Extracto
Antecedentes
El cáncer de páncreas es una enfermedad letal con una tasa de supervivencia a los 5 años de sólo el 1-5%. La aceleración del examen histológico intraoperatorio sería beneficioso para una mejor gestión de cáncer de páncreas, lo que sugiere una mejor supervivencia. métodos ópticos no lineales sobre la base de dos fotones de fluorescencia excitado (TPEF) y segunda generación armónica (SHG) de biomarcadores ópticos intrínsecos muestran la capacidad de visualizar la morfología de los tejidos frescos asociados con la histología, que es prometedor para tiempo real evaluación intraoperatoria de cáncer de páncreas .
Metodología /Principales conclusiones
con el fin de investigar si los métodos de imágenes ópticas no lineales tienen la capacidad de caracterizar la histología pancreática a celulares de resolución, se estudiaron diferentes tipos de tejidos pancreáticos mediante el uso libre de etiquetas TPEF y los grupos de autoayuda. En comparación con otros métodos de rutina para la preparación de muestras, se encontró que los tejidos frescos sin transformar al ser más adecuado para formación de imágenes ópticas no lineales de los tejidos pancreáticos. Se observó la morfología detallada del páncreas de rata normal y relacionado con las imágenes histológicas estándar. Comparativamente, las imágenes preliminares de un pequeño número de tejidos de cáncer pancreático inducido por productos químicos mostraron diferencias neoplásicas visibles en la morfología de las células y la matriz extracelular. Los xenoinjertos de tumores pancreáticos subcutáneos se observaron adicionalmente utilizando la microscopía óptica no lineal, lo que demuestra que la mayoría de las células son leucocitos a los 5 días después de la implantación, las células tumorales comienzan a proliferar a los 10 días después de la implantación, y las fibras de colágeno extracelulares se desordenan a medida que crecen los xenoinjertos.
Conclusiones /Importancia
En este estudio, se utilizó la imagen óptica no lineal para caracterizar los detalles morfológicos de tejidos pancreáticos frescas por primera vez. Se demuestra que es posible proporcionar en tiempo real la evaluación histológica de cáncer de páncreas en los métodos ópticos no lineales, que presentan una oportunidad para la caracterización de los avances del cáncer de páncreas espontánea y aplicación adicional de una manera no invasiva.
Visto: Hu W, Zhao G, C Wang, Zhang J, L Fu (2012) Microscopía óptica No lineal de Histología de la dulce normales y cancerosas pancreáticas tejidos. PLoS ONE 7 (5): e37962. doi: 10.1371 /journal.pone.0037962
Editor: Irene Georgakoudi, Universidad de Tufts, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Febrero, 2012; Aceptado: April 26, 2012; Publicado: 24 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación Científica Mayor de China (Nº 2011CB910401), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 61178077), Programa para el Nuevo siglo talentos excelentes en la Universidad (núm NCET-08-0216), y la fundamental los fondos para la investigación Universidades central (HUST: 2011JC046). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en el mundo, con una tasa de supervivencia global a 5 años del 1-5% [1]. Mejor tratamiento puede contribuir a una mejora significativa en la supervivencia del paciente [2]. consulta intraoperatoria que implica principalmente el examen de la muestra extirpados quirúrgicos, es importante que el cirujano para determinar las opciones de tratamiento más apropiadas [3]. Sin embargo, está sujeto a las limitaciones de tiempo. Una sección de congelados diagnóstico individual con alto nivel de precisión tarda 20 minutos, y es mucho más largo cuando se requieren múltiples secciones congeladas para llevar a cabo en un solo espécimen [3]. En tiempo real la histología de los tejidos frescos o vivos sin seccionar o procesamiento adicional, no sólo facilitaría el establecimiento inmediato o la confirmación de un diagnóstico y la etapa durante la intervención que influirá en el procedimiento quirúrgico, sino que también hacen posible evaluar todos los márgenes quirúrgicos de manera que la tumor se elimina por completo sin comprometer la parte normal del páncreas. evaluación de los márgenes quirúrgicos precisa permite la mejora de la supervivencia a largo plazo, ya que los márgenes quirúrgicos positivos se producen entre 37-50% de los pacientes sometidos a resección quirúrgica y la supervivencia global de estos pacientes oscila entre 8 y 14 meses [4]. la detección en tiempo real de patrones morfológicos en la resolución de una sola célula, que es un análogo de la histología, indica una posibilidad atractiva para el manejo intraoperatorio óptimo de cáncer de páncreas con beneficio en la supervivencia favorable.
