Extracto
Antecedentes
periostina, inducida por IFN proteína transmembrana 1 (IFITM1) y sin alas tipo MMTV la familia del sitio de integración, 5B miembro (Wnt-5b) se identificaron previamente como la invasión promovida genes de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) mediante la comparación de los perfiles de expresión génica entre los padres y un clon altamente invasiva. Hemos informado anteriormente de que periostina y IFITM1 promovieron la invasión de las células HNSCC. Aquí hemos demostrado que la sobreexpresión de Wnt-5b promovió la invasión de las células HNSCC. Por otra parte, estromelisina-2 (metaloproteinasa de matriz 10; MMP-10) se identificó como un gen regulado-up común entre periostina, IFITM1 y células HNSCC Wnt-5b que sobreexpresan mediante el uso de conjuntos de datos de microarrays. En este estudio, se investigó el papel de la MMP-10 en la invasión de los CECC.
métodos y las conclusiones
Se examinó la expresión de MMP-10 en los casos HNSCC por inmunohistoquímica. Alta expresión de MMP-10 se observa con frecuencia y se correlacionó significativamente con la capacidad de invasión y metástasis en los casos HNSCC. A continuación, examinó el papel de la MMP-10 en la invasión de células HNSCC
in vitro
. sobreexpresión ectópica de MMP-10 promueve la invasión de las células HNSCC, y la caída de la MMP-10 suprime la invasión de las células HNSCC. Por otra parte, la MMP-10 desmontables suprime la invasión promovida-Wnt-5b y periostina. Curiosamente, MMP-10 sobreexpresión induce la actividad p38 disminuido y MMP-10 desmontables indujo el aumento de la actividad p38. Además, el tratamiento con un inhibidor de p38 SB203580 en células HNSCC inhibe la invasión.
Conclusiones
Estos resultados sugieren que la MMP-10 juega un papel importante en la invasión y la metástasis de HNSCC, y que invasión impulsado por MMP-10 se asocia parcialmente con la inhibición de p38 MAPK. Sugerimos que la MMP-10 puede ser utilizado como un marcador para la predicción de metástasis en HNSCC
Visto:. Deraz EM, Kudo Y, Yoshida M, M Obayashi, Tsunematsu T, Tani H, et al. (2011) MMP-10 /estromelisina-2 promueve la invasión de cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 6 (10): e25438. doi: 10.1371 /journal.pone.0025438
Editor: Torbjorn Ramqvist, Instituto Karolinska, Suecia |
Recibido: 24 Enero, 2011; Aceptado: 5 Septiembre 2011; Publicado: 5 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Deraz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado en parte por el Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura de Japón subvenciones-en-ayuda (Y. Kudo y T. Takata) y la beca de la Fundación Memorial Kurozumi (Y. Kudo). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) es uno de los tipos más comunes de cáncer humano, con una incidencia anual de más de 500.000 casos en todo el mundo [1]. A pesar de los avances de las estrategias de tratamiento, la tasa de mortalidad y el fracaso de tratamiento en pacientes HNSCC siguen siendo altos. La alta mortalidad y mal pronóstico de los CECC se predicen la aparición de metástasis en los ganglios linfáticos, que es un evento común en pacientes con cáncer [2]. CECC se desarrolla a través de la acumulación de múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas en un proceso de múltiples pasos [3]. Los intentos de identificar los genes implicados en la metástasis son fundamentales para la predicción temprana de la conducta CECC. El proceso de la metástasis consiste de pasos secuenciales y selectivos que incluyen la proliferación, la inducción de la angiogénesis, el desprendimiento, la motilidad, invasión en circulación, la agregación y la supervivencia en la circulación, la detención celular en lechos capilares distantes y la extravasación en el parénquima de órganos [4], [5] . La identificación de nuevos invasión y moléculas relacionadas con la metástasis en HNSCC y una mejor comprensión de los mecanismos por los que las células de carcinoma se someten durante los pasos de la invasión y la metástasis son de importancia fundamental para el diseño de estrategias terapéuticas mejor para el tratamiento de esta enfermedad.
