Extracto
El desarrollo del cáncer implica la predisposición genética y una variedad de exposiciones ambientales. todo el genoma vinculación análisis de aportar pruebas de la vinculación significativa de muchas enfermedades a los loci de susceptibilidad en el cromosoma 8p23, la ubicación del grupo de genes de defensina humana. beta-defensinas humanas (hBDs) son moléculas importantes de la inmunidad innata. Este estudio fue diseñado para analizar la expresión y las variaciones genéticas en hBDs (HBD-1, HBD-2, HBD-3 y HBD-4) y su posible asociación con el cáncer de colon. HBD expresión de genes y proteínas de expresión relativa se evaluaron mediante la reacción en tiempo real en cadena de polimerasa (qPCR) e inmunohistoquímica, respectivamente, de 40 pacientes normales y 40 pacientes de la misma edad con cáncer de colon en Arabia Saudita. Además, los polimorfismos HBD fueron genotipo por secuenciación del exón y por la metilación del promotor. HBD-1, HBD-2, HBD-3 y HBD-4 basal expresión del ARN mensajero fue significativamente menor en los tejidos tumorales en comparación con tejidos normales. Varias mutaciones de inserción se detectaron en diferentes exones de los hBDs analizados. Sin embargo, no se detectó metilación en cualquier promotores hBDs debido al número limitado de islas CpG en estas regiones. Hemos demostrado por primera vez un enlace entre la expresión de HBD y el cáncer de colon. Esto sugiere que existe una relación significativa entre la desregulación de la inmunidad innata a través de la interrupción de péptidos catiónicos (hBDs) y el posible desarrollo de cáncer de colon
Visto:. Semlali A, Al Amri A, A Azzi, Al Shahrani O, Arafah M, Kohailan M, et al. (2015) Expresión y Nueva Exon Las mutaciones de la beta defensinas humanas y su Asociación para el Desarrollo del cáncer de colon. PLoS ONE 10 (6): e0126868. doi: 10.1371 /journal.pone.0126868
Editor Académico: Isabelle A. Chemin, el CRCL-INSERM, Francia |
Recibido: 25 Julio, 2014; Aceptado: 8 Abril 2015; Publicado: Junio del 3, 2015
Derechos de Autor © 2015 Semlali et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. los autores extienden su agradecimiento al Decanato de investigación Científica de la Universidad rey Saud para financiar el trabajo a través del proyecto de grupo de investigación no: RGP-PPV-260 y por una subvención del Fonds Émile-Beaulieu (Fundación Universidad Laval)
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal ( CCR) es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado entre los hombres y el cuarto más común entre las mujeres en todo el mundo [1]. La Sociedad Americana del Cáncer estima que habrá más de 96.000 nuevos casos de cáncer de colon que conduce a unas 50.000 muertes en 2014 (Sociedad Americana del Cáncer 2014). En el Reino de Arabia Saudí (KSA), el cáncer de colon es una de las enfermedades más frecuentes [2], con una mediana de edad de 60 años para los hombres y 58 años para las mujeres [3]. El desarrollo del cáncer se ha informado que implicar factores genéticos [4], y también una variedad de exposiciones ambientales [5]. La susceptibilidad genética al cáncer es multifactorial, incluyendo alteraciones somáticas genéticos, tales como mutaciones en oncogenes o genes supresores de tumores [6], y los cambios en perfiles de expresión génica o la metilación del ADN. Perfiles de expresión génica ha ofrecido una nueva forma de clasificar los tumores humanos [7]. Sobre la base de los niveles de mRNA expresión de genes específicos, diferentes subtipos de cáncer pueden ser identificados. La metilación del ADN es el marcador epigenético más ampliamente estudiado [8]. ADN hipermetilación inducida por silenciamiento génico es un evento común en muchos tumores malignos, que actúa como un mecanismo alternativo a la mutación genética para afectar a la pérdida de funciones supresores de tumores [9,10]. El descubrimiento de la hipometilación del ADN global en tumores humanos fue seguido por la identificación de los genes supresores de tumores hypermethylated, y recientemente, la inactivación de microRNA (miRNA) por metilación de ADN también se ha descrito [11,12]. Esta forma de cambio epigenético puede contribuir a la iniciación del tumor y la progresión a través de silenciamiento transcripcional de genes supresores de tumores. De hecho, varios genes han demostrado ser epigenetically inactivada amplia gama ina de tumores [13]; por lo tanto, el