Los métodos ópticos, aprovechando no invasión y alta resolución tempo-espacial, pueden lograr
in vivo
de imágenes y detección en estudios biomédicos. espectroscopia Raman, que se basa en la diferencia en la energía de la incidente y fotones dispersados debido a las vibraciones moleculares, es sensible a los cambios de la composición química en células y tejidos. Se ha aplicado a la diferenciación de los tejidos pancreáticos normales y cancerosas de un modelo de ratón [5]. Reflectancia y la espectroscopia de fluorescencia pueden proporcionar información bioquímica de los tejidos para distinguir diferentes tejidos pancreáticos humanos, incluyendo el tejido normal pancreático, pancreatitis, y el adenocarcinoma de páncreas [6], [7]. modelos de interacción de fotones de tejidos se han desarrollado para proporcionar enlaces cuantitativas entre las mediciones de reflectancia y fluorescencia y las características histológicas de los tejidos pancreáticos humanos, tales como el tamaño nuclear [8], [9]. Sin embargo, los parámetros espectrales son difíciles de ser emparejado directamente con las características morfológicas de manifiesto por el examen histológico convencional, especialmente los cambios de forma nuclear y la organización de la matriz extracelular. caracterización más detallada de la morfología de páncreas con la resolución celular utilizando métodos ópticos es necesario mejorar la detección de la neoplasia de páncreas, lo que implica un nuevo medio de histología en tiempo real.
En los últimos años, la microscopía óptica no lineal (NOM), principalmente incluyendo TPEF y los grupos de autoayuda, se ha convertido en una herramienta poderosa para identificar los cambios estructurales y funcionales leves a celulares de resolución. NOM tiene la ventaja de la resolución submicrónica espacial, la resolución temporal de milisegundos, y la capacidad óptica de seccionamiento en tejidos turbias [10], [11]. Una naturaleza importante de una modalidad de formación de imágenes tal es que los biomarcadores ópticos endógenos en los tejidos se pueden emplear para proporcionar un contraste, lo que hace posible la detección de enfermedades humanas sin la necesidad de la fijación, el corte, o la tinción. Intrínseca de dos fotones excitado fluorescencia biomarcadores (TPEF) incluyendo dinucleótido reducido de nicotinamida adenina (fosfato) [NAD (P) H] y flavina adenina dinucleótido (FAD) se han aplicado a revelar la morfología de las células, puesto que NAD (P) H y FAD son los principales fluoróforos en el citoplasma [12], [13]. Mientras tanto, las fibras de colágeno, que son proteínas estructurales importantes de la matriz extracelular (ECM), se pueden poner en práctica el proceso intrínseco segunda generación armónica (SHG) en los tejidos biológicos para reflejar el patrón de ECM [12], [13]. Además, el NAD intracelular (P) H y FAD también están relacionados con la relación redox de las células, que se puede utilizar como un indicador de nivel metabólico de las células [14], [15]. NOM se ha aplicado ampliamente para visualizar estructuras celulares y tisulares en diferentes tejidos de cáncer de ovario, incluyendo, la vejiga, los tejidos gástricos, y así sucesivamente [14], [16] - [20].