microarrays de expresión génica han surgido y su uso generalizado ha dado lugar a la identificación de posibles genes candidatos. Más investigación de los comportamientos biológicos y el resultado clínico significativo de estos genes en particular en los CECC es de gran interés. Hemos establecido con anterioridad una línea celular HNSCC, la CMM-1, a partir de la metástasis de los ganglios linfáticos [6]. Por otra parte, se aisló un clon altamente invasiva CMM-Inv1 a partir de células MSCC-1 mediante el uso de un
in vitro
dispositivo de ensayo de invasión en [7]. A continuación, se comparó el perfil transcripcional de las células de los padres (MSCC-1) y un clon altamente invasiva (CMM-Inv1) por el análisis de microarrays con el fin de identificar los genes que difieren en su expresión [8]. Varios genes se sobreexpresa de forma selectiva en el clon altamente invasiva. Entre estos genes, periostina (factor-2 específica de osteoblastos (fasciclina me gusta)) era el gen más altamente expresado y el segundo fue IFITM1 (proteína transmembrana inducida por IFN-1). De hecho, hemos demostrado que periostina y IFITM1 promovieron la invasión ambos
in vitro
y
in vivo
[8], [9]. También se identificaron MMTV de tipo wingless familia del sitio de integración, miembro de 5B (Wnt-5b) como el tercer gen altamente expresado en MSCC-Inv1. A continuación, se confirmó la capacidad de Wnt-5b para promover la invasión de las células HNSCC
in vitro.
Además, identificamos la metaloproteinasa de matriz 10 (MMP-10) como un gen upregulated común por parte de las moléculas de invasión promover entre ellos periostina , IFITM1 y Wnt-5b. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) representan una familia de proteinasas dependientes de zinc que son capaces de degradar los componentes de ECM tales como colágenos y proteoglicanos y que tienen un papel en el desarrollo normal y el daño tisular en diversas condiciones fisiopatológicas que implican artritis, cicatrización de heridas y el desarrollo de tumores [10 ]. MMPs se pueden clasificar en subgrupos que incluyen; colagenasas, gelatinasas, estromelisinas y MMP tipo membrana [11]. Algunos miembros de las MMP están implicadas en la invasión y metástasis en HNSCC tales como MMP-2, la membrana de tipo 1 MMP (MT1-MMP), y MMP-9 [12], [13]. La sobreexpresión de estas MMPs se ha correlacionado con la invasión, metástasis y mal pronóstico. En el presente estudio, se investigó el papel de la MMP-10 en la invasión de los CECC.
Resultados
Wnt-5b promueve la invasión de los CECC
Wnt-5b es un miembro de la familia de genes Wnt, un grupo de glicoproteínas secretadas que juega un papel importante en la oncogénesis y en varios procesos de desarrollo y desencadena respuestas intracelulares a través de diversas vías de señalización. Al comparar el perfil transcripcional de las células de los padres y el clon altamente invasiva de análisis de microarrays, Wnt-5b fue la tercera gen altamente expresado en el clon altamente invasiva después de periostina y IFITM1. En primer lugar, examinamos si Wnt-5b participó en la invasión de los CECC. La mayor expresión de Wnt-5b en el clon altamente invasiva en comparación con las células parentales se verificó por RT-PCR (Figura 1A). Se examinó la expresión de ARNm de Wnt-5b en seis líneas celulares CECC. expresión de ARNm de Wnt-5b se observó en casi todas las líneas celulares excepto HNSCC celular HSC4 (Figura 1A). Para aclarar el papel de Wnt-5b en la invasividad de CECC, generamos la Wnt-5b que sobreexpresan las células por transfección de Wnt-5b en células HSC4 sin expresión de Wnt-5b. Después de conseguir el clon estable de células-5b-overexpressing Wnt (Figura 1B), que se utilizaron para comprobar la capacidad de invasión por
vitro
ensayo de invasión en. la sobreexpresión de Wnt-5b aumentó significativamente la invasión de las células HNSCC
in vitro
(Figura 1B). Para confirmar la invasión promovida-Wnt-5b de las células HNSCC, se analizó la caída de Wnt-5b mediante el uso de siRNA en células HSC2 con alta expresión de Wnt-5b. El tratamiento de siRNA Wnt-5b redujo la expresión de ARNm de Wnt-5b y se inhibe significativamente la invasión (Figura 1B). Aunque Wnt-5b no afectó el crecimiento de células (Figura 1C), promovió significativamente la motilidad celular de las células HNSCC como se demuestra por el ensayo de curación de la herida (Figura 1D). Curiosamente, siRNA Wnt-5b inhibió significativamente la motilidad celular de las células HNSCC (Figura 1D). Por otra parte, se comparó el perfil de expresión de genes entre el control y Wnt-5b-overexpressing células HSC4 de análisis de microarrays (datos S1). S100A8, SERPINB4, osteopontina y SERPINB3 se upregulated y TGF-beta 2, CDH11 y trombospondina 1 se downregulated en las células que sobreexpresan-5b-Wnt (Tabla S1).