concepto de un "perfil hipermetilación 'de los tumores puede tener potenciales aplicaciones clínicas [14-16]. hypermethylated genes pueden incluir los que participan en la regulación del ciclo celular (p16INK4a, p15, Rb) [17], la reparación del ADN (BRCA1, MGMT), resistencia (MGMT), la diferenciación celular, la angiogénesis (THBS1) y la metástasis [13]. Sin embargo, existe poca información sobre el papel de la desregulación de los genes de la inmunidad innata y su asociación con el cáncer de colon plausibles. Además, la evidencia para el papel del sistema inmune natural en la protección contra el desarrollo de tumores ha sido demostrado por estudios con pacientes inmunocomprometidos [18]. Está bien documentado que una respuesta inmune débil tiene una correlación directa e inversa con muchos tipos de cáncer [19,20]. Todas las células del cuerpo humano tienen múltiples líneas de defensa contra la transformación celular y el sistema inmunológico humano es una red maravillosa y bien coordinada de las células, órganos y glándulas que protege al cuerpo de desregulaciones fisiológicas inapropiadas. Un sistema inmunológico optimizado es la clave para una buena salud y la longevidad. Además, la respuesta inmune innata tiene especificidad considerable contra patrones moleculares conservados de componentes de microorganismos, que se denominan patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Los receptores en las células inmunitarias que reconocen PAMP se llaman receptores de reconocimiento de patrones (PRRS). Los receptores tipo Toll (TLR) son una clase importante de PRRS, y cada TLR reconoce una diferente PAMP [21-23]. La activación de una respuesta inmune innata procede aunque la unión a receptores de reconocimiento de patrones, tales como TLRs. Estos son los TLR sensores de las teclas de los patógenos invasores, en gran medida activados por agentes de inmunidad innata como las células epiteliales [23]. La cascada de señalización de TLR puede implicar la activación de la molécula adaptadora MyD88, y las dos cascadas de conducir a la activación de NF-KB para promover la transcripción de citoquinas pro-inflamatorias, quimioquinas y péptidos catiónicos también conocidos como beta-defensinas humanas (hBDs). Estos hBDs pertenecen a una familia de péptidos antimicrobianos que constituyen una parte importante de la defensa inmune innata. Hasta la fecha, cuatro hBDs (1-4) se han identificado en tejidos humanos. HBD-1 se produce constitutivamente por diversos tejidos epiteliales tales como el tracto respiratorio y la piel [24], mientras que las expresiones de hBDs son inducible [25]. Específicamente, HBD-2 es altamente expresado en células epiteliales normales después del contacto con microorganismos o de citoquinas (TNF e IL-1) la estimulación [26,27]
.
Su estructura genómica consiste en dos exones y un intrón. El primer exón codifica el péptido señal y el segundo codifica un péptido maduro precedido de un pro-péptido aniónico corto. El péptido maduro se obtiene después de la escisión proteolítica de la secuencia señal. A pesar de las bajas similitudes de secuencia entre estas proteínas, sus estructuras 3D tienen un pliegue topológico defensina-como similares que consta de tres hebras dispuestas en tres hojas antiparalelas constreñidos por tres puentes disulfuro intramoleculares [28,29]. Los beta-defensinas tienen un grupo de residuos catiónicos (Lys, Arg) cerca de los extremos carboxilo de los péptidos. Los aminoácidos cargados positivamente C-terminal juegan un papel determinante en la actividad antimicrobiana [30,29]. Las propiedades de carga e hidrofóbicas netas positivas promueven la interacción hBDs con las membranas microbianas. hBDs ejercen acción antimicrobiana directa y son activos contra bacterias, hongos y virus; en paralelo, según los últimos datos, que poseen múltiples actividades biológicas, en particular, los inmunomoduladores [29], y están implicados en la respuesta antitumoral.
El objetivo de este estudio fue investigar la desregulación del perfil hBDs la expresión de genes, las mutaciones de exones hBDs, y la metilación del promotor de hBDs, así como la asociación de estos hallazgos con la promoción del cáncer de colon en seres humanos. Desde un punto de vista clínico, proteínas que están implicadas en estas vías pueden servir como dianas para la terapia del cáncer, a través del uso potencial de HBD /TLR-inmunoterapia.
