Extracto
ADN varados estructuras secundarias y cuatro G-quadruplex Recientemente se han visualizado en los núcleos de células humanas cultivadas. Aquí, mostramos que BG4, un anticuerpo G-cuádruplex-específica, se puede utilizar para teñir las estructuras G-quadruplex de ADN en tejidos derivados del paciente mediante inmunohistoquímica. Observamos un número significativamente elevado de núcleos G-quadruplex-positivas en cánceres humanos de hígado y el estómago en comparación con el fondo del tejido no neoplásico. Nuestros resultados sugieren que la formación de G-quadruplex puede ser detectado y medido en el material derivado del paciente y que la formación de G-quadruplex elevada puede ser una característica de algunos tipos de cáncer
Visto:. Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) Niveles elevados de G-quadruplex formación en el estómago humano y el cáncer de hígado tejidos. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10.1371 /journal.pone.0102711
Editor: Mark Isalan, el Imperial College de Londres, Reino Unido
Recibido: 28 de mayo de 2014; Aceptado: June 23, 2014; Publicado: 17 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Biffi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Los autores agradecen a la Investigación del Cáncer del Reino Unido para la subvención del programa (C9681 /A11961) y la financiación institucional fundamental al laboratorio Balasubramanian, y por una beca de doctorado de GB (http://www.cancerresearchuk.org). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción estructuras secundarias
no canónica de ADN G-quadruplex pueden formarse a partir de secuencias de ADN ricas en guanina del tipo G
3 + N
L1 G
3 + N
L2 G
3 + N
L3 G
3+ (N = cualquier base y L = bucle) y tales motivos de secuencia son frecuentes en todo el genoma humano [1], [2]. G-quadruplex son estructuras que componen las pilas de tétradas formadas a través de enlaces de hidrógeno de Hoogsteen de cuatro guanines coordinados por un catión monovalente centro de [3] de cuatro varados. Los oligonucleótidos plegadas en una estructura G-quadruplex
in vitro
tienen una alta estabilidad termodinámica en condiciones cercanas a las fisiológicas, en consonancia con su formación en las células [4]. La ubicación prevista del G-quadruplex motivos de secuencia en regiones reguladoras del genoma, tales como promotores y los telómeros, sugiere que las estructuras G-quadruplex pueden tener un papel importante en la función del genoma [5] - [7]. Un número de helicasas que resolver G-quadruplex han sido identificados y son la hipótesis de contribuir a las funciones del genoma normales, tales como la replicación, la transcripción y el mantenimiento de la estabilidad del genoma [8]. La visualización de las estructuras G-quadruplex de ADN en las células humanas ha apoyado la existencia de G-quadruplex en el genoma [9]. En estos experimentos, un anticuerpo G-quadruplex específica altamente selectivo (BG4) se generó mediante la presentación de fagos y se emplea para visualizar focos discretos de las estructuras G-quadruplex en los núcleos de las líneas celulares de cultivo de tejido humano. Este anticuerpo ha proporcionado una oportunidad para investigar el papel celular de G-quadruplex y también su potencial implicación en la enfermedad.
G-quadruplex estructuras se han sugerido que se asocia con las funciones celulares tales como la replicación y transcripción. Por ejemplo, la estabilización de G-quadruplex por una molécula pequeña puede reprimir la transcripción de ciertos oncogenes y /o inducir daño en el ADN en los telómeros y oncogenes que conduce a la replicación defectos y la muerte celular [10] - [17]. G-quadruplex estructuras también pueden estar ligados a la inestabilidad del genoma y la secuencia de motivos G-quadruplex se han encontrado próximo a los puntos de interrupción de ADN y los sitios de número de copias somáticas cambios observados en varios tipos de cáncer [18], [19]. Las helicasas que resuelven G-quadruplex también se encuentran localizados en los sitios de la inestabilidad del genoma [20] - mutaciones [22], y enfermedades como la floración de los síndromes de Werner, que muestran mayores niveles de inestabilidad del genoma y una predisposición al cáncer, han contribuyen en G helicasas de resolución de -quadruplex [23].
