Extracto
Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana extracelular de origen endocítica liberados por muchas células que se pueden encontrar en la mayoría de los fluidos corporales. Las principales funciones de los exosomas son la comunicación celular y los desechos celulares limpieza. Este estudio se realizó para determinar la participación de los exosomas en la regulación de la sensibilidad de la línea de cáncer de pulmón de células A549 con el cisplatino (DDP). Cuando se añadió a las células A549 DDP, la secreción de exosomas se fortaleció. La adición de los exosomas secretadas a otras células A549 aumentó la resistencia de estas células A549 a DDP. Tras la exposición de A549 a DDP, los niveles de expresión de varios miRNAs y mRNAs informes, asociados con sensibilidad DDP cambiado significativamente en exosomas; estos cambios pueden mediar en la resistencia de las células A549 a DDP. Los exosomas liberados por las células A549 durante la exposición DDP disminuyó la sensibilidad de otras células A549 a DDP, que puede estar mediada por miRNAs y el intercambio de ARNm por exosomas a través de la comunicación de célula a célula. Aunque el mecanismo detallado de la resistencia sigue siendo poco clara, se cree que la inhibición de la formación de los exosomas y la liberación podría presentar una nueva estrategia para el tratamiento del cáncer de pulmón en el futuro
Visto:. Xiao X, Yu S, S Li, Wu J , Ma R, Cao H, et al. (2014) Los exosomas: Disminución de la sensibilidad de las células del cáncer de pulmón A549 a cisplatino. PLoS ONE 9 (2): e89534. doi: 10.1371 /journal.pone.0089534
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Octubre, 2013; Aceptado 22 de enero de 2014; Publicado: 21 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Xiao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81.372.396) y los seis Talent pico de la Sala de Asuntos Humanos en la provincia de Jiangsu (N ° 40). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el Caner palabra y no de células pequeñas de pulmón (NSCLC) es la forma más común de cáncer de pulmón. Los pacientes con un tumor tan agresivo tienen una tasa de supervivencia de cinco años pobre menos de 20%, lo que es más probable atribuir a la enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico. A pesar de que varios fármacos diana tales como erlotinib y cetuximab podría aumentar la supervivencia global de los pacientes con CPNM, la quimioterapia con platino doblete sigue siendo el tratamiento más importante para los pacientes con NSCLC avanzado.
Platino (DDP) es un agente que daña el ADN podría entrar en las células tumorales y causar acuación y la hidrólisis para formar especies de platino reactivos [1]. Aquated DDP reconoce generalmente ADN como el objetivo principal e interactúa con el ADN, lo que lleva a la formación de entre hebras y /o reticulaciones intrastrand [2]. El sistema de respuesta de daño de ADN (DDR) y diversas vías de señalización se activan [3], y los niveles de expresión de ARN podrían ser influenciados en consecuencia [4]. Muchos pacientes presentan ya sea falta de sensibilidad innata a la droga o DDP-insensibilidad recurrente de la enfermedad después de un periodo inicial de tratamiento. Múltiples mecanismos están implicados en la regulación de la sensibilidad de las células tumorales a DDP; Estos mecanismos incluyen la acumulación intracelular y flujo de salida de DDP [5], la capacidad de reparación del ADN, la tolerancia a las lesiones del ADN no reparadas [6], y la regulación de varios genes [7].
Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana extracelular, lo que podría ser secretada por muchos tipos de células tumorales y existen en la mayoría de fluido corporal [8], [9]. Independientemente de su origen, exosomas tienen composiciones similares de proteínas, que pueden clasificarse en tres grupos principales: proteínas balsa auténticos, citoesqueleto, como las proteínas y las proteínas de choque térmico [10]. vesículas internas se forman por la incipiente hacia el interior de las células conocidas como endosomas multivesiculares (MVE). La fusión del MVE con la membrana plasmática conduce a la liberación de las vesículas internas denominadas exosomas [11]. Los exosomas podrían viajar a las células circundantes o tejidos distantes para mostrar funciones, tales como la estimulación inmune, supresión inmunológica [12], la inducción de la proliferación y la tolerancia [13] - [15], transferencia de material genético [10] y la recolección de basura [16]. Los exosomas contienen una cantidad sustancial de ARN y pueden ser transferidos de una célula a otra [10], lo que contribuye a la proliferación y la metástasis de cáncer y el desarrollo del cáncer [13], [14], [17], [18]. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, se desconoce la implicación de los exosomas en la regulación de la sensibilidad de las células de cáncer de pulmón de DDP.