Resultados
Los datos clínicos de los pacientes diagnosticado con cáncer de colon mediante colonoscopia
Las características clínicas de 40 pacientes de Arabia Saudita, incluyendo la edad, la nacionalidad, antecedentes familiares, hábitos de fumar, la etapa del cáncer de colon, los medicamentos y la presencia de otras enfermedades, se recogieron y se compararon entre el cáncer de colon y los pacientes de control. La población inscrita incluye los no fumadores sin antecedentes familiares de cáncer de colon y sin alergias. La edad de la población de estudio osciló entre 45 y 75 años, con una media de 60 ± 16,56 años para los hombres y 55 ± 13,74 años para las mujeres (Tabla 1). También es interesante observar que un alto número de los participantes que sufren de cáncer de colon no estaban recibiendo quimioterapia o radioterapia.
Diferencial HBD expresión génica en tejidos de cáncer de colon
Para analizar la expresión de los diferentes hBDs (1-4) en el ARNm, la transcripción-PCR se realizó con los tejidos de cáncer de colon y los tejidos normales aislados del mismo paciente cuantitativa en tiempo real inversa. Como se muestra en la figura 1, los niveles de expresión de todos los hBDs se redujeron en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos normales. Específicamente, los niveles de HBD-1 disminuyó significativamente (p & lt; 0,0001) a partir de 0,99 ± 0,02 en los tejidos normales a 0,29 ± 0,14 en los tejidos de cáncer (Fig 1A). HBD-2 niveles bajaron de 1,03 ± 0,08 en los controles a 0,36 ± 0,18 en los tejidos de cáncer, con p & lt; 0.0001 (Fig 1B). HBD-3 disminuyó de 1,11 ± 0,11 en el tejido de control a 0,48 ± 0,09 en los tejidos de cáncer (Figura 1C), y HBD-4 se redujo de 0,99 ± 0,03 en los tejidos de control a 0,46 ± 0,10 en los tejidos de cáncer (Figura 1D) .
el ARN celular total recién extraído de tejidos normales y cancerosas de colon se transcribió de forma inversa en ADNc y luego se usa para medir la expresión de mRNA HBD (Panel1A a 1D).
comparación entre inmunohistoquímica diferentes péptidos antimicrobianos
Para confirmar los datos de expresión de ARNm, se determinó la expresión de la proteína hBDs por inmunohistoquímica. Como se muestra en la figura 2A, inmuno-tinción positiva para los hBDs general, se observó en las células epiteliales de colon normal y también en algunas células del estroma. Sin embargo, la intensidad de la tinción de todas las hBDs fue menor en los tejidos tumorales de adenocarcinoma de colon. Con el fin de determinar cuantitativamente la expresión diferencial de hBDs en tejidos de cáncer de colon en comparación con tejidos normales, se contaron las células positivas y se determinó un nivel de expresión arbitraria, tal como se presenta en la figura 2B a 2D. Estos resultados confirmaron los bajos niveles de hBDs en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos normales. El bajo nivel de proteínas HBD observado confirma el hallazgo de niveles bajos de expresión de genes HBD
.
Los tejidos fueron immunostained utilizando anticuerpos específicos HBD (Grupo 2A). hBD- células positivas en los tejidos se estima de la siguiente manera: 0 puntos, no hay color positivo; 1 punto, & lt; 20% de tinción positiva; 2 puntos, 21-50% de tinción positiva; 3 puntos, 51-75% de tinción positiva; y 4 puntos, & gt; 75% de tinción positiva. Esto se presenta en el Panel B.