primero, a nuestro conocimiento , caracterizado los detalles morfológicos de tejidos pancreáticos utilizando técnicas de SHG TPEF y sin etiqueta. En un esfuerzo para evaluar la viabilidad de la NOM para la caracterización morfológica detallada de los tejidos pancreáticos, hemos aplicado técnicas de SHG TPEF y libre de etiquetas de páncreas de rata normal y emparentados con las imágenes tradicionales de tinción histológica. Diversos medios de rutina para la preparación de las muestras se han comparado para adquirir óptima de formación de imágenes óptico no lineal de los tejidos pancreáticos. Los tejidos de cáncer pancreático inducido por productos químicos se caracterizan, además, y se compararon con muestras normales de páncreas para validar la capacidad de la NOM para revelar los cambios neoplásicos. Con el fin de evaluar el potencial de las técnicas de los grupos de autoayuda para caracterizar diferentes etapas durante el crecimiento del cáncer de páncreas TPEF y libre de etiquetas, los xenoinjertos de tumores pancreáticos subcutáneos cosechadas en diferentes puntos de tiempo después de la implantación se analizaron cuantitativamente en base a sus características morfológicas.
Materiales y Métodos
los modelos animales
Un modelo de cáncer de páncreas inducido por productos químicos que se desarrolla espontáneamente cáncer maligno en el páncreas se utilizó para la comparación de los tejidos neoplásicos a los tejidos normales. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología. cuidado de los animales se proporciona de acuerdo con los procedimientos descritos en la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio", publicado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos. Las ratas Sprague-Dawley macho (100-125 g) se obtuvieron del Centro Animal Experimental de Tongji Medical College (Wuhan, China). Los tumores se indujeron de acuerdo con un protocolo previamente establecido [21]. En resumen, se indujo la anestesia con éter vaporizado, seguido 10 min más tarde por una inyección intramuscular de pentobarbital (20 mg /kg) y ketamina (50 mg /kg). Las ratas fueron sometidos a una laparotomía media con la exposición del segmento de la cabeza del páncreas. El parénquima se realizó una incisión paralela al curso del conducto biliar común, y un bolsillo se desarrolló en el parénquima pancreático en el sitio de la incisión. Se implantaron 5 mg de cristales DMBA y asegurados en su lugar por medio de un 6-0 prolene sutura en bolsa de tabaco. Los tumores se cosecharon y la imagen a los 9 meses después de la inducción. Recién extirpado los tejidos de un total de 12 (10 normal y 2 del cáncer inducido por productos químicos) se obtuvieron imágenes de ratas y se comparan.
atímicos (nu /nu) sobre un fondo BALB /c, adquirida de Shanghai Laboratory Animal Center (Laboratory SLAC Shanghai Animal Co. Ltd), se utilizaron para el establecimiento del modelo de tumor de páncreas subcutánea. Los experimentos siguieron los procedimientos aprobados por el Comité de Ética Animal Institucional de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología. De seis a ratones macho de ocho semanas de edad, fueron criados en condiciones libres de patógenos específicos (SPF), manteniendo la temperatura a aproximadamente 21 ° C y una humedad del 60-70%, con luz artificial durante 12 h. Los xenoinjertos de tumores se desarrollaron a partir de la línea de células PANC-1 establecido (ATCC, Rockville, MD) [22]. Acerca de 6 × 10
6 células PANC-1 se inocularon por vía subcutánea a la izquierda y en blanco los xenoinjertos tumorales subcutáneos se recogieron a las 5, 10, 20, 30 días después de la implantación, respectivamente. Un total de 20 ratones con xenoinjertos de tumores (5 ratones para cada etapa) se utilizaron para la formación de imágenes y el análisis cuantitativo.
Preparación de las muestras de páncreas
Los animales fueron sacrificados con una sobredosis de isoflurano, y luego los tejidos pancreáticos se diseccionaron y la imagen. Antes de formación de imágenes, los tejidos recién extirpadas incluyendo el páncreas de ratas normales, los tejidos de cáncer pancreático inducido por productos químicos y los xenoinjertos de tumores subcutáneos, se incubaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La mitad de cada muestra a continuación, se visualizó de inmediato y la colección de todas las imágenes que se terminó el plazo de 1 hora después de la disección. La otra mitad de cada muestra se utilizó para el análisis histológico.