Una vez expuesto a DDP, las células tumorales por lo general se adaptan al microambiente y se ajustan a la estimulación. Puesto que se notifican los exosomas estar involucrado en la comunicación celular, la hipótesis de la posible participación de los exosomas en la regulación de las respuestas de células A549 a DDP. Específicamente, exosomas liberados por las células A549 durante la exposición DDP pueden alterar la sensibilidad de las células que rodean a DDP. Además, los ARN exosomal pueden ser transferidos de una célula a otra [10]. Como tal, supone que algunos miRNAs y mRNAs según los informes relacionados con la resistencia DDP pueden ser transferidos de una célula a otra por exosomas. MiR-21, miR-98, miR-133b, miR-138, miR-181 y miR-200c [19] - [24] Según los informes asociados con la regulación de sensibilidad DDP, mientras que ERCC1, BRCA1 y RRM1 [25] - [27 ] estaban relacionados con la resistencia a DDP. Para probar nuestra hipótesis, se seleccionaron estos miRNAs y mRNAs para estudiar de forma preliminar su participación en el proceso de resistencia DDP.
Resultados
Caracterización de exosomas liberados por las células A549
Para asegurar el aislamiento exitoso de exosomas, los exosomas recogidos fueron observadas por TEM (microscopio electrónico de transmisión) y se analizaron por Western blot (Figura 1A). grupos microvesículas exhibieron vesículas redondas de 30 a 100 nm de diámetro (Figuras 1B, 1C). La figura 1D muestra la expresión de CD63, un miembro de la familia tetraspanin que se localiza en vesículas internas exosomal, como banda dual en exosomas y como una banda de luz en las células.
método de aislamiento (A) exosome utilizado en este estudio. (B, C) La transmisión de microscopía electrónica de imagen de los exosomas. Los exosomas son pequeñas vesículas de medición de 30 nm a 100 nm de diámetro. (D) Western blot de CD63 y β-actina en las células y los exosomas.
Celular efecto de las células A549 a cisplatino
Evaluación dosis-respuesta se llevó a cabo en este estudio. Se seleccionó una concentración de 3 mg /ml DDP para nuestro protocolo ya que esta dosis causó la muerte de aproximadamente el 50% de las células A549 (Figuras 2A, 2B). Para probar el efecto de DDP sobre la liberación de los exosomas, exosomas se cuantificaron con BCA; la curva estándar de proteína se muestra en la Figura 2C. Como se muestra en la Figura 2D, la cantidad de exosomas liberado por cada celda durante la exposición DDP fue mayor que en condiciones normales, lo que indica un aumento significativo en exosomas liberados por las células A549 tras la exposición a DDP.
(A) dosis respuesta entre la viabilidad de las células A549 (%) y la concentración de cisplatino (1-10 mg /ml) durante 48 h. (B) Imagen microscópica de las células A549 tratadas con 0 y 3 mg /ml de cisplatino. Las imágenes se obtuvieron con un aumento de 100 x. (C, D) Cantidad de exosomas determina a través de la curva estándar BCA y una mayor secreción de exosomas normalizados para el número de células después de la exposición de las células A549 con el cisplatino. (E) los niveles de expresión diferencial de los seis miRNAs en las células después de la exposición de las células A549 con el cisplatino. (F) Diferencial de los niveles de expresión de los dos miRNAs en exosomas después de la exposición de las células A549 con el cisplatino. (G) los factores de cambio en la expresión de miR-21 y miR-133b en exosomas son más altos que los de las células. Las barras indican el promedio ± SD de tres repeticiones. * Indica p. & Lt; 0,05 frente a los grupos de control
Para determinar si podía exosomas información de transporte, las expresiones de los seis miRNAs proponen en este documento se detectaron en las células y los exosomas. Los seis miRNAs podría ser detectada en las células, mientras que sólo el miR-21 y 133b puede ser detectada en exosomas (el valor Ct de los otros cuatro miRNAs superó 40). Para probar la influencia de DDP en los niveles de expresión de miRNAs en las células y los exosomas, se detectaron los niveles de expresión de estos seis miRNAs en las células y los exosomas tras la exposición de las células A549 a DDP. Como se muestra en las figuras 2E y 2F, los niveles de expresión de miR-21, miR-133b, miR-98, miR-181 aumentó en las células, mientras que las expresiones de miR-21 y 133b se incrementaron en exosomas. Los factores de cambio en la expresión de miR-21 y miR-133b en exosomas también fueron superiores a los de las células (Figura 2G).