La prevalencia de mutaciones de exones HBD en pacientes con cáncer de colon
Para investigar la asociación de mutaciones HBD y su menor expresión en pacientes con cáncer de colon, la secuenciación del exón se analizaron todos los hBDs. El
de novo
tasa de mutación de hBDs se ha estimado en la Tabla 2, para HBD-1; Se detectaron tres mutaciones en el exón 1 (dos en la región 5'UTR antes de la secuencia traducida y una en el promotor). Estas mutaciones no afectan a la estructura de la proteína, pero pueden influir en la expresión y estabilidad de mRNA. Otros dos mutaciones de inserción se detectaron en la región traducida del exón 2 que dio lugar a una proteína inmadura. También encontramos cinco mutaciones en la región 3 'no traducida (3'UTR). El 3'UTR es conocido por contener elementos reguladores que son esenciales para la expresión apropiada de varios genes. Se detectaron dos tipos de mutaciones: 8 (80%) eran inserciones y 2 (20%) eran transiciones. Como se indica en la Tabla 2, el mismo paciente puede contener una o más mutaciones en la región HBD1 (ejemplo T17 = cáncer de colon número de paciente 17 tenía 3 mutaciones diferentes del gen HBD-1). La mutación de transición en la 3'UTR del gen de HBD-1 no está asociado con el cáncer de colon, sino que está ligado a la población Arabia, ya que se encontró en todos los participantes normales y cancerosas, excepto en un caso (T4).
en HBD-2, se detectaron cuatro mutaciones totales en tejidos de cáncer de colon, pero no en los tejidos normales: tres en el promotor (mutación uno de transición y dos mutaciones de inserción), no hay mutaciones en las secuencias traducidas para el exón 1 y el exón 2, y dos mutaciones de transición en la región 3'UTR (una transición en el 3'UTR no está asociado con el cáncer de colon pero con la población Arabia). En HBD-2, se detectaron tres tipos de mutaciones: 1 (20%) era una transversión, 2 (20%) fue una inserción y 3 (60%) eran mutaciones de transición. Todas las mutaciones detectadas en HBD-2 no tienen ninguna consecuencia en la estructura de la proteína, pero puede afectar a HBD-2 en la expresión génica y la estabilidad. En HBD-3, todas las mutaciones (100%) fueron detectadas mutaciones de inserción (Tabla 2): se detectó una inserción en la región 5'UTR, una inserción se encontró en la secuencia traducida del exón 1, la inducción de un cambio de secuencia completa a partir de residuo 4, así como otras tres mutaciones en la región traducida del exón 2 (una de estas inserciones estaba cerca del codón de terminación), y se detectaron tres inserciones en la región 3'UTR del gen de HBD-3. Las inserciones 7 y 8 eran específicos de la población saudí y no se asociaron con el cáncer de colon; todos los tumores y todos los tejidos normales presentan estas mutaciones (Tabla 2). En HBD-4, se detectaron tres mutaciones en total: uno en el 5'UTR que no afectó a la estructura de la proteína HBD-4 y dos en el exón 2 que se genera una secuencia incompleta, completa con cambio de secuencia a partir de los residuos 22 y 56. Dos se detectaron tipos de mutaciones en HBD-4: 1 (30%) era una transición y 2 (60%) eran inserciones (Tabla 2). Sin embargo, no se detectó metilación en ningún promotores hBDs debido al limitado número de islas CpG en estas regiones.
Estructura-Función Análisis
Hemos examinado el producto génico de cada exón afectado por una marco de cambio mutación como consecuencia de las inserciones de nucleótidos observados. Las traducciones de secuencia resultantes para cada HBD con productos exón afectados se ilustran en las figuras 3 y 4. Las dos inserciones en el exón 2 de HBD-1, como se informa en la Tabla 2, provoca marco turno mutaciones después de la secuencia señal de péptido (Fig 3A) . En consecuencia, ninguna proteína HBD1 madura puede ser sintetizado. No inserción se encuentra en el exón 2 del gen HBD-2 humana (Figs 3B y 4B). Cinco inserciones fueron encontrados en el gen HBD-3 en el cáncer de colon. La inserción 1 da como resultado una mutación de cambio de marco a partir de residuos 3 en la secuencia de péptido señal, sin síntesis madura HBD-3 (Figura 3C). 