Para investigar las condiciones óptimas para la formación de imágenes ópticas no lineales de los tejidos pancreáticos, se compararon las imágenes ópticas no lineales de frío, y tejidos almacenados, fijos rata criopreservado pancreáticos con los de los tejidos frescos respectivamente, ya que la estructura de los tejidos puede ser mantenida por la fijación y se ha informado de que los componentes fluorescentes intrínsecas (NAD (P) H y FAD) se pueden detectar con un alto grado de precisión por debajo de -80 ° C [23]. Los tejidos pancreáticos almacenados en frío se almacenaron en 4 ° C durante 4 horas, 12 horas, y 24 horas después de la escisión, respectivamente. Los tejidos fijados se procesaron con 4% de paraformaldehído en PBS durante 19 horas. Los tejidos criopreservados se congelaron a -196 ° C en nitrógeno líquido durante al menos 30 minutos. Todos los tejidos se transfirieron a PBS después del procesamiento y luego con imagen formada a temperatura ambiente.
formación de imágenes ópticas no lineales
imagen óptica no lineal se realizó usando un sistema modificado basado en un microscopio comercial (Fluoview 1000, Olympus , Japón) equipado con un Ti: Sapphire láser (Mai Tai, Spectra-Physics) con una frecuencia de repetición de 80 MHz (Fig 1).. La salida de 750-nm del sistema de láser se utilizó para la excitación salvo donde se indique lo contrario. La potencia media de láser en la superficie de la muestra fue de aproximadamente 15 mW. La velocidad de barrido es 10 microsegundos /píxel. Las señales emitidas son recogidos por el objetivo de enfoque (60 × /1.2 NA inmersión en agua, Olympus). Dos filtros de paso de banda (FF01-380 /14-25 y FF01-445 /45-25, Semrock) se emplearon antes de que los tubos fotomultiplicadores para detectar las señales de los grupos de autoayuda y TPEF, respectivamente. La señal de SHG fue confirmada por la propiedad de dependencia de longitud de onda, ya que no había señal detectada en el rango de nm 380/14 a longitudes de onda más larga que 780 nm. La representación de volumen 3D de ImageJ (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Maryland) se utilizó para la presentación de la imagen.
Análisis cuantitativo de tamaño nuclear y colágeno
En cada etapa de la subcutánea xenoinjertos de tumores de páncreas, de 80 células en las imágenes ópticas no lineales se eligieron visualmente y los diámetros del núcleo se midieron manualmente para estimar tamaños nucleares. Los tamaños nucleares promedio de los xenoinjertos de tumores pancreáticos subcutáneos cosechadas en diferentes etapas se calcularon, respectivamente.
Para el análisis de colágeno, el contenido de fibras de colágeno para cada muestra se evaluó por la proporción del número de píxeles que el colágeno fibras cuenta de que el número total de píxeles de la imagen. 40 imágenes consecutivas axiales de la superficie se calcularon para obtener el valor promedio de contenido para todas las muestras. El método de la matriz nivel de co-ocurrencia gris (GLCM), que es un método de análisis de la textura sobre la base de la estimación de la función de segundo orden conjunta condicional de densidad de probabilidad [24], [25], se utilizó para caracterizar la morfología de las fibras de colágeno.
la significación estadística se calculó con ANOVA contraste lineal utilizando el software SPSS (SPSS). Todos los valores de p de 0,05 o menos se consideraron como significativos mencionado como tal en el texto.
Análisis histológico
Los tejidos pancreáticos se fijaron con formalina al 10% tamponada neutra, y las secciones incluidas en parafina con un espesor de 5 micras se prepararon de forma rutinaria. Las secciones de tejido se tiñeron posteriormente con hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson, respectivamente. La tinción hematoxilina-eosina se utilizó para la evaluación de la morfología celular, y tricrómico de Masson se utilizó para la detección de fibras de colágeno en tejidos pancreáticos. imágenes histológicas fueron adquiridos utilizando un microscopio óptico (IX81, Olympus, Japón) equipado con un objetivo de 20 × aire y un color de la cámara industrial digital (DFK 41BU02, The Imaging Source Europe GmbH, Alemania).
Resultados y Discusión
Visualización de los detalles morfológicos de los páncreas de ratas normales
el páncreas es una glándula importante tanto con funciones endocrinas (Fig. 2A) con una cápsula de tejido conectivo fibroso fino que envuelve el parénquima pancreático exocrino y. La porción exocrina del páncreas consta de racimo de uvas de las células acinares pancreáticas llamados acinos que sintetizan y secretan enzimas digestivas en el duodeno a través de los sistemas ductales. Las células acinares pancreáticas muestran una forma piramidal con citoplasma apical que contienen gránulos de zimógeno y un núcleo prominente situado cerca de la membrana celular basolateral. La porción endocrina del páncreas representa aproximadamente el 1-2% de la masa pancreática total y se compone de islotes pancreáticos dispersas que contienen grupos de diferentes tipos de células productoras de hormonas
.
(A) La organización anatómica del páncreas de rata normal se compone de acinos exocrinas y endocrinas islotes pancreáticos. RBC: glóbulos rojos. (B) La imagen óptica no lineal del páncreas de rata normal a una profundidad de imagen de 6 micras. La estructura de código de color rojo es el colágeno, y el color verde para el componente fluorescente. La barra de escala es de 30 micras. (C) La imagen óptica no lineal del páncreas de rata normal a una profundidad de imagen de 23 micras. Los asteriscos, puntas de flecha y las flechas indican los núcleos, células acinares, las fibras de colágeno, respectivamente. (D) La imagen óptica no lineal del páncreas de rata normal a una profundidad de imagen de 27 micras. El círculo de puntos indica el patrón de acinos pancreáticos. (E) El acinos pancreáticos se puede observar en la imagen hematoxilina y eosina. (F) tricrómico demostración de la imagen pequeña cantidad de fibras de colágeno de la Masson se distribuyen alrededor de los acinos pancreáticos de las muestras de ratas normales.
La imagen óptica no lineal a una profundidad de imagen de 6 micras muestra la cápsula de tejido conectivo fibroso en la superficie del páncreas (Fig. 2B), como se indica por la señal de SHG. En el parénquima pancreático, los núcleos de las células no fluorescentes aparecen regiones oscuras y circulares situados cerca de la membrana celular basolateral (asteriscos en la Fig. 2C) y la acinares pancreáticas individuo (puntas de flecha en la Fig. 2C), las células pueden ser claramente identificados en la capa superficial de los acinos (profundidad de imagen de 23 micras). Además, una pequeña cantidad de fibras de colágeno (flechas en la Fig. 2C) distribuidos en la matriz extracelular alrededor de los acinos, que está en correspondencia con las imágenes tricrómico de Masson-manchado (Fig. 2F). La figura 2D muestra que las células acinares están dispuestos en un patrón (círculo punteado) similar al conjunto estructural de los acinos exocrina (Fig. 2A) en la capa profunda (profundidad de formación de imágenes de 27 micras). Los racimo de uvas de las células acinares también se pueden observar en las imágenes correspondientes hematoxilina-eosina microscópicos (Fig. 2E). Sin embargo, en comparación con las imágenes microscópicas ópticas no lineales, las imágenes histológicas son difíciles de visualizar la cápsula fibrosa y la 3-D conformación de las células acinares. También se proporciona una película suplementario para mostrar una pila profundidad de resolución temporal del páncreas (Video S1). Además, la disposición 3-D de las células acinares se valida adicionalmente mediante la tinción de los núcleos con un colorante fluorescente (Figura S1). Nuestros resultados demuestran que la microscopía no lineal tiene la ventaja de 3D visualización del páncreas sin rodajas de tejido o de co-registro sobre los métodos histológicos
.
Se dice que el islote pancreático normal a ser penetrada por una densa red de capilares y rodeado por una cápsula de colágeno delgado y hoja glial que separa las células endocrinas del componente exocrino [26]. Sin embargo, no había ningún patrón similar a los islotes presentes en las imágenes ópticas no lineales, posiblemente debido a la escasa población de islotes. Larger lectura de área con colorantes específicos puede facilitar aún más la identificación de la estructura de los islotes pancreáticos.