Los exosomas disminuir la sensibilidad de las células A549 a DDP
Para determinar exosomas absorción por las células A549, exosomas se marcaron por DID y co-incubaron con células A549 durante 3 h, después de lo cual la microscopía de fluorescencia se realizó. Como se muestra en la Figura 3B, exosomas podrían ser absorbidos por las células circundantes. Para determinar si los exosomas podrían influir en la sensibilidad de A549 a DDP, exosomas liberados por las células A549 en condiciones normales y en condiciones DDP se recogieron y se añadieron a las células. Como se muestra en las figuras 3A y 3C, exosomas liberados por las células A549 bajo exposición DDP podían disminuir la sensibilidad de otras células A549 a DDP, mientras que los exosomas liberados por las células A549 en condiciones normales tenían poca influencia sobre la sensibilidad de las células A549 a DDP. Debido a que los exosomas liberados por las células A549 en condiciones normales no influyó en la sensibilidad de las células que rodean a DDP, hemos elegido para estudiar la función de los exosomas liberados por las células A549 bajo exposición DDP solamente.
(A) Pretratamiento de las células A549 con exosomas liberados durante cisplatino (3 mg /ml) la exposición disminuye la sensibilidad de las células a cisplatino en aproximadamente un 20% en comparación con aquellos sin tratamiento previo durante 48 h. (B) La captación de exosomas (rojo) por células A549 después de una incubación de 3 h se visualizó por microscopía. Barra de escala: 50 micras. (C) Imagen microscópica de las células A549 cultivadas bajo cuatro condiciones [de control, exosomas, DDP (3 mg /ml), exosomas + DDP] para 48 h. Las imágenes se obtuvieron con un aumento de 100 x. * En (A) indica p & lt; 0,05 frente a los grupos de control
Los exosomas influir en los niveles de expresión de ARNm celulares miRNAs y
Para probar posibles alteraciones en la expresión de miRNAs y mRNAs en células. como resultado de exosomas liberados por las células A549 durante la exposición DDP, se detectaron los niveles de expresión de estos miRNAs y mRNAs después de las células fueron expuestas a exosomas. Como se muestra en la figura 4A, el nivel de expresión de miR-21 aumentó mientras que los niveles de expresión de miR-98, 133b, 138, 181, y 200c disminuyeron. La Figura 4B muestra un aumento en los niveles de expresión de ERCC1, BRCA1, y RRM1. Además, como se muestra en las figuras 4C y 4D, después de las células A549 se trataron con DDP, los relativos factores de cambio de estos miRNAs y mRNAs en células pretratadas con exosomas variaron de los relativos de plegado cambios observados en células cultivadas en condiciones normales.
Los niveles de expresión de miRNAs (A) y ARNm (B) en condiciones normales con y sin tratamiento previo exosomas. Los factores de cambio en la expresión de miRNAs (C) y ARNm (D) bajo cisplatino con y sin tratamiento previo exosomas. Las barras indican el promedio ± SD de tres repeticiones. * Indica p. & Lt; 0,05 frente a los grupos de control
Discusión
A lo mejor de nuestro conocimiento, nuestro estudio es el primero en demostrar la participación exosomas en la regulación de la sensibilidad de los A549 de cáncer de pulmón células a DDP. Se encontró que la exposición de células A549 a DDP podría causar que las células para liberar más exosomas que en condiciones normales y que la interacción de estos exosomas con otras células A549 podría aumentar la resistencia de estas células A549 a DDP. Nuestro estudio demuestra en primer lugar que cuando las células A549 se exponen a DDP, los niveles de expresión de varios miRNAs y mRNAs según los informes relacionados con el cambio de sensibilidad DDP significativamente en los exosomas y que estos cambios probablemente median la resistencia de las células A549 DDP.
Una vez expuesto a DDP, las células cancerosas se adaptan a los cambios en el medio ambiente para sobrevivir. Sistema de Respuesta de daños (DDR) y de señalización diversa vías de ADN son entonces inducidas. Algunas células pueden reparar este daño y pasar por los puestos de control del ciclo celular, mientras que otras células no son capaces de reparar las lesiones y por lo tanto someterse a la muerte celular por apoptosis o senescencia celular. Como se muestra en la Figura 2A, aproximadamente la mitad de las células murió tras la exposición de las células A549 a 3 mg /ml DDP, mientras que los contenidos y los procesos celulares de células supervivientes se alteraron en el nivel transcripcional. Como se muestra en la Figura 2E, los niveles de expresión de miR-21, miR-133b, miR-98 y miR-181 detectados en este trabajo variado. contenido de ARN en exosomas informes, difieren a partir del ARN de células del donante [10], y las expresiones diferenciales de miRNAs exosomal dependen tanto del origen de las células y el medio ambiente. Figura 2G muestra que bajo tratamiento DDP, los niveles de expresión diferencial de miRNAs en exosomas diferían de los de las células. Y como se muestra en la figura 2E y 2F, miRNAs expresiones celulares eran diferentes de miRNAs exosomal expresiones. Además, los niveles de expresión de miRNAs variaron en las células cultivadas en diferentes condiciones, lo que indica que el contenido miRNAs en exosomas pueden ser reguladas de acuerdo sobre el estado biológico de las células.