2 de inserción provoca una mutación de cambio de marco que afecta a 5 de 6 residuos C-terminal, C63 → L, P → R64, R65 y K66 → K → E (Figura 3C). Además, una isoleucina insertado se encuentra en la secuencia de la HDB-3 mutada en el extremo C-terminal (Fig 3C). Para evaluar, la consecuencia de la mutación sobre la estructura de HBD-3, se construyó un modelo molecular HBD-3 con las mutaciones que afectan el extremo C-terminal. Fig 4C y 4D, ilustra las posiciones de las mutaciones en un modelo tridimensional de HBD-3 en comparación con la proteína de tipo salvaje. Como se muestra en la figura 4C y 4D, en tejido de cáncer, mutante 2 no se encuentra la tercera enlace disulfuro Cys63-Cys45 debido a la mutación Cys63 → Leu. Predecimos que este mutante tendrá una estructura menos estable que la de la proteína de tipo salvaje. S3 tabla se muestran los efectos de las otras mutaciones. Hemos calculado las predicciones de la estabilidad de las proteínas en la estructura molecular de HBD-3 utilizando tanto la música popular [31] y [32] programas CUPSAT. Figura 3C y Figura 4C y 4D se enumeran los tipos de mutación marco turno observados y los correspondientes efectos estabilizadores /desestabilizadores sobre la estructura HBD-3. Las mutaciones Cys63 → Leu y Arg64 → Pro afectan a los aminoácidos que están enterrados en la estructura y estaban decididos a ser energéticamente desestabilizadora, lo que sugiere una reducción de la estabilidad de la proteína. Las mutaciones Arg66 → Lys y Lys67 → Pro afectar solvente residuos expuestos y se determinó que eran energéticamente estabilización (Tabla 3). La inserción 3 en el exón 2 produjo Lys67 → Glu y la I68 adicional residuo, que no tienen ningún efecto sobre la estabilidad de la estructura. Inserción 4-2 produciría una proteína con una leucina adicional C-terminal (Figura 3C)
.
Las mutaciones están resaltados en rojo para cada gen hBDs.
en cuanto a HBD-4, la inserción 1 puede causar mutaciones marco de la jornada de partida dos residuos después de la secuencia del péptido señal, lo que resulta en la inhibición de la síntesis de la proteína madura HBD-4. Inserción 2 introduce una mutación de cambio de marco a partir de residuos de 55 a 63, produciendo un HBD-4 mutante de la proteína truncada
Discusión
El cáncer de colon es un riesgo significativo para la salud pública; se ha encontrado que es el segundo tumor maligno más frecuente en la población de Arabia [33] y fue el segundo lugar en las tasas de mortalidad por cáncer en los Estados Unidos [34]. Muchos mecanismos genéticos y epigenéticos se han determinado para contribuir al cáncer de colon, incluyendo CpG hipermetilación, no codificante alteraciones de ARN, mutaciones somáticas y acetilación de lisina de las histonas [35]. Muy pocos estudios se han centrado en las modificaciones epigenéticas responsables del desarrollo de esta enfermedad. En el presente estudio, hemos demostrado por primera vez un vínculo claro entre HBD expresión /producción y el cáncer de colon. Nuestros datos demostraron una reducción significativa de hBDs en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos normales. Estos datos apoyan los informados previamente con cáncer de HBD-1 pulgada renal o de próstata [36-38] y también en el carcinoma oral de células escamosas (COCE) [39,40]. Curiosamente, se registraron datos similares con HBD-2, lo que demuestra que HBD-2 mRNA y expresión de proteínas se redujo significativamente en el cáncer de las glándulas salivales [41]. Otros estudios utilizando diferentes líneas celulares de cáncer también han demostrado que HBD-2 puede controlar el crecimiento celular a través de la detención de la transición G1 /S y la activación de pRb en células epiteliales malignos [42]. HBD-3 es conocido para suprimir la migración de las células del cáncer [43]. En el carcinoma de células escamosas oral, beta-defensinas 1, 2 y 3 muestran efectos opuestos humanos sobre la proliferación celular. Por lo tanto, HBD-1 podría ser definido como un gen supresor de tumor, mientras que HBD-2 y -3 podría ser proto-oncogenes [44].