Teniendo en cuenta la posible relación entre las estructuras G-quadruplex y las enfermedades humanas, es un objetivo importante para hacer frente a si el G-quadruplexes pueden detectarse en los tejidos humanos. Por ello, investigó la detección de ADN G-quadruplex en los tejidos de pacientes-derivado y si hay diferencias en los niveles de G-quadruplex entre los tejidos no neoplásicas y cáncer. Al emplear el anticuerpo G-quadruplex específica, BG4, en inmunohistoquímica con (FFPE) secciones de microarrays de tejidos fijados con formalina embebidos en parafina, se ha detectado ADN formación G-quadruplex generalizado en los núcleos de tejidos humanos. La cuantificación de los núcleos celulares BG4 positivos reveló más extensa formación de estructuras G-quadruplex en los cánceres de estómago e hígado en comparación con el fondo correspondiente tejidos no neoplásicos. Estos resultados sugieren que el tratamiento de las estructuras G-quadruplex es mal regulados en algunos cánceres humanos.
Resultados y Discusión
Hemos establecido para demostrar la presencia de G-quadruplex en los núcleos de humanos tejidos y para investigar si las diferencias son evidentes en tejidos de cáncer derivados del paciente. Nuestro enfoque se basa en la detección de G-quadruplex nucleares por inmunohistoquímica (IHC) con el anticuerpo G-quadruplex específica, BG4, en microarrays no neoplásicas y cáncer de tejido (TMA). La especificidad y selectividad de BG4 para estructuras G-quadruplex y la aplicación de BG4 en microscopía de inmunofluorescencia (IF) en las células humanas se han descrito anteriormente [9]. Para determinar la idoneidad de BG4 para IHC, primero a prueba este anticuerpo en un sistema modelo utilizando secciones de gránulos de las células FFPE de-231 MDA-MB células de cáncer de mama que fueron observados previamente para mostrar focos G-quadruplex nuclear mediante microscopía SI [9] . Como recuperación del epítopo, o bien (en el pH a base de citrato de 6,0 o Tris /pH a base de EDTA 9,0 tampones) o enzimática (con proteinasa K) mediada por el calor, se requiere a menudo para exponer los sitios antigénicos antes de la unión del anticuerpo, se compararon estos tres epítopo norma recuperación de pre-tratamientos. Después de la incubación BG4, tinción se realizó mediante incubación con un anticuerpo anti-FLAG secundaria, que reconoce un epítopo etiqueta FLAG presente en el anticuerpo BG4, seguido por la detección basada en polímero peroxidasa de rábano Leica utilizando la plataforma de tinción IHC Bond. Siguiendo este protocolo, intensa tinción nuclear se observó con BG4 sólo después de recuperación del epítopo (Figura 1B y S1). No se observó tinción en ausencia de pre-tratamiento (Figura 1A) y controles realizado en ausencia de BG4 mostraron que la recuperación de epítopo con tampón a base de citrato dio menos fondo que con Tris /EDTA (Figura 1C y S1), mientras que pre -Tratamiento con proteinasa K condujo a la tinción nuclear no específica, incluso en ausencia de BG4 (Figura S1). Por otra parte, después de la recuperación de epítopo con citrato o tampones Tris /EDTA, el tratamiento de ADNasa I antes de la tinción BG4 condujo a una fuerte reducción en BG4 intensidad de la señal nuclear (Figura 1D y S1), además de confirmar la detección de ADN G-quadruplex. La señal BG4 nuclear se ve en la IHC es consistente con la detección anterior de focos BG4 en los núcleos de células de cultivo de tejido [9].
A. MDA-MB-231 sedimentos de células de adenocarcinoma de mama humanos se fijaron, embebidos en parafina y se procesaron para IHC usando el BG4 anticuerpo G-quadruplex-específico. No se observa tinción en ausencia de recuperación del epítopo. La barra de escala corresponde a 20 micras. Los núcleos se counterstained con hematoxilina (azul). B. fuerte tinción BG4 (marrón) es fácilmente evidente en los núcleos celulares siguientes la recuperación de antígenos con basado en tampón de citrato pH 6,0. C. No tinción se observó en ausencia del anticuerpo primario BG4. D. No tinción se observa después del tratamiento con DNasa antes de la tinción BG4. Estos resultados muestran que BG4 se puede emplear para la detección de ADN G-quadruplex por tinción IHC.
Después de haber establecido un protocolo para la IHC BG4, primero se confirmó que no neoplásicas muestras de tejido humano biopsias podrían ser teñidas utilizando BG4. En general, se observó patrones de tinción BG4 variadas a través de muchos tejidos que sugiere diferencias en la formación de G-quadruplex entre los tejidos y también entre las células dentro del mismo tejido (Figura S2). Estos resultados indican que la formación general de ADN G-quadruplex en los tejidos humanos complejos se puede evaluar usando BG4 en IHC, extendiendo de este modo la visualización de las estructuras G-quadruplex más allá de IF microscopía en células de cultivo de tejidos. En una encuesta provisional de la tinción BG4 en tejidos de cáncer en comparación con el fondo de tejido no neoplásico, las diferencias en la intensidad o distribución tinción BG4 aparecieron sobre todo concluyentes (datos no mostrados), y en muchos casos la cuantificación rigurosa no fue posible debido a las diferencias significativas en la morfología y presencia de múltiples tipos de células en malignas frente a tejido no neoplásico. Por el contrario, para el hígado y el estómago, nuestro examen provisional sugiere que estos tejidos eran fácilmente cuantificable debido a una apariencia más uniforme dentro de y entre los tejidos no neoplásicas y cáncer. Por ello, utilizó el software de análisis de imágenes Aperio Imagescope Nuclear (v9) para cuantificar el porcentaje de núcleos positivos BG4 presentes en el TMA. Un clasificador de análisis de imagen separada fue desarrollado para cada tipo de tejido para identificar con precisión y tocar objetos separados, con las muestras neoplásicas y no neoplásicas obtuvieron utilizando los mismos parámetros para la comparación exacta. Sorprendentemente, en nueve casos en los que hemos tenido cáncer de hígado duplicado núcleos de TMA con el correspondiente fondo emparejado tejido no neoplásico tomada del mismo paciente, se observó un mayor número de núcleos BG4-positivos en el cáncer (media de 60,3 ± 5,4%) frente no neoplásico (media 18,3 ± 2,12%) núcleos de tejido (Figura 2). Cuando se examinaron los fenotipos individuales de cáncer, se encontró que tanto el carcinoma hepatocelular (CHC) y colangiocarcinoma intrahepático (CPI) mostraron significativamente mayor tinción nuclear BG4 comparación con el tejido no neoplásico (Figura 2A-D y G). Aunque HCC y ICC tienen diferentes orígenes celulares, el desarrollo de hepatocitos o cholangiocytes del conducto biliar, respectivamente, ambos mostraron un mayor número y la intensidad de los núcleos BG4-positivas en comparación con el tejido hepático no neoplásico. Además, en las metástasis (aislado a partir de células grandes sitios de carcinoma de pulmón no diferenciadas) un aumento en la tinción BG4-positivo también se observó (Figura 2E-G). Hemos observado claras diferencias entre el tejido no neoplásico y tumor para un número de diferentes casos de pacientes. De hecho, un análisis de mayor alcance del cáncer y de fondo no neoplásicas núcleos de TMA, incluyendo casos sin emparejar nuevamente mostró un aumento en los núcleos BG4 positivos a través de HCC, el ICC y el carcinoma metastásico (Figura 3A). Cuando todos los casos se consideran en conjunto, un aumento de aproximadamente 2,4 veces en el número de núcleos BG4-positivas se observó en el cáncer de hígado en comparación con el tejido no neoplásico. (P & lt; 0,001, Figura 3B)
Fondo no neoplásicas tejidos del hígado y el cáncer se tiñeron por IHC usando el anticuerpo BG4 G-cuádruplex-específica. A. Los núcleos de tejido hepático no neoplásico de un paciente carcinoma hepatocelular son en su mayoría BG4-negativas, con hematoxilina contratinción (azul) evidente. La barra de escala corresponde a 50 micras. Tenga en cuenta que los gránulos citoplasmáticos son variables y probabilidades de ser artefactos a base de hemo a veces observados en el hígado IHC. B. neoplásica tejido del mismo paciente en una muestra la amplia presencia de núcleos BG4-positiva (marrón). C. Los núcleos de tejido hepático no neoplásico para un paciente colangiocarcinoma intrahepático son en su mayoría BG4-negativas. D. neoplásica tejido del mismo paciente en C muestra muchos núcleos BG4-positivo. E. Los núcleos de tejido hepático no neoplásica de una gran célula indiferenciada pacientes de carcinoma de pulmón metastásico son en su mayoría BG4-negativo. tejido hepático metastásico F. aislado del mismo paciente en E muestra muchos núcleos BG4-positivo. G. La cuantificación del número de núcleos BG4-positivo en el cáncer de hígado y el correspondiente coincide tejidos no neoplásicos de nueve pacientes. Las barras de error representan el error estándar de la media (s.e.m.) calculado cuando se disponía de núcleos de TMA duplicados. En general, estos resultados indican que hay un mayor número de estructuras G-quadruplex en el cáncer de hígado en comparación con el fondo del tejido no neoplásico del mismo individuo.
A. La cuantificación del número de núcleos BG4-positivas en los tejidos del hígado, incluyendo núcleos individuales TMA sin igual. hígado no neoplásico muestra menos núcleos BG4-positivo en comparación con el carcinoma hepatocelular o un colangiocarcinoma intrahepático. Cada columna corresponde a una única muestra de tejido y las barras de error representan el s.e.m. calculada cuando se disponía de muestras de tejido duplicados. B. En general cuantificación del número de núcleos BG4-positivo en todos los tejidos de hígado no neoplásicas y cáncer. Las barras de error representan la s.e.m. ** P & lt; 0,001, n = 19 y 32 para los núcleos no neoplásicas y cáncer, respectivamente. Estos resultados confirman la generalidad de la formación de G-quadruplex más extensa en los cánceres de hígado en comparación con tejidos no neoplásicos.
similar al aumento de la incidencia de G-quadruplex en tejido de cáncer de hígado, una mayor que 3 se observó un aumento -fold en el número de núcleos BG4-positivas en el adenocarcinoma de estómago y carcinoma de células en anillo de sello en comparación con el fondo de tejido no neoplásico tomado del mismo individuo (Figura 4). Un análisis más amplio alcance de cáncer de estómago y de los tejidos no neoplásicos incluyendo casos sin igual reafirmó el aumento en el número de núcleos BG4-positivo visto en el cáncer de estómago en comparación con el tejido no neoplásico (Figura 5). De hecho, el cáncer de estómago individuo subtipos, adenocarcinomas (procedente de epitelio glandular), carcinomas de células en anillo de sello (adenocarcinomas caracterizados por depósito de mucina) y los tumores del estroma gastrointestinal (GIST, KIT-expresión de los sarcomas de origen mesenquimal), todos mostraron un mayor número de núcleos BG4-positivas en comparación con el tejido del estómago no neoplásica (Figura 5A). Cuando todos los casos se consideran en conjunto, ~3.1 veces más núcleos BG4-positivas se encontraron en el cáncer frente a tejidos no neoplásicos (figura 5B, P & lt; 0,001). Es notable que varios subtipos de tumores de estómago, que tienen diferentes etiologías y la progresión, se caracterizan por aumento de la tinción BG4. Estos resultados son, por tanto, muy sugerente de un vínculo general entre una mayor presencia de estructuras G-quadruplex y el desarrollo del cáncer de estómago.
El adenocarcinoma gástrico y carcinoma de células en anillo de sello y de fondo emparejaron los tejidos no neoplásicos tomada del mismo paciente fueron manchadas con la BG4 anticuerpo G-cuádruplex-específica por IHC. A. Los núcleos de tejido del estómago no neoplásico de un paciente adenocarcinoma gástrico son en su mayoría BG4-negativas, con contratinción de hematoxilina (azul) fácilmente evidente. La barra de escala corresponde a 50 micras. B. Adenocarcinoma tejido del mismo paciente en una muestra extensas número de núcleos BG4-positiva (marrón). C. Los núcleos de tejido del estómago no neoplásico de un paciente carcinoma de células en anillo de sello son en su mayoría BG4-negativo. D. Sello de tejido de carcinoma de células en anillo del mismo paciente en C muestra muchos núcleos BG4-positivo. E. Cuantificación del número de núcleos BG4-positiva en los cánceres de estómago y emparejados fondo tejidos no neoplásicos de dos pacientes diferentes. Las barras de error representan la s.e.m. calculada cuando se disponía de núcleos de TMA duplicados. Estos resultados indican que hay más estructuras G-quadruplex en los núcleos de tejido de cáncer de estómago que en el tejido no neoplásico del mismo individuo.
Confirmación de la mayor presencia de núcleos BG4-positivo en una gama de tejidos de cáncer de estómago en comparación con los tejidos de fondo no neoplásico, incluyendo casos sin igual. A. Los núcleos de los tejidos del estómago no neoplásicas son en gran parte BG4-negativas. Los núcleos celulares se counterstained con hematoxilina (azul). La barra de escala corresponde a 50 micras. tejidos de adenocarcinoma gástrico B. muestra la extensa presencia de núcleos BG4-positivo (marrón). El carcinoma de células en anillo C. Signet muestra muchos núcleos BG4-positivo. D. tumores del estroma gastrointestinal (GIST) son en gran parte BG4-positivo (para el estudio de cáncer de estómago sólo GIST tejidos inigualables estaban disponibles). E. La cuantificación del número de núcleos BG4-positivas en los tejidos del estómago individuales, incluyendo núcleos de TMA sin igual. tejido del estómago no neoplásico muestra menos núcleos BG4-positivo en comparación con adenocarcinoma, carcinoma de anillo de sello o GIST. Cada columna corresponde a una única muestra de tejido y las barras de error representan el s.e.m. calculada cuando se disponía de muestras de tejido duplicados. F. En general cuantificación del número de núcleos BG4-positivo en todos los tejidos hepáticos no neoplásicos y el estómago. Las barras de error representan la s.e.m. ** P & lt; 0,001, n = 10 y 34 para los núcleos no neoplásicas y cáncer, respectivamente. Estos resultados confirman la generalidad de más extensa formación de G-quadruplex en los cánceres de estómago en comparación con los tejidos no neoplásicos.
En el hígado y el estómago TMA, algunos núcleos de tejido de cáncer mostraron poca o ninguna tinción BG4 cuantificable , quizás reflejando un problema en la estabilidad epítopo durante la recogida de la biopsia quirúrgica o, alternativamente, que apunta a una variabilidad real en la formación del G-quadruplex en estos tejidos particulares. Sin embargo, es de notar que en ningún caso era cualquier hígado o el estómago tejido no neoplásico ampliamente BG4-positivo. Esta última observación confirma además que el aumento en el número de células BG4-positivos observados en los núcleos cáncer TMA refleja una diferencia real en presencia G-quadruplex entre los estados no neoplásicos y malignas. El análisis de la tinción de G-quadruplex en otros tipos de cáncer, por tanto, puede ser posible y el análisis preliminar de tejido pancreático sugiere que, mientras que la tinción BG4 en el páncreas no neoplásico está muy extendido, hay un aumento ~1.6 veces de BG4 tinción nuclear en los tejidos de adenocarcinoma ( P & lt;. 0,01, Figura S3)
en general, nuestros resultados demuestran que el G-quadruplex pueden ser visualizados por IHC en tejidos no tumorales y cáncer humano se extienden nuestros hallazgos anteriores que revelaron la presencia de estructuras G-quadruplex en los núcleos de las líneas celulares de cultivo [9]. Es de destacar que se observó un aumento en el número de células G-quadruplex-positivo para algunos tejidos de cáncer en comparación con los casos no neoplásicas. Los datos que se presentan en sí mismas no explica por qué más G-quadruplex son evidentes en los casos de cánceres de estómago e hígado. Sin embargo, hay varias líneas de evidencia en la literatura que sugieren una posible asociación o relación causal entre el G-quadruplex y mecanismos que contribuyen al desarrollo del cáncer o la progresión. Por ejemplo, las estructuras G-quadruplex, si no se resuelve durante la replicación del ADN, pueden representar sitios frágiles que promueven la inestabilidad del genoma, que es una característica bien conocida de cáncer [24]. De hecho, la secuencia de motivos G-quadruplex se encuentran en los puntos de interrupción de ADN que conducen a desplazamientos dentro del gen BCL2 en linfomas y dentro del gen HOX11 en las leucemias de células T [25], [26]. análisis computacional también han sugerido posibles asociaciones de G-quadruplex y regiones de corte en diferentes tipos de cáncer [19].
Nuestra hipótesis es que un aumento de la genómica G-quadruplex en el cáncer puede surgir de mutaciones en las enzimas que procesan G-quadruplex y /o la inestabilidad genómica en los sitios de G-quadruplex. Por ejemplo, anemia de Fanconi, síndromes de Bloom de y Werner de, todos inestabilidad del genoma de visualización con una predisposición al cáncer [27] - [29] y el resultado de mutaciones en las enzimas helicasa de ADN que tienen actividad-quadruplex de resolución de G [30] - [32] . Estudios recientes en todo el genoma han puesto de relieve el reconocimiento de secuencias de G-quadruplex por helicasas adicionales, tales como la resolución de ATRX, PIF1 y XPB /D [20] - [22]. Además, PIF1 ha sugerido para suprimir la inestabilidad genómica en G-quadruplex [22], mientras que la pérdida ATRX está asociado con inestabilidad cromosómica en tumores neuroendocrinos pancreáticos [33], y las mutaciones XPD interrumpir por escisión de nucleótidos de reparación del ADN que conduce a enfermedades propensas al cáncer tales el xeroderma pigmentoso como [34].
parece que los cánceres de hígado y estómago son muy heterogéneos y no se caracterizan por una firma genética común o una mutación de conducción altamente representado que puede simplemente explicar el aumento observado en las estructuras G-quadruplex . Mientras que muchos tipos de cáncer de hígado se asocian con la hepatitis B o infección C, la información patológico obtenido con el TMA indica que no existe una correlación con la tinción BG4. Como parte del trabajo futuro, que será de utilidad para analizar las muestras tumorales no neoplásicas malignas y para los casos en que la secuenciación del genoma ha sido empleadas para elucidar los antecedentes genéticos de los pares de tumor /no neoplásicas, con el fin de establecer la relación entre el genotipo y la formación del G-quadruplex en el cáncer.
en conclusión, nos informe el uso del anticuerpo G-cuádruplex-específica, BG4, en IHC experimentos de tinción de tejidos no tumorales y cancerosas humanas. Este estudio nos ha permitido identificar una presencia significativamente mayor de las estructuras G-quadruplex de ADN en los núcleos de las células del estómago y cáncer de hígado en comparación con los tejidos no neoplásicos correspondientes. Nuestra hipótesis es que estas diferencias podrían ser dependientes de las alteraciones de los procesos celulares que regulan la estabilidad del genoma o cambios en el estado de la cromatina en los sitios de G-quadruplex en tejidos de cáncer. Nuestros resultados apoyan la posibilidad de que las células cancerosas pueden proporcionar una ventana de la selectividad que los haría más sensibles que las células no neoplásicas hacia una estrategia de focalización cuádruplex-G molécula pequeña.