Los resultados demuestran que la fluorescencia TPEF intrínseca de las células pancreáticas y la señal de SHG de las fibras de colágeno en la matriz extracelular pueden visualizar la morfología de las células pancreáticas y componentes extracelulares mediante el uso de microscopía óptica no lineal.
origen del contraste intrínseco
está bien documentado en la literatura que las principales fuentes de señal TPEF en el citoplasma son NAD (P) H y FAD con espectros de emisión que pico a 460 nm y 530 nm, respectivamente [13], [14], [27]. Detectamos la autofluorescencia en el intervalo de 500 a 550 nm en la longitud de onda de excitación de 750 nm y se encontró que la intensidad es mucho menor que en el intervalo de 425 a 470 nm (datos no mostrados). Dado que los fluoróforos intrínsecos muestran fuerte emisión en el canal de 425 a 470 nm cuando se excita a 750 nm, se especula que la fluorescencia intrínseca de los tejidos pancreáticos proviene principalmente de NAD (P) H, y FAD tiene una contribución menor a la emisión intrínseca.
colágeno fibrilar se ha informado para mostrar una estructura no centrosymmetrical, por lo que es un contribuyente principal a la señal de SHG en los tejidos biológicos [13], [28]. De acuerdo con la morfología y la distribución de las fibras revelados por las imágenes de GAA, se espera que el origen de la señal de SHG del páncreas ser las fibras de colágeno en la matriz extracelular.
Condiciones óptimas para la formación de imágenes intrínseca de los tejidos pancreáticos
se ha informado de que la concentración de NAD (P) H y FAD se asocia con la relación redox, que es sensible a los cambios en la tasa metabólica celular y el suministro de oxígeno vascular [29]. Por lo tanto, hemos fotografiado 4 ° C almacenados, fijo, y cyropreserved tejidos pancreáticos para investigar las condiciones óptimas para la formación de imágenes ópticas no lineales de los tejidos pancreáticos. En comparación con los tejidos frescos (Fig. 3A), las imágenes ópticas no lineales de los tejidos pancreáticos almacenados en 4 ° C durante 4 horas muestran la morfología de la acinos pancreáticos con menor contraste (Fig. 3B). Sólo unas pocas células pancreáticas se pueden observar con la disminución de la intensidad de la fluorescencia en el tejido pancreático almacenada en 4 ° C durante 12 horas (Fig. 3C)), mientras que la fluorescencia intrínseca convertirse en insignificante y las células se puede apenas identificada para los almacenados en 4 ° C durante 24 horas (Fig. 3D). La reducción de la intensidad de la fluorescencia intrínseca y la pérdida de las células pancreáticas puede resultar de la disminución de la viabilidad de los tejidos pancreáticos bajo la privación de oxígeno y nutrición después de la resección. En particular, el proceso de autodigestión inducida por la lesión del páncreas puede probablemente acelerar el daño de los tejidos pancreáticos
.
La fluorescencia intrínseca de (A) los tejidos frescos, los tejidos almacenados en 4 ° C para (B) se detectaron 4 horas, (C) 12 horas, y (d) 24 horas, (e) tejidos fijos, así como (F) tejidos congelados. La barra de escala es de 30 micras.
La figura 3E muestra que la organización de los acinos pancreáticos se conservó intacta después de la fijación. Sin embargo, la intensidad de la fluorescencia disminuyó significativamente, posiblemente debido a la desnaturalización de la proteína durante el proceso de fijación y los cambios en las concentraciones de inhibidor de la fluorescencia [29]. En comparación, los tejidos pancreáticos criopreservados mostraron fluorescencia aún más baja en la Figura 3F, ya que el celular de NAD (P) H puede desaparecer a causa de la muerte de las células después de la congelación y descongelación a temperatura ambiente durante la exploración.
La resultados anteriores muestran que la morfología de los tejidos pancreáticos puede delinear con mayor precisión por imágenes de tejidos frescos sin procesamiento adicional. Por lo tanto, los tejidos pancreáticos frescas incubadas en PBS se utilizaron para el análisis posterior. También hemos investigado la longitud de onda de excitación óptima para la formación de imágenes ópticas no lineales de los tejidos pancreáticos, ya que la fluorescencia intrínseca es relativamente débil. La longitud de onda de excitación se sintoniza en el rango de 730-840 nm para realizar las imágenes tejido pancreático. Se encontró que 750 nm era la longitud de onda óptima para el sistema de imagen microscópica se utilizó. La potencia del láser en la superficie de las muestras se ensayó para lograr imágenes con alta relación de señal a ruido. En el caso de una potencia media de alrededor de 15 mW, no hubo daño solar visible o photobleaching después de la adquisición de una serie de cortes axiales consecutivos.
