tanto, los ratones KC condicionales se consideran buenas herramientas para estudios sobre el mecanismo de la progresión del cáncer de páncreas. Dado que los ratones KC emular la evolución lenta de PanIN a cáncer invasivo en unos 12-15 meses [6], [37], pero los ratones criados KC con muchos otros ratones transgénicos mostraron un rápido desarrollo del PDAC. Por ejemplo, Smad4 /DPC4 haploinsuficiencia acorta la vida de los ratones KC para la supervivencia media de aproximadamente 8 meses [10]. LSL- K-ras
G12D; Pdx1-Cre; ratones Trp53R tienen una mediana de supervivencia acortado drásticamente de aproximadamente 5 meses [6]. La mediana del tiempo de supervivencia de ratones con KC heterocigosidad LKB1 fue de 4,5 meses [11]. PTEN haploinsuficiencia acorta significativamente la vida de los ratones KC a una supervivencia media de alrededor de 3,5 meses [9]. La heterocigosidad de p21 hizo que los ratones KC con una supervivencia media de 2,5 meses [11]. Un modelo de ratón de haber activado K-ras y Ink4a /deficiencia de Arf tuvieron una supervivencia mediana de 2 meses [13].