A, España expresión de Wnt 5b en las líneas celulares y clones CECC altamente invasivos. La expresión de ARNm de Wnt-5b en MSCC-1, MSCC-Inv1 así como líneas celulares de seis HNSCC; HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ho-1-N-1, y Ho-1-T-1 se examinó por RT-PCR. La expresión de ARNm de Wnt-5a se examinó también en líneas celulares de 6 HNSCC. GAPDH se utilizó como control de carga.
B, Wnt-5b promovió la invasión de las células HNSCC. Para la generación de las células-5b-overexpressing Wnt, vector de expresión de Wnt-5b se transfectó en células HSC4 sin expresión Wnt-5b. Se obtuvo el clon estable y la expresión de Wnt-5b se examinó por transferencia de Western con el anticuerpo policlonal anti-Wnt-5b (panel superior izquierdo). Se utilizó celdas vacías vector transfectadas (vacío) como control. expresión de ß-actina se utilizó como control de carga. La invasividad de las células Wnt-5b sobreexpresan (panel superior derecho) fue examinado por
in vitro
ensayo de invasión. 1,5 × 10
5 células se colocaron en el compartimento superior del inserto de cultivo celular. Después de 12 h de incubación, las células penetraron en el lado inferior de la membrana se fijaron en formalina y se tiñeron con hematoxilina. HSC2 células con expresión de Wnt-5b se transfectaron de siRNA Wnt-5b (siWnt-5b) o el control de siRNA (siCONTROL). Una secuencia codificada que no muestra homología significativa con la rata, ratón o secuencias de genes humanos se utilizó como control. El efecto de la caída se evaluó mediante RT-PCR (panel inferior izquierdo). GAPDH se utilizó como control de carga. La invasividad de las células Wnt-5b-derribado fue examinado por
in vitro
ensayo de invasión de (panel inferior derecho). Después de 24 h de incubación, las células penetraron en el lado inferior de la membrana se fijaron en formalina y se tiñeron con hematoxilina. Las barras muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. * Significativamente diferente de las células transfectadas con vector vacío o controlar las células transfectadas siRNA a
P Hotel & lt; 0,01.
C, la proliferación celular Red de células que sobreexpresan-5b-Wnt y células Wnt-5b-derribado. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos, y las células tripsinizadas se contaron mediante un contador de células a los 0, 2, 4 y 6 días. Las barras muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes.
células Wnt-down-5b golpeado-D, España migración de las células Wnt-5b y que sobreexpresan. La migración de las células se determinó por el ensayo de curación de heridas. A las 24 h después de rascarse las células, imágenes de fase de contraste (10 × campo) del proceso de la cicatrización de heridas fueron fotografiados digitalmente con un microscopio invertido. La distancia de las zonas de la herida se midieron en las imágenes, fijado en 100% por 0 h, y se calculó el porcentaje medio de las distancias totales de las áreas de la herida. Las barras muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. * Significativamente diferente de las células transfectadas con vector vacío o control de las células transfectadas siRNA a
P
. & Lt; 0,01
MMP-10 se identificó como un gen diana común para periostina, IFITM1 y Wnt sobreexpresión -5 ter
para identificar los genes diana común para periostina, IFITM1 y la sobreexpresión de Wnt-5b, se compararon los perfiles de expresión génica entre células control y HSC2 periostina que sobreexpresan las células de control, HSC2 Ca9-22 células y IFITM1- sobreexpresan células Ca9-22, y las células de control y células HSC4 HSC4 Wnt-5b-overexpressing (Figura 2A). Como resultado, se encontró que varios grupos de genes con funciones biológicas variables en el desarrollo normal y en el proceso de malignidad a ser común en periostina, IFITM1, y las células Wnt-5b-overexpressing (Figura 2B). Se identificaron una serie de genes diana comunes con comportamientos biológicos variables incluyendo la adhesión celular, la proliferación celular, apoptosis, ciclo celular y otros. Gene ontología análisis se realizó utilizando el software gen primavera GX para identificar las funciones biológicas de estas moléculas (Figura 2B). Comunes hasta los genes regulados entre Periostin- y IFITM1-sobreexpresión, Periostin- y Wnt-5b-sobreexpresión y IFITM1- y Wnt-5b-sobreexpresión se enumeran en la Tabla S2, S3 y S4, respectivamente. Varios genes fueron el muy upregulated entre Periostin-, IFITM1-, y las células HNSCC Wnt-5b que sobreexpresa (cuadro S5). Entre ellos, se incluyó estromelisina-2 (MMP-10). MMPs son conocidos como una familia de proteinasas dependientes de zinc que son capaces de degradar los componentes de ECM y tienen un papel en el desarrollo de tumores [10]. Sin embargo, poco se sabe acerca de la participación de la MMP-10 en la invasión y la metástasis de las células cancerosas. Por lo tanto, nos centramos en la MMP-10 como una molécula upregulated común inducida por factores relacionados con la invasión de los CECC y examinamos su papel en la invasión de los CECC.
A, España esquema muestra la estrategia para identificar el objetivo común de moléculas relacionadas con la invasión. Periostina, IFITM1, y Wnt-5b se identifican como las moléculas relacionadas con la invasión mediante la comparación del perfil de expresión génica entre el padre (células MSCC-1) y un clon altamente invasiva (células MSCC-INV1). Para identificar los objetivos comunes de moléculas relacionadas con la invasión, se compararon los perfiles de expresión génica de control frente a periostina que sobreexpresan las células HSC2, control frente a IFITM1 que sobreexpresan las células Ca9-22 y control frente a las células HSC4 Wnt-5B con sobreexpresión. nivel de expresión ectópica de periostina, IFITM1 y Wnt-5b en cada uno de las células se muestra por RT-PCR. expresión de GAPDH se utilizó como control de carga.
B, se encontraron varios genes regulados positivamente entre periostina y IFITM1, periostina y Wnt-5b, y Wnt-5b y IFITM1. Al utilizar el software de ontología de genes, identificamos las funciones biológicas de estos genes. La tabla muestra estos genes regulados positivamente comunes que comprende diversas familias con funciones biológicas variables.
alta expresión de MMP-10 se correlaciona bien con los patrones de invasión y metástasis en los CECC
Primero examinamos la expresión de MMP-10 en 30 tejidos de la mucosa oral normal y 116 casos HNSCC mediante técnicas de inmunohistoquímica. La información clínica de 116 pacientes, incluyendo la edad, la ubicación, el tamaño del tumor, patrón de invasión, metástasis, el estadio tumoral, clasificación TNM, el tratamiento, la supervivencia y la expresión de MMP-10 se muestra en los de S2. Para demostrar la especificidad del anticuerpo de la tinción inmunohistoquímica de MMP-10, se realizó la tinción inmunohistoquímica sin anticuerpo secundario o sin anticuerpo primario como un control negativo (Figura S1). Alta expresión de MMP-10 se observó en 89 de 116 casos HNSCC (76,7%), mientras que el epitelio no neoplásico no mostró MMP-10 expresión (Figura 3A). A continuación, se comparó la expresión de MMP-10 con el patrón de invasión, agrupación de etapas y la metástasis de los ganglios linfáticos (Tabla 1). Se utilizó la clasificación de la Jacobsson (Patrones I-IV) para la evaluación del patrón de invasión (Figura S2) [14]. Fuera de 116 casos HNSCC, 9, 12, 62, y 33 casos mostraron el patrón I, II, III, y IV, respectivamente (Tabla 1). Curiosamente, la incidencia de la MMP-10 casos positivos en el patrón III y IV fue significativamente más alta que en el patrón de I y II (Figura 3B). Es bien sabido que los patrones III y IV son correspondientes a la mala diferenciación y alta tasa de metástasis [14]. La correlación entre la MMP-10 expresión y el patrón de invasión fue estadísticamente significativa (P & lt; 0,001) (Tabla 1). También comparó la expresión de MMP-10 con puesta en escena del grupo. Cuarenta y nueve casos HNSCC estaban disponibles para la agrupación de etapas (I-IV) de acuerdo con los criterios de la Sociedad Japonesa para el cáncer de cabeza y cuello [15]. La mayoría de los casos (97,1%) mostraron alta expresión de MMP-10 en el grupo de etapa avanzada (III y IV), mientras que 46,7% de los casos mostraron alta expresión de MMP-10 en el grupo de estadio temprano (I y II). La correlación entre la MMP-10 expresión y agrupación de etapas fue estadísticamente significativa (P & lt; 0,001) (Tabla 1). Además, MMP-10 expresión se correlacionó significativamente con la metástasis de los ganglios linfáticos (P & lt; 0,001) (Tabla 1 y la Figura 3B). Veintinueve de 89 casos HNSCC con alta expresión de la MMP-10 tenían metástasis en los ganglios linfáticos, mientras que 5 de 27 casos HNSCC con baja expresión de MMP-10 tenían metástasis en los ganglios linfáticos (Figura 3B). Por otra parte, se analizó la correlación entre la expresión de MMP-10 y la supervivencia en casos de HNSCC. Cuarenta y dos casos HNSCC estaban disponibles para el análisis de supervivencia. Curiosamente, a pesar de que no hubo significación estadística (