Comparación de normales y cancerosas tejidos pancreáticos
The tejidos de cáncer pancreático inducido por productos químicos se obtuvieron imágenes y asociados con las imágenes histológicas (Fig. 4). En comparación con el páncreas normal, mayor tamaño nuclear y marcada variación en el tamaño y la forma nuclear se pueden observar en los tejidos de cáncer pancreático inducido por productos químicos, lo cual es coincidente con las características típicas de las células cancerosas. Además, la densidad de las fibras de colágeno aumentado, lo que se asemeja a la fibrosis del estroma intensiva manifiesta en pacientes con cáncer de páncreas [30]. Las diferencias obvias de la apariencia morfológica entre lo normal y los tejidos de cáncer de páncreas inducido por productos químicos indican que los métodos ópticos no lineales muestran la capacidad de detectar lesiones neoplásicas en tejidos pancreáticos anormales.
Las células de cáncer de páncreas (A) con vario tamaño y forma, así como las fibras de colágeno lineales se pueden identificar en la imagen óptica no lineal. La estructura de código de color rojo es el colágeno y el color verde para el componente fluorescente. La barra de escala es de 30 micras. (B) La imagen de hematoxilina y eosina y (C) Imagen tricrómico de Masson muestra la morfología de los tejidos pancreáticos cancerosos en correspondencia con (A).
El crecimiento de los xenoinjertos de tumores pancreáticos subcutáneos
Los xenoinjertos de tumores pancreáticos subcutáneos cosecharon a los 5 días después de la inoculación se compone principalmente de fibras de colágeno y células onduladas pequeños que pueden ser los leucocitos (Fig. 5A). En comparación, las células en los xenoinjertos tumorales cosechadas a los 10 días después de la inoculación muestran núcleos grandes, lo que indica que las células cancerosas comienzan a proliferar (Fig. 5B). Además, las fibras de colágeno son lineales y dispuestas radiante procedente de las células cancerosas, que pueden contribuir a la Impregnación tumor a lo largo de las fibras. Las cantidades de células tumorales se incrementaron en los tejidos tumorales recogidas a los 20 días después de la inoculación (Fig. 5C), mientras que disminuyó en los cosechados a los 30 días después de la inoculación (Fig. 5D), lo que implica que hay necrosis en el centro del tumor . Como los xenoinjertos se desarrollan, las fibras de colágeno se vuelven más fragmentada e irregular, y la densidad de las fibras disminuyeron, que puede estar asociada con la degradación y remodelación de la matriz extracelular durante el crecimiento de los xenoinjertos tumorales.
La xenoinjertos de tumores pancreáticos cosechadas en diferentes etapas, incluyendo (a) 5 días, (B) 10 días, (C) 20 días, y (D) 30 días después de la implantación, se obtuvieron imágenes y relacionados con la histología convencional. Las imágenes de SHG (código de color rojo), las imágenes TPEF (verde código de colores), y la 3-D superponen imágenes SHG /TPEF se muestran en las tres primeras columnas, respectivamente, mientras que las imágenes hematoxilina y eosina e imágenes tricrómico de Masson se muestran en las dos últimas columnas. Todas las imágenes en 3-D son 211 micras × 211 micras x 50 micras. La barra de escala es de 30 micras.
Las imágenes histológicas muestran que extensa necrosis está presente en los xenoinjertos tumorales cosechadas a los 5 días después de la inoculación, y la mayoría de las células son neutrófilos, que contienen tres o cuatro lóbulos nucleares (Fig. 5A). A los 10 días después de la implantación, la mayoría de las células son células tumorales, y fibras de colágeno lineales largas abundantes están presentes (Fig. 5B). A los 20 días después de la implantación, de alta densidad de las células tumorales puede ser visto y relativamente menor contenido de fibras de colágeno se produce (Fig. 5C). Finalmente, a los 30 días después de la implantación, necrosis dispersa se puede observar en el centro del tumor (Fig. 5D). Se encontró que los resultados de TPEF libre de etiqueta y de formación de imágenes SHG son consistentes con los métodos tradicionales de tinción histológica.