Durante la exposición DDP, exosomas liberados por cada célula sobrevivir incrementar y algunos de los DDP es exportada por estos exosomas [16]. Exosomal miRNAs están a continuación, medió en la comunicación de célula a célula [10]. La Figura 3B, 4A, y 4B muestran que los exosomas llevar mensajes podría ser especialmente captado por las células de los alrededores y contenidos celulares se alteran en consecuencia. Estos mensajes pueden contener información de peligro inminente, y el contenido en exosomas siempre depende de la condición en la que los exosomas son liberados. Cuando las células se trataron con un segundo ciclo de DDP, fueron influenciados los niveles de transcripción. Como se muestra en la Figura 4C, y 4D, las células pretratadas con exosomas demostraron cierta preparación para el segundo ciclo de tratamiento DDP y los niveles transcripcionales inducidos en las células diferentes.
Cuando se expone a DDP, se estimularon las células A549 y el nivel de expresión de miR-21 aumentó. Debido a que el nivel de expresión de miR-21 en exosomas también aumentó significativamente y exosomas podría ser especialmente captado por las células circundantes, inferimos que los exosomas podría mediar más miR-21 a otras células. De hecho, se observó un aumento en el nivel de expresión de miR-21 en otras células, lo que sugiere que la expresión regulada por incremento de miR-21 [19] disminuye la sensibilidad de las células de cáncer de pulmón a DDP. Cuando se expone a DDP, una vez más, las células recibieron una segunda estimulación y respondieron con menos fuerza. Los niveles de expresión de miR-21 aumentaron pero no tan significativamente como en el primer cambio. El nivel de expresión de miR-133b también aumentó después de las células A549 fueron tratados con DDP. Los exosomas que median miR-133b podrían ser especialmente captado por las células que rodean e influyen en los niveles de transcripción de otras células. En cuanto a la abundancia de miR-133b externa podría estar mediado en las células, la expresión de miR-133b en las células podría ser alimentado de nuevo a disminuir. La expresión downregulated de miR-133b [28] se ha demostrado que disminuye la sensibilidad de las células de cáncer de pulmón a DDP. Después de un segundo ciclo de tratamiento DDP, las células con una mala expresión de miR-133b respondieron y el nivel de expresión de miR-133b aumentó evidentemente.
Muchos investigadores han expresado diversas opiniones sobre la función de los exosomas para influir en las respuestas celulares a estimulación, y estas funciones de exosomas han dependido siempre del tipo de estimulación. Maria Eldh et al. argumentaron que exosomas influyen en la respuesta de las células receptoras a un estímulo de estrés externo por ARNs que median de una célula a otra [29]. Claire Corcoran et al. encontraron que los exosomas contribuyen en parte a la comunicación celular, lo que resulta en la mediación de docetaxel-resistencia a las células secundarias [15]. Nuestro estudio demostró una mayor participación de exosomas en la regulación de la sensibilidad de las células A549 a DDP DDP durante la exposición y que esta influencia es, probablemente, regulada por exosomas. Sin embargo, existen varias insuficiencias y deficiencias en este trabajo, y el mecanismo detallado de la resistencia DDP serán investigados más en nuestro próximo estudio.
En este estudio, hemos demostrado que los exosomas liberados por las células A549 expuestas a DDP podían comunicarse con otras células y la influencia de la resistencia de estas células a DDP. Aunque aún no está claro mecanismo detallado, creemos que la inhibición de la formación y liberación de exosomas podría presentar una nueva estrategia para el tratamiento futuro del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Cell Culture
las células de pulmón humano línea celular de cáncer adenocarcinoma A549 bien caracterizado (Shanghai Instituto de Investigación celular, china) se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Nanjing Kaiji Biología, china) suplementado con 10% FBS (suero bovino fetal, Hyclone Laboratories, EE.UU. ) a 37 ° C y bajo 5% de CO
2. Las células se inocularon en una placa de 96 pocillos a una densidad celular de 6 x 10
3 células /pocillo, y la evaluación de dosis-respuesta de DDP a las células A549 se realizó con un recuento de células kit-8 (CCK-8; Dojindo , Kumamoto, Japón).