P
= 0,21), los pacientes con alta expresión de MMP-10 tendieron a mostrar mal pronóstico (Figura 3C).
,
expresión inmunohistoquímica de la MMP-10 en 116 casos y 30 HNSCC epitelios normales. epitelio normal es completamente negativa para la MMP-10 en comparación con los casos en los que HNSCC mayoría de las células tumorales mostraron altamente expresión de MMP-10. se muestran caso representativo de baja expresión de MMP-10 en el epitelio normal oral y caso CECC (de Jacobsson Clasificación de patrones I), y casos representativos de la alta expresión de MMP-10 (baja y alta magnificación) en los casos CECC (de Jacobsson Clasificación de patrones IV). La barra de escala se muestra en cada imagen.
B, Correlación entre la MMP-10 expresión y la invasión y la metástasis en los casos HNSCC. Gráfica de la izquierda muestra la relación entre MMP-10 expresión y el patrón de invasión. Se utilizó la clasificación de la Jacobsson (Patrones I-IV) para la evaluación del patrón de invasión (Figura S1) [14]. * Significativamente diferente del patrón I o II a
P
& lt; 0,01. Gráfica de la derecha muestra la relación entre la MMP-10 expresión y la metástasis. * Significativamente diferente de baja expresión de MMP-10 a
P Hotel & lt; 0,01.
C, España expresión MMP-10 y un peor pronóstico. Cuarenta y dos casos HNSCC italianos estaban disponibles para el análisis de supervivencia. Las curvas de Kaplan-Meier muestran la supervivencia de los pacientes con CECC alta expresión de MMP-10 (•, N = 34) o baja expresión de MMP-10 (▴, N = 8).
MMP-10 promueve la invasión de los CECC
a continuación examinó la MMP-10 mRNA y proteína en 6 líneas celulares HNSCC por RT-PCR y Western blot, respectivamente. Se observó una alta expresión de la MMP-10 mRNA y proteína en Ca9-22, Ho-1-T-1 y Ho-1-N-1 células (Figura 4A). En las células HSC2, HSC3 y HSC4, MMP-10 expresión fue baja (Figura 4A). expresión de la proteína MMP-10 correspondió a nivel de expresión del ARNm. Para investigar si la MMP-10 promueve la invasión de los CECC
in vitro
, hemos generado células MMP-10 con sobreexpresión mediante el uso de células HSC2 y HSC3 con baja expresión de MMP-10 (Figura 4B). Se confirmó la mayor actividad de MMP-10 en medio condicionado de células MMP-10 que sobreexpresan por estromelisina zimografía (Figura 4B). Aunque MMP-10 sobreexpresión no afectó a la proliferación de las células (datos no presentados), lo que mejora considerablemente la actividad invasiva tanto en las células HSC2 y HSC3 (
P
& lt; 0,05) (Figura 4C). Para confirmar aún más la invasión mediada por MMP-10 de las células HNSCC, hemos examinado la desmontables de MMP-10 mediante el uso de siRNA en Ca-9-22 y células con alta expresión de MMP-10-N-1 Ho-1. Para la MMP-10 desmontables, se utilizó 3 diferentes siRNAs (# 1,#2 y#3). Todos los siRNAs incluyendo cóctel de 3 siRNAs reducen MMP-10 expresión (Figura S3). Utilizamos cóctel de 3 siRNAs en los siguientes estudios. MMP-10 desmontables inhibe la expresión de MMP-10 mRNA y proteína en Ca9-22 y Ho-1-N-1 células (Figura 4D). MMP-10 desmontables suprimió significativamente la invasión de las células CECC (Figura 4E). En conjunto, estos hallazgos indican que la MMP-10 juega un papel importante en la invasión de células HNSCC.