Se espera que la desregulación de la expresión génica para afectar a 1-3% de el transcriptoma [45], incluidos los genes de inmunidad innata cuya expresión está predominantemente las reguladas en tejidos de cáncer. La metilación del ADN de CpG ricas regiones promotoras está ganando reconocimiento como un mecanismo clave en la inactivación de los mismos genes implicados como los genes supresores de tumores y la inmunidad innata en las células del cáncer [46]. Otro mecanismo para la inactivación de genes es mutaciones somáticas. Tesis de mutaciones contribuyen a la formación de cáncer. Nuestra hipótesis es que la baja regulación de la expresión génica HBD en tejidos de cáncer de colon pueden deberse a la presencia de las modificaciones epigenéticas, en particular las mutaciones en los exones HBD. En cambio, no había metilación detectable en todos los hBDs promotores de tejidos de colon normales y cáncer de colon cáncer (datos no mostrados). Esto puede ser debido a la reducción del número de islas CpG en los promotores de HBD. Hemos confirmado que en los pacientes con una mutación de cambio de marco, la proteína hBDs estaban completamente ausentes. El creciente interés en las defensinas beta está mejorando constantemente nuestros conocimientos sobre diversos aspectos de su ubicación y los patrones de expresión de genes y los factores de transcripción implicados en su regulación. La estructura genómica HBD se compone de dos exones y un intrón. El primer exón codifica el péptido señal y el segundo codifica un péptido maduro precedido de un pro-péptido aniónico corto. Además de tener plegado similares de proteína y la estructura, las estructuras de HBD-1, -2, -3 y también han revelado que cada proteína está estabilizada por tres puentes disulfuro entre cisteínas conservadas. En este estudio, muchas nuevas mutaciones, generalmente inserciones, se detectaron en diferentes exones (1/2). Estas mutaciones contribuyen a cambios significativos en la estructura de la proteína de hBDs (es decir, HBD-1, HBD-3 y HBD-4). HBD-1 mutaciones y mutación 1 de HBD-3 son los más perjudiciales porque conducen a la pre-proteínas truncadas sin predijo la síntesis de proteínas HBD-1 madura. HBD-3 proteína de mutación 2 se desestabiliza en gran medida debido a la ausencia de un puente disulfuro causado por la sustitución de Cys63 → Leu. Además, en el mismo mutante, Lys67 → Glu sustitución introduce un, residuo ácido cargado negativamente en una sección C-terminal cargado positivamente, hidrófobo. Como se determinó que la agregación de cargas positivas en la sección C-terminal es importante para la actividad antimicrobiana [47], la introducción de un residuo cargado negativamente se predice que afectan a la función de la proteína. Ambos HBD-4 mutantes se predice que tienen no péptido funcional debido a cambios en la secuencia de la proteína. No predicción de estructura se podría realizar para este mutante porque su estructura no está disponible. Las otras mutaciones que se encuentran en la región promotora HBD se prevé que afectará a la expresión /estabilidad de las regiones reguladoras (5'UTR y 3'UTR) en tejidos de cáncer de colon, lo que explica por qué la expresión de estos hBDs se redujeron en tejidos de cáncer de colon en comparación con los tejidos normales. Se detectaron varios otras mutaciones en los intrones de todos los hBDs, que o bien existían principalmente en todos los tejidos en la población Arabia (normal y el cáncer) o sólo se encontraron en los tejidos de pacientes con cáncer de colon (datos no mostrados). Estas mutaciones intrón pueden tener un posible papel en el cáncer de colon, y este hallazgo requiere más investigación. Debido hBDs juegan un papel activo en el sistema inmune innato, la presencia de mutaciones en el exón hBDs puede conducir a la desregulación de la inmunidad innata y posteriormente dificultar la vigilancia inmunológica contra el desarrollo del cáncer de colon.
Materiales y Métodos
Otros reactivos
La escalera de ARN se obtuvo a partir de tecnologías Ambion /vida (Burlington, ON, Canadá). kits de ADN /ARN eran de Qiagen (Hilden, Alemania). Los cebadores se obtuvieron de Life Technologies /Invitrogen (Burlington, ON, Canadá). Los ADNc de alta capacidad de revertir kit de transcripción era de Applied Biosystems (Warrington, EE.UU.). SYBR Green se obtuvo de Bio-Rad (Mississauga, ON, Canadá). anticuerpos HBD se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, U.S.A.). HBD-1 (N-20) es anti-IgG de conejo para el terminal N, HBD-2 (C-17) es anti-IgG de cabra para el terminal N. HBD-3 (FL-67) es anti-IgG de conejo para el terminal N. HBD-4 (FL-72) es anti-IgG de conejo para el terminal N. Se obtuvo el kit de BACE Mega para la secuenciación de GE Healthcare Life Science (Buckinghamshire, Reino Unido), y se obtuvo el kit EpiTect bisulfito de metilación del ADN de Qiagen (Toronto, Canadá).