Análisis cuantitativo de el tamaño nuclear muestra que el diámetro de los núcleos de las células cosechadas a los 10 días después de la inoculación se encuentra entre que cosecharon a los 5 días (unos 6 m) y los cosechados después de 20 días (a distancia, principalmente entre 10 micras y 13 micras). Esto indica que el proporation de las células tumorales a los neutrófilos aumenta a medida que los xenoinjertos de crecer (Fig 6, p & lt;. 0,001, ANOVA contraste lineal entre el tamaño a los 5 días y los 20 días después; n = 5 para cada grupo). Se revela que el tamaño nuclear de las células se puede obtener usando formación de imágenes ópticas no lineales, que es importante para la detección de células tumorales. La densidad de las fibras de colágeno también se ha calculado para los xenoinjertos tumorales cosechadas en diferentes etapas respectivamente. Se puede observar que la cantidad de las fibras de colágeno disminuye gradualmente a medida que el tumor crece y la densidad a los 5 días difería significativamente de los 20 días después (Fig. 7A). Para la cuantificación de los cambios estructurales de las fibras de colágeno, se utilizó el método GLCM para el análisis de la textura. La correlación es una característica de textura extraído de GLCM y se puede utilizar para estimar la dirección de la textura. Como muestra la Figura 7B indica, las curvas de correlación de los tejidos tumorales cosechadas después de 10 días son más bajos que los cosechados a los 5 días, correspondiente a las fibras de colágeno más desordenados. El Corr
50, calculado por la distancia de píxeles donde la correlación se redujo a 50% del valor inicial, es significativamente mayor en los xenoinjertos cosechadas a los 5 días en comparación con los cosechado a los 10 días, 20 días, y 30 días (Fig . 7B; p = 0,035, ANOVA lineal contraste; n = 5 para cada grupo). Los resultados cuantitativos anteriores son consistentes con la apariencia visual de las imágenes ópticas no lineales.
El tamaño nuclear a los 5 días es significativamente menor que los de 20 días y 30 días. *, P & lt; 0,001, ANOVA de contraste lineal. El tamaño de la muestra es 5 para cada grupo (5 ratones). +, Valores extremos en el diagrama de cajas y bigotes;
bares
, la extensión total de los datos.
(A) La densidad de colágeno disminuye a medida que crecen los xenoinjertos tumorales. La densidad de los tumores a los 5 días es significativamente mayor en comparación con los de 20 días (*, p = 0,033, ANOVA de contraste lineal) y 30 días (**, p = 0,005, ANOVA de contraste lineal). +, Valores extremos en el diagrama de cajas y bigotes;
bares
, la extensión total de los datos. (B) La organización de las fibras colágenas cambios durante el crecimiento de los xenoinjertos de tumores pancreáticos subcutáneos. Una comparación general de los valores de correlación muestra la mayor diferencia entre los xenoinjertos tumorales cosechadas a los 5 días y los cosechados después de 10 días, como se indica por el Corr
50 valor, la distancia donde la correlación cruzado 50% de la correlación inicial. *, P = 0,035, ANOVA de contraste lineal. El tamaño de la muestra es 5 para cada grupo (5 ratones). Las barras de error son una desviación estándar por encima y por debajo de cada punto de datos.
Los neutrófilos y necrosis observadas en los xenoinjertos tumorales subcutáneos cosechadas a los 5 días son posiblemente debido a la respuesta inflamatoria durante la reacción de tumor-huésped, ya que se ha informado de que el sistema inmune del huésped residual puede participar en la regresión del tumor en las etapas tempranas después de la inoculación de xenoinjertos de tumores [31]. La densidad de las células de cáncer se incrementó de 10 a 20 días, mientras que se redujo la necrosis y dispersa apareció a los 30 días.