A, España expresión de MMP-10 mRNA y proteína en seis líneas celulares HNSCC. La expresión de MMP-10 mRNA en HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ho-1-N-1, y Ho-1-U-1 se examinó por RT-PCR. GAPDH se utilizó como control de carga. nivel de expresión de la proteína MMP-10 se evaluó en las seis líneas celulares HNSCC por análisis de transferencia de Western. se muestran las imágenes de la exposición a corto y largo plazo de la expresión de proteína MMP-10. ß-actina se utilizó como control de carga.
B, Generación de células de MMP-10 con sobreexpresión. Se obtuvieron varios clones por transfección con-Bandera de etiquetado pBICEP MMP-10 en las células HSC2 y HSC3. La expresión ectópica de MMP-10 se determinó mediante transferencia Western con anticuerpo anti-FLAG (panel izquierdo). β-actina se utilizó como control de carga. La actividad enzimática de MMP-10 se detectó mediante estromelisina zimografía (panel derecho). forma activa de la MMP-10 (cabeza de flecha) se detectó en el medio condicionado de células de MMP-10 con sobreexpresión.
C, la actividad
invasivo de las células HSC2 y HSC3 MMP-10 que sobreexpresan HSC2 (panel izquierdo) y HSC3 (panel derecho) de las células en comparación con el vector vacío transfectadas (vacío) por
in vitro
ensayo de invasión. Las células se fijaron después de la incubación de 12 h o 20 h en las células o células HSC2 HSC3, respectivamente. La figura muestra el lado inferior de la membrana teñida donde las células penetraron (panel superior). Los gráficos muestran el número de células invadidas en las células transfectadas con vector de MMP-10 que sobreexpresan y vacías (panel inferior). Las barras muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. * Significativamente diferente de las células transfectadas vector vacío a
P Hotel & lt; 0,01.
D, España MMP-10 siRNA suprimido la invasión de las células HNSCC. Cocktail de 3 diferentes MMP-10 siRNAs se transfectó transitoriamente en Ca-9-22 y Ho-1-N-1 células con MMP-10 expresión. Una secuencia codificada que no muestra homología significativa con la rata, ratón o secuencias de genes humanos se utilizó como control. Después de 48 h de la transfección, la expresión de MMP-10 mRNA y la proteína se examinó por RT-PCR y Western Blot (WB), respectivamente. GAPDH ARNm y la proteína β-actina se utilizaron como control de carga. Se realizó un análisis densitométrico de la expresión de MMP-10. MMP-10 /GAPDH se muestra la relación.
E, España represión de la invasión de la MMP-10 caída en Ca9-22 y células-N-1 Ho-1. La invasión de la MMP-10 células abatidos fue examinado por
in vitro
ensayo de invasión en en comparación con las células transfectadas control de siRNA. Una secuencia codificada que no muestra homología significativa con la rata, ratón o secuencias de genes humanos se utilizó como control. Después de 24 h de incubación, se fijaron las células y se contó el número de células invadidas. La figura muestra el lado inferior de la membrana teñida donde las células penetraron (panel izquierdo). El gráfico muestra el número de células invadidas (panel derecho). Las barras muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. * Significativamente diferente de las células transfectadas control de siRNA a
P
. & Lt; 0,01
caída MMP10 suprime la invasión promovida-Wnt-5b periostina y de las células HNSCC
nuestros resultados actuales revelan que la MMP-10 es un gen upregulated común entre periostina, IFITM1, y la sobreexpresión de Wnt-5b. Se comparó la expresión de MMP-10 en periostina, IFITM1, y las células Wnt-5b-overexpressing con la de las células de control. MMP-10 se ha encontrado que se upregulated por periostina o Wnt-5b (Figura 5A), pero no por IFITM1 (datos no mostrados). En nuestro análisis de microarrays, se observó 17,4 veces mayor de MMP-10 expresión en periostina que sobreexpresan las células HSC2 y 5,8 veces de incremento de la MMP-10 expresión se observó en las células HSC4 Wnt-5b-overexpressing. Por lo tanto, hemos examinado el papel potencial de MMP-10 en periostina y la invasión de Wnt-5b-promovido en el CECC. Se examinó el efecto de la MMP-10 desmontables sobre la invasión de las células que sobreexpresan periostina Ca9-22 y en células HSC4 Wnt-5b sobreexpresan. Expresión de la proteína MMP-10 se redujo por MMP-10 caída en Periostin- y células Wnt-5b-overexpressing (Figura 5B). Curiosamente, MMP-10 desmontables suprimió significativamente la invasión promovido-Wnt-5b Periostin- y (Figura 5C), indicando que la MMP-10 puede jugar un papel en la invasividad impulsado por Periostin- y Wnt-5b-sobreexpresión en HNSCC. También se examinó la MMP-10 desmontables en las células periostina overxpressiong HSC2 (Figura S4). En similares a periostina overxpressiong células Ca9-22, MMP-10 siRNA suprimido las capacidades invasivas en células HSC2 periostina overxpressiong. Además, la MMP-10 desmontables, inhibió la invasión de las células de control Ca9-22, mientras que la MMP-10 desmontables inhibió ligeramente la invasión en HSC2 control y células HSC4 (Figura 5C y la figura S4). En las células Ca9-22, se observó alto nivel de MMP-10 expresión, pero no en células HSC2 y HSC4 (Figura 4A). A medida que las células mostraron Ca9-22 endógeno expresión de MMP-10 en los niveles superiores, pensamos que la MMP-10 siRNA suprimido capacidades invasoras a través de la regulación negativa de la expresión endógena de MMP-10 en las células Ca9-22. El nivel de supresión por MMP-10 desmontables era más probable depende del nivel de expresión de MMP-10.
A,
La expresión de MMP10 mRNA fue examinado por RT-PCR en CA9 de control -22 células, periostina células que sobreexpresan Ca9-22, células y células de control HSC4 HSC4 Wnt-5b sobreexpresan. expresión de GAPDH se utilizó como control de carga.
B, células Wnt-5b con sobreexpresión de MMP-10 desmontables en Periostin- y. Cóctel de 3 diferentes MMP-10 siRNAs se transfectadas transitoriamente en Ca-9-22 células que sobreexpresan periostina y células HSC4 Wnt-5b sobreexpresan. Una secuencia codificada que no muestra homología significativa con la rata, ratón o secuencias de genes humanos se utilizó como control. Después de 48 h de transfección, MMP-10 nivel de proteína se examinó por análisis de transferencia Western con-MMP-10 anticuerpo anti en MMP-10 siRNA células transfectadas periostina que sobreexpresan. ß-actina se utilizó como control de carga.
C, Francia El carácter invasivo de la MMP-10 siRNA transfectadas que sobreexpresan periostina Ca-9-22 células (panel izquierdo) y células HSC4-5b con sobreexpresión de Wnt (panel derecho) fue examinado por
in vitro
ensayo de invasión. Después de 18 h de incubación de las células HSC4 y 24 h de incubación de las células Ca9-22, se fijaron las células y se contó el número de células invadidas. La figura muestra el lado inferior de la membrana teñida donde las células penetraron (panel superior). Los gráficos muestran el número de células invadidas en la precipitación y las células de control (panel inferior). Las barras muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. * Significativamente diferente del control a
P
. & Lt; 0,01
invasión promovida-MMP-10 se asocia con la inhibición de p38
Con el fin de conocer el mecanismo de MMP-10 promueve la invasión, se observó la actividad de las moléculas de señalización celular, tales como p38, FAK, RSK, Akt, Src, ERK y por transferencia Western utilizando anticuerpo específico de fosforilación en el control y la MMP-10 células que sobreexpresan. Entre estas moléculas, p38 se inactiva por MMP-10 sobreexpresión (Figura 6A). Para confirmar aún más la implicación de la inhibición de p38 en la invasión promovido-MMP-10, la capacidad invasiva de control y MMP-10 que sobreexpresan las células después del tratamiento con el inhibidor de p38, SB203580 se examinó. Curiosamente, el tratamiento SB203580 promovió significativamente la invasión de las células de control con la actividad de p38 (Figura 6B). Por otro lado, el tratamiento SB203580 no promovió la invasión de MMP-10 que sobreexpresan células sin actividad de p38. Además, se analizó si un inhibidor de p38 rescató el bloque de la invasión inducida por MMP10 caída en la MMP-10 que sobreexpresan las células HSC2 y HSC3. MMP-10 desmontables en las células de la MMP-10 que sobreexpresan promovió la capacidad invasiva después del tratamiento con el inhibidor de p38 (Figura S5). Sin embargo, el inhibidor de p38 no rescató totalmente la capacidad invasiva suprimida por la MMP-10 siRNA (Figura S5). Por otra parte, se confirmó que las células adición de medio condicionado de MMP-10 que sobreexpresan inhibió la actividad de p38 en las células HSC2 y HSC3 (Figura 6C). También se examinó la actividad de p38 y la invasión de la MMP-10 desmontables en las células de la CMM-Inv1. En las células de la CMM-Inv1, MMP-10 desmontables ligeramente regulada positivamente la actividad de p38 (Figura 6D) y se inhibe la actividad invasiva (Figura 6E).
A, la inhibición
p38 se observó en MMP-10 sobreexpresan células. Los niveles de las formas totales y fosforilada de p38, FAK, RSK, Akt, Src, ERK y en el control y la MMP-10 células por Western Blot overexpresing.
B, La invasión de control y MMP-10 que sobreexpresan las células después del tratamiento por el inhibidor de p38. La invasividad de fue examinado por
in vitro ensayo de invasión en
en las celdas vacías vector transfectadas y MMP-10 que sobreexpresan las células con el tratamiento SB203580. Se utilizaron células transfectadas vector vacío como control. Después de 12 h de incubación, se fijaron las células y se contó el número de células invadidas. La figura muestra el lado inferior de la membrana teñida donde las células penetraron (panel superior). Los gráficos muestran el número de células invadidas (panel inferior). Las barras muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. * Significativamente diferente de las células transfectadas vector vacío sin tratamiento SB203580 a
P Hotel & lt; 0,01.
C, la actividad de p38
después del tratamiento con medio condicionado de la MMP-10 células que sobreexpresan. Se recogieron los medios condicionados de la MMP-10 que sobreexpresan las células HSC2 y HSC3 después de 48 h de chapado. Después de la adición de medio acondicionado de 0, 6, 12 y 24 h, se recogieron las células HSC2 o HSC3. La expresión de fosfo-p38 y p38 se examinó por análisis de transferencia Western.
D, España MMP-10 siRNA upregulates la actividad de p38 en las células HNSCC. Cóctel de 3 diferentes MMP-10 siRNAs se transfectadas transitoriamente en células CMM-Inv1. Una secuencia codificada que no muestra homología significativa con la rata, ratón o secuencias de genes humanos se utilizó como control. Después de 48 h de transfección, expresión de la proteína MMP-10 se examinó por transferencia de Western. Los niveles de las formas totales y fosforiladas de p38 también se examinaron mediante transferencia Western. expresión de ß-actina se utilizó como control de carga.
E, España represión de la invasión de la MMP-10 desmontables en las células de la CMM-Inv1. La invasividad in vitro se examinó mediante ensayo de invasión
In. Después de 6 h de incubación, se fijaron las células y se contó el número de células invadidas. La figura muestra el lado inferior de la membrana teñida donde las células penetraron (panel superior). El gráfico muestra el número de células invadidas (panel inferior). Las barras muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. * Significativamente diferente del control a
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Discusión
La invasión y la metástasis son el principal problema y el mayor obstáculo para el tratamiento del CECC. Por lo tanto, es importante para identificar nuevas moléculas implicadas en la invasión y la metástasis de HNSCC. Se identificaron varios genes relacionados con la invasión mediante la comparación de los perfiles de expresión génica entre las células matrices y un clon altamente invasiva [8]. Periostina y IFITM1 fueron identificados como los más altos genes en un clon altamente invasivo y su participación en la invasión fueron confirmados por
in vitro
y
in vivo
estudios [8], [9]. Aquí, hemos demostrado que Wnt-5b promovió la invasión de las células CECC (Figura 1).