Las muestras de pacientes
se recogieron muestras de 40 pacientes diagnosticados de cáncer de colon (24 varones y 16 mujeres, entre 45 y 75 años, con una media de 60 ± 16,56 años para los hombres y 55 ± 13,74 años para las mujeres y 40 controles normales de la misma edad no hay cáncer. el estudio fue aprobado por el Consejo de la Comisión de Ética Institucional de Revisión del hospital Universitario de king Khalid en Riad, Reino de Arabia Saudita número 12/3352 /IRB. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes.
los tejidos normales en el margen distante al tumor se recogieron en el momento de la endoscopia. el diagnóstico del cáncer se basa en el estándar clínico, endoscópico, radiológico, y los criterios histológicos. clínica y se registraron las características demográficas, incluyendo la edad al momento del diagnóstico, el sexo, los antecedentes familiares, el tabaquismo hábitos, comportamiento de la enfermedad, localización de la enfermedad, y necesidad de cirugía (Tabla 1). Las muestras de tejido se utilizan para la extracción de RNA, la inmunohistoquímica, y extracciones de ADN genómico.
Las muestras de tejido para ser utilizados para el análisis de ARN se sumergieron inmediatamente en el ARN más tarde solución (Ambion, Courtabeuf, Francia).
aislamiento de ARN, la transcripción inversa y la expresión génica por tiempo real de RT-PCR
ARN de tejido total fue extraído utilizando el ADN /ARN Mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La concentración, pureza y calidad del ARN aislado se determinó a través de todo el sistema de Bio-analizador Agilent 2100 y el kit de análisis de Agilent Small RNA de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).
El ARN (1 g de cada muestra) fue transcrito inverso en ADNc usando un ADNc de alta capacidad inversa kit de transcripción (Applied Biosystems, Warrington, EE.UU.). Las condiciones para la preparación de los moldes de cDNA para el análisis de PCR fueron 10 min a 25 ° C, 2 horas a 37 ° C, y 5 min a 85 ° C. PCR cuantitativa (qPCR) se llevó a cabo como se describe anteriormente [48-50]. Las cantidades de los transcritos de ARNm se midieron utilizando el Applied Biosystems 7500 Fast tiempo real, sistema de detección por PCR. Las reacciones se realizaron usando un Green Supermix PCR Sybr de Applied Biosystems. Los cebadores se añaden a la mezcla de reacción a una concentración final de 250 nM. Cinco microlitros de cada muestra de ADNc se añadieron a una mezcla de PCR que contiene 20-l 12,5 l de SYBR Green Supermix y 0,5 l de cebadores específicos (hBDs o GAPDH (S1 Tabla)) y 7 l de RNasa agua /libre de DNasa. Cada reacción se realizó en un 7500 en tiempo real rápido PCR Thermal Cycler. Las condiciones de termociclado para el hBDs se establecieron como 5 min a 95 ° C, seguido por 36 ciclos de 15 s a 95 ° C, 30 s a 63 ° C (a excepción de HBD3 a 52 ° C), y 30 s a 72 ° C, con cada reacción hecho por triplicado. La especificidad de cada par de cebadores se verificó por la presencia de un único pico de temperatura de fusión. GAPDH produjo niveles de expresión uniformes que varían en menos de 0,5 TC entre condiciones de la muestra y por lo tanto se utilizó como gen de referencia para este estudio. Los productos amplificados se corrieron en un gel de agarosa para confirmar que no había productos espurios amplificadas durante los ciclos. Los resultados fueron analizados utilizando el 2
-ΔΔCt (Livak) método de expresión relativa.
bloques Preparación de las biopsias de inmunohistoquímica
embebidos en parafina de tejido de cáncer de colon y el tejido normal del colon muestras se cortaron en secciones de 3 micras de espesor. Las secciones se montaron en portaobjetos con solución salina recubierto y se incubaron durante 15 a 20 minutos en un horno de aire caliente a 60 ° C. Muestras de tejido fueron deparaffinized con EZ Prep (Ventana, Arizona, EE.UU.) a 75 ° C, el calor pre-tratada de la célula acondicionado 1 (CC1, Ventana, Arizona, EE.UU.), utilizando un protocolo de "acondicionamiento celular estándar" para la recuperación de antígenos en 100 ° C y, a continuación, se incubó con una gota de solución de inhibidor durante cuatro minutos a 37 ° C y posteriormente se lavan. Los portaobjetos se incubaron durante 32 minutos a 37 ° C con uno de los siguientes anticuerpos (diluido 1: 100): anti-humano-HBD-1, anti-humano-HBD-2, anti-humano-HBD-3 o anti- humano-HBD-4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.). A continuación, se añadió el anticuerpo secundario HRP UltraView universales multímero. El immunolocalizedhBD-1, HBD-2, HBD-3 y HBD-4 proteínas se visualizaron utilizando una reacción DAB cobre mejorada. controles en blanco negativos se prepararon durante la tinción, en el que se omitió y se sustituyó por PBS el primer anticuerpo. Las diapositivas fueron contra el teñidas con hematoxilina II y el reactivo de azulado (Ventana, Arizona, EE.UU.) durante 30 min a 4 ° C, y luego, se añadió líquido cubreobjetos (LCS) como una barrera entre los reactivos acuosos y el aire a evitar la evaporación, proporcionando de ese modo estabilidad de la muestra. Después de eso, las muestras para el montaje en DPX se deshidrataron mediante lavados secuenciales en alcoholes graduados: 70% de etanol, 96% de etanol y etanol absoluto y dos cambios en xileno. Después de eso, hemos añadido una pequeña gota de DPX al modelo que asciende medios de comunicación. Las secciones de inmuno-teñidas se analizaron mediante un microscopio óptico Olympus BX51 y una cámara digital Olympus DP72 (aumento de 200X y 400X) (Olympus America Inc., Center Valley, PA, EE.UU.).
Las puntuaciones fueron dados de acuerdo con el nivel y la gama de color de la siguiente manera: 0 puntos, no hay color positivo; 1 punto, & lt; 20% de tinción positiva; 2 puntos, 21-50% de tinción positiva; 3 puntos, 51-75% de tinción positiva; y 4 puntos, & gt;. 75% de tinción positiva
tratamiento de bisulfito
Para comprobar el estado de metilación de la región promotora tratamiento con bisulfito y la recuperación de las muestras fueron llevadas a cabo con el kit EpiTect bisulfito (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se utilizó 2 g de ADN en un volumen de 20 l para cada reacción y se mezcla con 85 l de la mezcla de bisulfito y 35 l de ADN proteger buffer. conversión de bisulfito se realizó en un termociclador de la siguiente manera: 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 25 min, 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 85 min, 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 175 min y 20 ° C de forma indefinida. El ADN tratado con bisulfito se recuperó mediante columna de centrifugación EpiTect y posteriormente se secuenció para confirmar la eficacia de la conversión de bisulfito. Se utilizó el ADN genómico eluido para la amplificación de la región promotora y la secuencia.
reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación
ADN genómico fue extraído de todas las muestras utilizando un kit de ADN de Qiagen (Hilden, Alemania). La concentración de ADN de cada muestra se midió usando un espectrofotómetro NanoVue ultravioleta. Todos los exones de los hBDs (1, 2, 3 y 4) se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cebadores (S2 tabla). Los pares de cebadores directo e inverso exón utilizados en las reacciones de PCR se describen en la Tabla S2. La mezcla de PCR contenía 50 ng de DNA, 5 pmol /L de cada cebador, 2.5nmol /ml cada dNTP, y 1,25 U Taq ADN polimerasa en 20 l de tampón con 0,04 mmol /L de Mg2 +. Después de un paso de desnaturalización a 94 ° C durante 5 min, se realizaron 35 ciclos de PCR, que incluía 45 s de desnaturalización a 94 ° C, 30 s para una hibridación a 60 ° C, y 45 s de extensión a 68 ° C. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Después de observar las bandas claras y de tamaño con precisión, los productos de amplificación fueron entonces purificados y secuenciados directamente en un sistema de detección de secuencia de Sanger (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA, EE.UU.).
Análisis estructural de las mutaciones
la estructura 3D de las defensinas beta humanas (Protein Data Bank entrada 1KJ6) [51] se utilizó para estimar el impacto de los genes seleccionados marco turno mutaciones en la estructura de la enzima.