Aislamiento y Caracterización de exosomas liberados por las células A549
Para reducir la influencia de los exosomas en FBS, FBS se agotó de exosomas por ultracentrifugación a 200.000 xg a 4 ° C durante 16 h (Beckman 70 Ti rotor). Después de permitir que las células se unan durante la noche, el medio se reemplazó con medio RPMI-1640 y 10% exosome empobrecido en FBS. Después de 48 h, el medio de cultivo se recogió para recoger exosomas. Los exosomas aislamiento (Figura 1) se realizó utilizando una ultracentrífuga Beckman (70 de rotor Ti) y solución de precipitación exosome ExoQuick-TC (Sistema Biosciences, Mountain View, CA, EE.UU.).
Los exosomas disuelven en 200 l de fosfato solución salina tamponada (PBS) se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteína BCA mejorado (Beyotime Biotechnology, china). El tamaño y la morfología de partícula de exosomas disueltos en PBS se caracterizaron por medio de un microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEM-2100, JEOL, Tokio, Japón). Total de las proteínas celulares y exosomal se extrajeron, respectivamente, de las células y los exosomas usando tampón SDS de lisis (250 nM Tris-HCL, pH 7,4, 2,5% SDS). Las proteínas (10 mg /ml) se separaron en 10% de geles de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Los anticuerpos utilizados para inmunotransferencia incluyen CD63 (Sistema Biosciences, Mountain View, CA, EE.UU.) y β-actina (Sigma-Aldrich). Usando una solución de quimioluminiscencia (kit ECL, Pierce), se observaron bandas de proteínas usando XRS Molecular ChemiDoc Imagen + (Bio-Rad).
La captación de exosomas y de análisis de la viabilidad
Los pellets se resuspendieron exosome en 1 ml de solución salina phosphatebuttered (PBS) que contenía 5 mg /ml DiD (Biotium, EE.UU.) durante 30 minutos. La solución resuspendida se centrifugó a 200.000 xg durante 2 h, y se añadieron los sedimentos resuspendidos-PBS a las células A549. imágenes de fluorescencia se realizó posteriormente mediante microscopía confocal.
Para evaluar el efecto de los exosomas en la sensibilidad de las células a DDP, 6 × 10
3 células /pocillo fueron sembradas en una placa de 96 pocillos con RPMI 1640 que contiene 10% de SFB exosome-agotada. Después de 24 h, exosomas liberados por las células A549 en condiciones normales y tratados con DDP se añadieron a las células correspondientes a una relación de 5: 1 (exosomas cosechado de 5 ml de sobrenadante, se añadieron a las células cultivadas en 1 ml de medio de cultivo) para 3 h. Se añadió el mismo volumen de PBS sin exosomas de células utilizadas como el grupo de control. Para los ensayos de citotoxicidad, se aplicó 3 mg /ml DDP a los pocillos durante 48 h y la viabilidad celular total se evaluó mediante un recuento de células kit-8 (CCK-8).
Aislamiento de ARN y análisis
ARN exosomal fueron aislados utilizando un kit de aislamiento de mirVana microARN (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) y se eluyó en 100 l de solución de elución calentado según el protocolo del fabricante. ARNs celulares se obtuvieron utilizando Trizol® metodología de extracción (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) y se eluyeron en 30 l de ddH
2O.
Mirna se tallo-bucle a transcripción inversa (RT) con el kit de transcripción inversa miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). RT-PCR se realizó por triplicado usando TaqMan miRNA ensayo (Applied Biosystems). Una mezcla de genes específicos de la sonda (miR-21, 000.397; miR-98, 000577; miR-133b, 002.247; miR-138, 002,284; miR-181, 000,480; miR-200c, 002 300) se utilizó en este estudio. U6 snRNA se utilizó como control interno para el ensayo de TaqMan miARN para detectar el nivel de expresión de miRNAs en las células; miARN [
elegans Caenorbabditis no humanos sintéticos
miARN miR-39 (cel-miR-39); Takara Bio Inc., Tokyo, Japón], se añadieron en normalizar el volumen exosoma en el inicio de aislamiento de ARN.
TaqMan Low Density Custom array RT-PCR (Confinder Bio., China) se aplicó para detectar mRNA expresión, y GAPDH fue seleccionado como el control interno. Análisis de la expresión génica se realizó mediante ABI Prism 7900 secuencia sistema de detección de software interno D (Applied Biosystems).
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando de Student
t-pruebas
cuando se comparan dos grupos (PASW Statistics 18.0), y p. & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo