Extracto
Antecedentes
proteína tumoral
in vivo
descubrir diversos tipos de microambientes, tanto en el sitio del tumor primario y en los sitios de metástasis a distancia. La comprensión de cómo las diversas propiedades mecánicas de estos microambientes afectan a la biología de las células tumorales durante la progresión de la enfermedad es fundamental en la identificación de dianas moleculares para la terapia del cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
Este estudio utiliza geles de poliacrilamida flexibles como sustratos para el crecimiento de células en combinación con un enfoque proteómico novela para identificar las propiedades de las líneas celulares de cáncer de rigidez dependiente que contribuyen a su crecimiento diferencial en sustratos blandos y rígidos. En comparación con las células que crecen sobre sustratos más rígido /rígido (& gt; 10 000 Pa), las células en sustratos blandos (150-300 Pa) mostraron un ciclo celular más largo, debido predominantemente a una extensión de la fase G1 del ciclo celular, y eran metabólicamente menos activa, que muestra disminución de los niveles de ATP intracelular y una marcada reducción en la síntesis de proteínas. El uso de etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo (SILAC) y espectrometría de masas, que mide las tasas de síntesis de proteínas de más de 1200 proteínas celulares en condiciones de crecimiento en sustratos rígidos y blandos /duros. Se identificaron las proteínas celulares cuya síntesis fueron ya sea preferentemente inhibido o conservados en matrices suaves. La primera categoría incluye las proteínas que regulan las estructuras del citoesqueleto (por ejemplo, tubulins) y la glucólisis (por ejemplo, la fosfofructoquinasa-1), mientras que la última categoría incluye las proteínas que regulan las vías metabólicas clave necesarios para la supervivencia, por ejemplo, fosforribosiltransferasa nicotinamida, un regulador de la salvamento NAD vía.
Conclusiones /Importancia
las propiedades celulares de las células de cáncer de rigidez dependiente crecen en matrices suaves son una reminiscencia de las propiedades de las células cancerosas latentes, por ejemplo, la tasa de crecimiento lento y la disminución del metabolismo. Sugerimos que el uso de geles relativamente blandos como sustratos de cultivo celular permitiría vías moleculares para el estudio bajo condiciones que reflejan los diferentes entornos mecánicas encontradas por las células de cáncer que son la metástasis a sitios distantes
Visto:. Tilghman RW, Blais EM, Cowan CR, Sherman NE, Grigera PR, Jeffery ED, et al. (2012) Matriz rigidez del cáncer Regula el crecimiento celular mediante la modulación del metabolismo celular y la síntesis de la proteína. PLoS ONE 7 (5): e37231. doi: 10.1371 /journal.pone.0037231
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 14 Febrero, 2012; Aceptado: April 16, 2012; Publicado: 18 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Tilghman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de National Institutes of Health Cancer Institute (NIH)-Nacional (NCI) CA40042 (JTP) y el NIH GM64346 1U54 (JTP y FAJ) (www.nih.gov) y la financiación de la Fundación Coulter traslacional Premio Partners (www. whcf.org) (JTP). EMB fue apoyado por el NIH NCI-T32 CA09109. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
detección de las propiedades mecánicas de la matriz extracelular (ECM) es un mecanismo central para la regulación de la diferenciación y proliferación de una multitud de tipos de células, tanto
in vitro
y
in vivo
. Amplia evidencia implica alteraciones en las vías de señalización que regulan la respuesta de las células a las señales microambientales como eventos críticos en la iniciación del tumor, progresión, metástasis y tal vez la latencia del tumor [1], [2]. Además, el aumento de la rigidez del tejido debido a la acumulación local de una matriz de colágeno denso, reticulado es un sello de la progresión del cáncer en los tejidos blandos y es la base para la detección de muchos tipos de tumores mediante palpación física [3], [4].
el análisis de las líneas celulares de cáncer humano en cultivo celular casi siempre se realiza utilizando células cultivadas en plástico rígido, o, con menos frecuencia, en Matrigel o agar blando, las propiedades mecánicas de los cuales están mal definidos y /o difíciles de modular. Hemos descrito previamente un simple método de alto rendimiento para el cultivo de células tumorales en sustratos flexibles biológicamente relevantes utilizando ECM conjugado de poliacrilamida (PA) geles que puede abarcar una gama que abarca rigidez módulos de elasticidad de 100 pascales ([Pa] o N /m2) -150000 Pa [5]. En este ensayo se utiliza un sistema de ensayo de 96 pocillos que las matrices geles PA de rigidez variable en incrementos definidos por el usuario a través de la placa de [6]. Hemos usado este ensayo para evaluar cómo los cambios en la rigidez de la ECM modular las propiedades biológicas de las células tumorales, incluyendo el crecimiento, la morfología y propiedades migratorias. Las líneas celulares de cáncer de prueba se agrupan en dos categorías en función de sus perfiles de proliferación: "rigidez" líneas dependientes exhibieron aumentar el crecimiento celular como la rigidez extracelular aumentó, mientras que "rigidez" líneas independientes crecieron igualmente bien en todo el espectro probado de la rigidez de la matriz. Es importante destacar que, las células que crecían mal en geles suaves mostraron una disminución propagación y la migración en estas condiciones y crecieron mal cuando se introduce en el medio ambiente de los tejidos blandos del pulmón. La línea de carcinoma de pulmón A549 rigidez dependiente respondió a la cultura en geles suaves expresando el marcador diferenciado epitelial E-cadherina y la disminución de la expresión del factor de transcripción Slug mesenquimales. Del mismo modo, la rigidez también se ha encontrado para modular la transición epitelio-mesenquimales en las células epiteliales normales [7]. Estas observaciones demuestran que las propiedades mecánicas del entorno de matriz desempeñan un papel importante en la regulación de la proliferación y las propiedades morfológicas de las células cancerosas, y que el "perfil de rigidez" es una propiedad intrínseca de cada línea celular de cáncer.
muchas líneas celulares de cáncer responden a microambientes menos rígidas por la proliferación de más lentamente; Sin embargo, las alteraciones en el metabolismo celular debido a cambios en la rigidez de la microambiente no han sido bien caracterizado. cambios celulares en los procesos metabólicos, tales como la síntesis de proteínas pueden ser especialmente relevante como las células tumorales entren en un estado "inactivo", principalmente en los sitios de metástasis a distancia donde se han introducido las células a un microambiente extranjera [8], [9]. En este estudio se investigó las propiedades de las líneas celulares de cáncer de rigidez dependiente que contribuyen a su crecimiento diferencial en sustratos blandos de poliacrilamida y rígidos. En comparación con las células que crecen sobre sustratos más rígido /rígido, células en sustratos blandos (150-300 Pa) mostraron un ciclo celular más largo, debido predominantemente a una extensión de la fase G1 del ciclo celular, y eran metabólicamente menos activa, que muestra disminución de los niveles de ATP intracelular y una marcada reducción en la síntesis de proteínas. Para identificar las proteínas que exhiben tasas de síntesis diferenciales cuando las células se cultivan en la suavidad en comparación con geles rígidos, se utilizó una aplicación desarrollada recientemente de etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo (SILAC) y espectrometría de masas para medir las tasas de síntesis de proteínas de más de 1200 proteínas celulares en condiciones de crecimiento sobre sustratos blandos y rígidos /rigidez [10]. Mientras que las tasas globales de la síntesis de proteínas disminuyen notablemente en las células de rigidez dependiente cultivadas en sustratos blandos, se identificaron las proteínas celulares cuya síntesis se inhibe preferentemente mediante el cultivo en sustratos blandos y proteínas cuya síntesis fueron relativamente preservada cuando se cultiva en matrices suaves. La primera categoría incluye las proteínas que regulan las estructuras del citoesqueleto (por ejemplo, subunidades de tubulina) y la glucólisis (por ejemplo, la fosfofructoquinasa P-1 y la ATP sintasa), mientras que la última categoría incluye las proteínas que regulan las vías metabólicas clave necesarios para contrarrestar el daño de especies reactivas del oxígeno, como miembros de la familia aldo-ceto reductasa y nicotinamida fosforribosiltransferasa, un regulador de la vía NAD salvamento. Las propiedades celulares de las células de cáncer de rigidez dependiente crecen en matrices suaves son una reminiscencia de las propiedades de las células cancerosas latentes, es decir, baja tasa de crecimiento y la disminución del metabolismo. Estos datos apoyan la idea de que la rigidez de la microambiente puede modular la proliferación de células tumorales mediante la modulación de procesos celulares fundamentales. Además, la tecnología de placas suave puede proporcionar una plataforma única para el estudio de células de cáncer sometidos a regulación dinámica de la proliferación en respuesta a los cambios en el entorno mecánico, proporcionando así conocimientos sobre cómo los cambios microambientales modular el crecimiento de células de cáncer en modelos animales experimentales y en los pacientes.
resultados
progresión del ciclo celular de las células de rigidez dependiente en geles suaves
Hemos demostrado previamente que un panel de líneas celulares de cáncer se puede segregar en base a la capacidad de proliferar en suave (& lt; 1000 Pa) geles de colágeno recubierto. células A549 (carcinoma de pulmón) y las células MDA-MB-231 (carcinoma de mama) se clasifican como los tiempos de exposición duplicar "rigidez dependiente" y que son al menos 2 veces más largo en la suavidad frente a matrices rígidas. En contraste, las células mPanc96 "rigidez"-independiente (carcinoma de páncreas) crecerá igual de bien en suave en comparación con las matrices rígidas y tienen tiempos de duplicación similares en estas condiciones ([5], observaciones no publicadas).
Para entender la base molecular para el lento crecimiento de líneas celulares de cáncer de rigidez dependiente de matrices suaves, que mide los principales reguladores de la progresión del ciclo celular, así como el tiempo necesario para que las células transversal del ciclo celular en sustratos blandos o rígidos. Ciclina D1 es crítica para que las células entran en el ciclo celular, y la pérdida de la expresión de ciclina D1 es un marcador de las células que han salido del ciclo celular y están en reposo [11]. Además, la expresión de ciclina D1 se ha demostrado ser regulado por la rigidez de la matriz a través de la activación de FAK dependiente de Rac en células no transformadas [12]. La expresión de la ciclina D1 en células de cáncer de rigidez dependiente se midió para determinar si las células salen del ciclo celular cuando se cultivan en geles blandos. células de rigidez dependiente de A549 o MDA-MB-231 se cultivaron en 150 Pa, 4800 Pa, o 19200 geles Pa durante 2 o 5 días, y la expresión de ciclina D1 se midió por Western blot. Ambas líneas celulares expresan ciclina D1 aún incluso cuando se cultivan en los Pa (150) cápsulas de gel (Figura 1). Estos datos indican que las células de rigidez dependiente no salen del ciclo celular, incluso en geles suaves donde las células presentan un crecimiento más lento.
células A549 y células MDA-MB-231 se cultivaron en 150 Pa, 4800 Pa, o 19200 Pa geles de poliacrilamida para 2 o 5 días. Las células se lisaron y se analizaron por transferencia de Western para la expresión de ciclina D1 (panel superior). La expresión de GAPDH se analizó como control de carga (panel inferior). La mancha es representativo de tres experimentos.
Dado que las células A549 rigidez dependiente de no salir del ciclo celular cuando se sembraron en geles suaves, y sólo ~ 5% de las células experimentan apoptosis en estas condiciones [5 ], la hipótesis de que estas células están progresando a través del ciclo celular más lentamente que cuando están creciendo en sustratos rígidos. Para examinar la tasa de progresión a través de fases específicas del ciclo celular, la A549 línea de carcinoma de pulmón de rigidez dependiente se cultivó en (19200 Pa) geles suaves (150 Pa) o rígidos durante dos o cinco días y luego se pulsaron durante 30 minutos con el nucleótidos bromodesoxiuridina analógica (BrdU) para etiquetar la población de células que experimentan síntesis de ADN. El tiempo pasado en cada fase del ciclo celular se determinó mediante FACS a realizar un seguimiento de la población BrdU-positivas como las células progresaron a través de las fases S y G2 y se acumularon en la fase G1 [13]. Como se muestra en la Figura 2, las células en geles suaves progresaron más lentamente a través de la fase G1 del ciclo celular en comparación con las mismas células que crecen en matrices rígidas (Figura 2), en consonancia con una disminución global en el metabolismo celular o procesos anabólicos que afectan a la celular etapa de "crecimiento" del ciclo celular. Debido a que los perfiles del ciclo celular son similares después de 2 y 5 días en geles blandos, es probable que esto representa una medida de estado estacionario, en lugar de la posibilidad de que el crecimiento celular se desacelera gradualmente con el tiempo. Sobre la base de la longitud calculada del ciclo celular de las células que crecen en la suavidad frente geles rígidos, después de 5 días de la proporción de células en la suavidad frente a las matrices de rigidez sería 1:4.3. La misma proporción de crecimiento en la suavidad en comparación con geles rígidos (1:4.3) se observó contando manualmente el número de células presentes en cinco días, validando así los cálculos BrdU de pulso-caza.
células A549 se pulsaron con BrdU durante 30 minutos siguientes crecimiento en geles blandos o rígidos durante 2 días. Etiquetado de las células con BrdU A. para el análisis del ciclo celular. Las células se pulsaron con BrdU durante 30 min, y la población BrdU-positivas es seguido con el tiempo en la transición a través de las fases del ciclo celular. B. dispersión histogramas de la trama de células marcadas con BrdU en (panel superior) suave o geles rígidos (panel inferior), manchados por el contenido de ADN (eje X) y BrdU (eje Y). Los tiempos indicados son los tiempos, en horas, después del pulso de BrdU. C. Análisis de la progresión del ciclo celular se realizó en el gráfico de dispersión de los histogramas de las células cultivadas en geles durante 2 días (izquierda) o 5 días (derecha).
El metabolismo celular en las células cultivadas de rigidez dependiente de geles suaves
la fase G1 del ciclo celular depende en gran medida de eventos metabólicos celulares y es crítica para la síntesis de proteínas estructurales y enzimas que contribuyen a la generación de nuevos orgánulos y el crecimiento global de la célula. Debido a que la fase G1 del ciclo celular se prolongó en células de rigidez dependiente cultivadas en geles suaves, la hipótesis de que puede haber cambios metabólicos en condiciones de crecimiento de sustratos blandos. El cultivo de la A549 rigidez dependiente de la o de las células MDA-MB-231 en geles blandos para 2 días dado lugar a una disminución de aproximadamente 50% en los niveles de ATP en comparación con las células que crecen en geles rígidos (Figura 3). Al igual que el alargamiento de la fase G1, los niveles más bajos de ATP celular son consistentes con una disminución en el metabolismo celular cuando las células de rigidez dependiente son cultivadas en geles blandos.
los niveles de ATP se midieron en células A549 (izquierda) o MDA-MB-231 células (derecha) después del cultivo en geles de poliacrilamida durante 2 días. Los datos representan la media de dos experimentos realizados por triplicado ± S. E., de las células en (19200 Pa) geles suaves (300 Pa) o rígidos. Los niveles totales de ATP se normalizaron a los números de células. * P & lt;. 0.05
Efecto de la rigidez en la síntesis de proteínas en células cultivadas en geles suaves
Debido a la fase G1 prolongado y la disminución de los niveles de ATP en las células cultivadas en geles suaves , determinamos si la rigidez de la matriz puede regular la síntesis neta de proteínas en las células de rigidez-dependiente. Para evaluar los cambios en la síntesis de proteínas global, y para identificar las proteínas que podrían ser diferencialmente sintetizados bajo suave frente a condiciones duras, se utilizó una aplicación desarrollada recientemente de etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC), en relación con la espectrometría de masas [10 ]. células A549 de rigidez dependiente y células mPanc96 rigidez independiente se hicieron crecer en medios SILAC durante dos generaciones en platos de cultivo de tejidos de plástico para etiquetar completamente el proteoma con ácidos "pesados" amino (Figura 4A). Las células se sembraron en geles blandos o rígidos y se cultivaron adicionalmente en aminoácidos "pesados" para un adicional de 4 días. Las células se incubaron durante 24 horas ( "pulso") en los medios de comunicación "ligeros" (medios de cultivo de tejidos normales), y las proteínas celulares fueron aisladas de cada una de las muestras y se resolvieron en SDS-PAGE. Las proteínas presentes en las muestras blandas y rígidas se analizaron mediante la adopción de diez cortes de gel de cada pista proteína y sometiendo cada uno para la digestión con tripsina. la síntesis de proteínas red durante las 24 horas "pulso" se midió mediante la determinación de la relación de pesada a los péptidos de luz mediante espectrometría de masas de proteínas en las muestras blandas y rígidas. Un experimento preliminar con células A549 cultivadas en plástico dio pesada a las relaciones de luz (H /L ratios) de los péptidos que eran similares a los de las células A549 cultivadas en geles rígidos (0.6246 ± 0.2326 para el plástico vs. 0.5482 ± 0.1785 para geles rígidos). La figura 4B muestra los diagramas de caja para las relaciones H /L de proteínas identificadas para las células A549 y mPanc96 en geles suaves y duras utilizando SILAC. La relación media pesada /ligera de péptidos en las células A549 en geles suaves fue significativamente mayor (p & lt; 0,05) que en las células en geles rígidos, lo que indica que la síntesis proteica neta se redujo en las células en geles suaves, (es decir, menos de amino luz ácidos se incorporaron durante el pulso en células que crecen en sustratos blandos en comparación con sustratos rígidos). En contraste, las relaciones de pesado /ligero de los péptidos en las células mPanc96 no fueron significativamente diferentes entre las células que crecen en geles suaves o rígidas (p & gt; 0,05). (Figura 4B)
células A549 fueron sometidos a análisis SILAC para determinar las tasas de síntesis de proteínas en geles blandos o rígidos. A. Descripción general del procedimiento SILAC. A549 células fueron cultivadas en geles blandos o rígidos durante 4 días en presencia de los medios de comunicación "pesados", seguido de una incubación de 24 horas con los medios de comunicación "ligeros". Las células se lisaron, las proteínas celulares se digirieron con tripsina y los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas. B. Diagramas de caja de pesada a la luz (H /L) proporciones de proteínas de las células A549 (izquierda) o células mPanc96 (derecha) cultiva en (150 Pa) sustratos rígidos (19200 Pa) o blandos. H proporción /L distribuciones son significativamente diferentes entre rígido y suave para las células A549, pero no para las células mPanc96 utilizando prueba t no pareada de dos colas. Las cajas contienen los datos entre los percentiles 25 y 75, y la línea dentro del cuadro indica la mediana. La línea discontinua en la parte superior del gráfico marca el límite superior, por encima del cual se truncan los valores atípicos.
El análisis de espectrometría de masas identificado 631 proteínas únicas en las células A549 y 729 proteínas únicas en las células mPanc96 (Tablas S1 y S2). las tasas relativas de la síntesis (relación H /L) para las proteínas individuales se compararon entre las células cultivadas en condiciones duras y blandas para determinar las proteínas que están diferencialmente "expresan" o traducido. Dado que las distribuciones de los coeficientes H /L diferían entre los experimentos rígidos y blandos, relaciones H /L y la variabilidad estimada se normalizaron de forma independiente para las muestras A549 y mPanc96 (ver Métodos), y se identificaron las proteínas con significativamente diferentes relaciones H /L (p & lt; 0,05 ) mediante pruebas t. Figura 5 muestra los diagramas de dispersión de relaciones H /L normalizadas entre el crecimiento muestras sobre sustratos rígidos y blandos. Las proteínas que tienen una proporción significativamente menor H /L (síntesis conservado) en suave en comparación con geles rígidos se indican en rojo y las proteínas que tienen una proporción significativamente más alta de H /L (síntesis más lento) en suave de geles rígidos se indican en verde. La línea discontinua indica la relación H /L esperado bajo la hipótesis nula de que las proteínas mantienen el mismo H /L relación respecto a la media.
relaciones H /L de proteínas identificadas en ambas muestras duras y blandas representan frente a cada uno otra para las células A549 (izquierda) y células mPanc96 (derecha). proporciones de H /L de la Figura 4 eran cuantil normalizado y pruebas t se realizaron utilizando la variabilidad estimada (ver Métodos) para identificar las proteínas individuales con relativamente diferentes tasas de síntesis entre las muestras rígidas y blandas. Las proteínas que se sintetizan más rápido (relativamente más bajo H /relación de L y p-valor & lt; 0,05). En muestras suaves (en comparación con muestras de rigidez) se muestran en rojo, y las proteínas que se sintetizan más lenta en las muestras suaves se muestran en verde
a partir de las proteínas identificadas por espectrometría de masas, que separa las proteínas que exhiben significativamente diferentes relaciones H /L (p & lt; 0,05) entre las células cultivadas en geles rígidos y blandos (Tabla S3 para células A549; Tabla S4 para mPanc96 células). En las células A549, varias proteínas con funciones biológicas comunes agrupados en la categoría de síntesis más lento en geles blandos (Tabla 1). Estas proteínas incluidas involucrados en la síntesis de proteínas, tales como proteínas ribosomales y factores de elongación. Subunidades de microtúbulos (tubulinas) también agrupados en la categoría de síntesis más lento en geles suaves. Curiosamente, dos proteínas con un papel crucial en la producción de ATP también muestran tasas más lentas de síntesis sobre geles suaves: 6-fosfofructoquinasa tipo C (PFKP-1) y una subunidad de la ATP sintasa. Estos datos sugieren que cuando las células A549 se cultivan en un microambiente suave, un subconjunto de proteínas - incluyendo los implicados en la dinámica de los microtúbulos de traducción y - se sintetiza más lentamente con respecto a la tasa de síntesis de promedio que cuando se cultivan en geles rígidos
a la inversa, las proteínas que tenían las tasas de síntesis más altas que la mayor parte de las proteínas celulares cuando se siembran en geles blandos incluyen miembros de la familia aldo-ceto reductasa, que están implicados en la protección contra especies reactivas del oxígeno, y fosforribosiltransferasa nicotinamida, que es importante para mantener los niveles fisiológicos de los cofactores de nicotinamida (es decir, NADPH) que son importantes para estas reacciones redox (Tabla 2). Adicionalmente,, anexinas y específicamente las proteínas Rab, se encontraron también proteínas con funciones en endocitosis y el tráfico de vesículas que se conserva en las células A549 cultivadas en geles suaves. Los datos de esta tabla sugieren que cuando las células A549 se cultivan en un microambiente suave, se conserva la síntesis de proteínas que son importantes para la regulación de las especies reactivas de oxígeno y dinámica de la membrana.
Al igual que en las células A549 cultivadas en geles suaves, varias proteínas ribosomales también se sintetizaron más lentamente en células mPanc96 que se cultivaron en geles blandos (Tabla 3). Sin embargo, a diferencia de las células A549, también se encontró que varias proteínas con funciones en la traducción de tener tasas de síntesis altos en las células mPanc96 cuando se cultivan en geles suaves (Tabla 4). Además, mientras que las células A549 mostraron proteínas implicadas en el tráfico de vesículas y el estrés oxidativo las vías que tienen las tasas de síntesis conservados en cápsulas de gel, las proteínas implicadas en estos procesos, tales como subunidades coatomer y la superóxido dismutasa, respectivamente, fueron sintetizados más lentamente en células mPanc96 cultivaron en geles suaves (Tabla 3), lo que sugiere que estos procesos pueden ser regulados a la baja cuando las células están creciendo en mPanc96 microambientes suaves. Curiosamente, varias proteínas que están implicadas en la regulación de la dinámica de adhesión célula-matriz y de actina, incluyendo el miembro de la familia Rac RhoG, fascin, y se invierte formin-2, se encontró que tenían mayores tasas de síntesis cuando las células mPanc96 se cultivan en geles suaves (Tabla 4), además de dos proteínas (citrato sintasa y malato deshidrogenasa) que tienen un papel crucial en el ciclo del ácido cítrico, un proceso metabólico importante para la producción de ATP y de aminoácidos precursores. Estos datos sugieren que cuando la línea celular de rigidez independiente mPanc96 se cultiva en un microambiente suave, hay una disminución en la síntesis de las proteínas implicadas en el tráfico de vesículas y el estrés oxidativo vías, mientras que hay un aumento en la síntesis de las proteínas implicadas en la actina la dinámica y el ciclo del ácido cítrico.
Debido a que estos datos reflejan solamente la síntesis de las proteínas, y los niveles generales de las proteínas están determinadas por el equilibrio de la síntesis y la degradación, hemos tratado de probar si esta alteración de la síntesis de proteínas en realidad estaba afectando a los niveles celulares de estas proteínas. Los lisados de A549 y células mPanc96 cultivadas en geles suaves o rígidas se sometieron a transferencia de Western para la actina, una proteína que había no mostraron cambios significativos en la síntesis relativa cuando se cultivan en geles blandos, y dos proteínas que mostraron una alta sensibilidad a la rigidez, es decir, tubulina y la fosfofructoquinasa-1. Los niveles de las proteínas se normalizaron a GAPDH como control de carga, porque no había una diferencia significativa en la síntesis relativa de GAPDH entre los geles blandos y rígidos (p = 0,55, véase la Tabla S1, línea 275). Como se muestra en la Figura 6, la actina se expresó en niveles similares cuando cultivadas en geles blandos o rígidos, mientras que los niveles de tubulina y PFKP-1 fueron más bajos en los geles blandos en las células A549, lo que sugiere que la tasa más baja de la síntesis de estas proteínas observó en el SILAC de datos se refleja en los niveles más bajos de estas proteínas en las células. En contraste, las células mPanc96 no mostraron cambios en la tubulina o los niveles de PFKP-1 cuando se cultiva en geles blandos. Estos datos indican que, al menos para las proteínas examinadas (de tubulina y PFKP-1), una tasa más lenta de la síntesis se corresponde con los niveles más bajos de proteína celular.
A. Los niveles de actina, tubulina y la fosfofructoquinasa-1 en células A549 cultivadas en (19200 Pa) geles suaves (150 Pa) o rígidos se analizaron por Western blot. Los paneles inferiores muestran los niveles de GAPDH como control de carga. B. Los niveles de actina, tubulina, y PFKP-1 en las células mPanc96 cultivadas en geles blandos o rígidos como analizaron por Western blot. Los paneles inferiores muestran los niveles de GAPDH en lisados de células como control de carga. C. La cuantificación de los resultados de Western blot en (A) y (B). Los niveles de cada proteína se normalizaron a la cantidad de GAPDH en cada muestra. Los niveles de proteína en las muestras preparadas a partir de geles rígidos se fijaron a 100%, y los niveles de proteína en las muestras suaves se muestran como expresión porcentaje de estas muestras. Los resultados muestran la media ± S. E. de al menos tres experimentos. * P & lt;. 0,05 en comparación con el nivel de expresión de actina
Discusión
En este trabajo se demuestra que la rigidez de la matriz extracelular regula el metabolismo celular y la síntesis de proteínas en el cáncer Células. Las líneas celulares de cáncer de rigidez dependiente de A549 y MDA-MB-231 sostienen la expresión de la ciclina D1 cuando se cultivan en suero en geles de poliacrilamida que tienen propiedades mecánicas similares a la del tejido blando, tal como de pulmón o de mama. A pesar de la expresión de ciclina D1, las células A549, cuando se cultivan en geles blandos, muestran un alargamiento de la fase G1 del ciclo celular, lo que sugiere que puede haber defectos en la síntesis de los componentes estructurales y enzimáticas necesarias para la transición a la fase S . De acuerdo con ello, las líneas celulares de rigidez dependiente muestran niveles más bajos de los niveles celulares de ATP cuando se cultiva en geles blandos. Además, la síntesis de proteínas en las células A549 es más lenta en estas condiciones, con la síntesis de proteínas estructurales específicos y las enzimas glicolíticas tales como la tubulina, la fosfofructoquinasa, y la ATP sintasa especialmente sensibles a la disminución de la rigidez extracelular. Las proteínas que eran menos sensibles a la variación de la rigidez incluyen enzimas tales como la aldo-ceto reductasa y fosforribosiltransferasa nicotinamida que están involucrados en el metabolismo de los productos de ROS.
rigidez Matrix ha sido sugerido para ser un mecanismo subyacente en el tropismo tisular de las metástasis del cáncer, porque el crecimiento de líneas celulares de carcinoma en geles suaves o rígidas se correlaciona con su capacidad para crecer en los tejidos blandos o rígidos [5], [14]. Sin embargo, el mecanismo (s) que regulan el crecimiento de las células cancerosas de una manera específica de tejido son, sin duda complicado. Nuestras observaciones sugieren que una forma en que las células de cáncer de rigidez dependiente pueden responder a un entorno de tejido de matriz de menos de favorable es para disminuir su estado metabólico, que ofrece un mecanismo potencial para el tropismo de tejido observada de las células tumorales, y tal vez el tejido dependiente la latencia del tumor.
latencia del tumor se define como una etapa en la progresión del cáncer en el que la enfermedad residual está presente pero es asintomática [15]. células de cáncer inactivas pueden residir sin detectar en sitios distantes del tumor primario, en espera de posterior crecimiento y la recurrencia clínica [16]. Estudios recientes apoyan un modelo en el que las células cancerosas desde el tumor primario difundirá la fase inicial de progresión de la enfermedad, de modo que para el momento en que se detecta el tumor primario, puede haber células cancerosas latentes que ya residen en sitios distantes [17]. Estas células son de forma temporal no proliferativa, o hay un equilibrio entre la proliferación y la muerte celular, o el sistema inmunológico es mantener el número de células en el cheque. Es interesante que la última posibilidad ha sido objeto de escrutinio debido a los estudios que muestran una falta de recidiva tumoral en pacientes con cáncer que han sido sometidos a tratamiento inmunosupresor [18].
Los estudios recientes han implicado el microambiente como un regulador clave de la latencia de células tumorales y reaparición. Específicamente, las propiedades de la matriz extracelular en los sitios de metástasis pueden desempeñar papeles importantes en la determinación del estado de las células tumorales diseminadas [9]. Sin embargo, la visión mecanicista en cuanto a cómo se produce la latencia es escasa, ya que las células cancerosas latentes son difíciles de detectar y estudiar in vivo, y hay una escasez de modelos in vitro para la latencia de las células tumorales. Hasta hace poco, estos modelos se han limitado a las células cultivadas en membranas corioalantoideas (CAMs) o en matriz 3D derivados del tumor Engelbreth-Holm-Swarm (EHS matriz, o Matrigel) [19], [20]. Matrigel es una mezcla de laminina, colágeno IV, y nidogen, además de una variedad de proteasas y factores de crecimiento tales como TGF, FGF, EGF, PDGF, IGF y [21]. Debido a que se genera a partir de un tumor, la composición específica de Matrigel no está bien definida, y puede variar de lote a lote, la producción de variabilidad en los resultados experimentales [22]. Aunque se han analizado las propiedades mecánicas de Matrigel, que también están sujetas a la variabilidad debido a su polimerización se ve afectada por su composición y otros factores experimentales tales como la temperatura [23]. Además, actualmente la única manera de alterar las propiedades mecánicas de Matrigel es agregar componentes de la matriz adicionales, tales como el colágeno I [24], que también puede complicar la interpretación de los resultados experimentales.
Modelos
Recientemente, in vitro para la la latencia del tumor se han ampliado para incluir el uso de geles de poliacrilamida como sustratos de crecimiento [25]. A diferencia de Matrigel, poliacrilamida es un polímero estable, homogéneo, y sus propiedades mecánicas no son sensibles a los cambios de la temperatura [26]. Su rigidez se puede ajustar fácilmente mediante la modulación de la cantidad de reticulante bis sin afectar a su capacidad para unirse a moléculas de ECM a su superficie [6]. hidrogeles de poliacrilamida pueden abarcar una gama de módulos de elasticidad que incluye una serie de tejidos humanos de grasa en el músculo esquelético [27], y una variedad de moléculas de ECM puede conjugarse a su superficie, incluyendo el colágeno, la fibronectina, y sin polimerizar Matrigel. Además, un sistema de alto rendimiento se ha desarrollado recientemente para permitir la proyección de inhibidores de moléculas pequeñas con las células cultivadas en geles de poliacrilamida que abarcan una gama de módulos elásticos [5], [6].