Materiales y Métodos
Fijación, incrustación, seccionando y tinción de los sedimentos celulares se realizaron por el servicio central de la histopatología en el Cambridge Instituto de Investigación del cáncer del Reino Unido. La inmunohistoquímica (IHC) se llevó a cabo utilizando métodos estándar en una plataforma automatizada Leica Bond con pequeñas variaciones. Brevemente, los tejidos se fijaron durante 24 h a temperatura ambiente (RT) en 10% de formalina tamponada neutra y se procesaron usando un procesador de tejidos Leica ASP300 con de-hidratación a través de una serie de etanol, despejando en xileno y la infiltración con cera de parafina fundida. Incrustación se realizó en una estación de incrustación de Leica EG1160 y se cortaron secciones de 3 m con un micrótomo, flotaban en un baño de agua a ~45-50 ° C hasta que esté suave y plano, antes de la recolección en un portaobjetos de microscopio y secado a 60 ° C durante 1 h. De-encerado y re-hidratación se realizaron utilizando un Multistainer ST5020 automatizado Leica. células de adenocarcinoma de mama humano MDA-MB-231 se obtuvieron de las Normas LGC ATCC. Para glóbulos de células MDA-MB-231, recuperación del epítopo se realizó a 100 ° C durante 20 min con la solución de recuperación del epítopo Bond 1 (basado en tampón citrato pH 6,0) o Bond solución de recuperación del epítopo 2 (Tris /a base de EDTA pH 9,0) oa 37 ° C durante 10 minutos con el kit de la enzima Bond pre-tratamiento (100 mg /ml de proteinasa K en solución salina tamponada con Tris, tensioactivo y 0,35% ProClin 950) para encontrar las mejores condiciones. microarrays de tejidos humanos disponibles en el mercado con la aprobación ética adecuada en el país de origen se adquirieron de Bio Insight Reino Unido (por US Biomax Inc. arrays) y Biocat, Alemania o Stretton Científico, Reino Unido (por Accumax, matrices Isu Abxis). Recuperación del epítopo se realizó a 100 ° C durante 20 min con tampón citrato. tinción BG4 se realizó a temperatura ambiente en un instrumento automático Leica Bond con un kit de polímero de conejo (Leica) después de una incubación de 15 min con BG4 y una incubación de 8 minutos con un anticuerpo policlonal de conejo anti-FLAG (Cell Signaling Technology). Las diapositivas fueron counterstained durante 5 minutos con 0.02% hematoxilina para visualizar los núcleos celulares. De-hidratación y la limpieza se realizaron en un Multistainer automatizado Leica ST5020, y el montaje se realizó en un vidrio de cubreobjetos automatizado Leica CV5030. Las láminas fueron escaneados con un sistema de escaneo de diapositivas Aperio XT120 (Leica) y las imágenes analizadas usando el software v9 Aperio Imagescope nuclear. Los análisis estadísticos y los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student. gráficos de frecuencia de distribución se representaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software).
Apoyo a la Información
Figura S1. tinción
BG4 en sedimentos de células MDA-MB-231 embebidos en parafina. A. humanos MDA-MB-231 sedimentos de células de cáncer de mama se fijaron, embebido en parafina y se procesaron para IHC usando el BG4 anticuerpo G-quadruplex-específico. tinción BG4 fuerte (marrón) se puede comprobar en los núcleos de células después de la recuperación de epítopo con Tris /a base de EDTA pH 9,0. La barra de escala corresponde a 20 micras. Los núcleos se counterstained con hematoxilina (azul). B. tinción BG4 Strong (marrón) es evidente en los núcleos de células después de la recuperación de epítopo con proteinasa K. C. No tinción nuclear se observa en ausencia del anticuerpo BG4 después de la recuperación Tris /EDTA epítopo. D. No tinción nuclear es visto después del tratamiento con DNasa antes de la tinción BG4 después de la recuperación epítopo con EDTA. E. Los altos niveles de tinción no específica en ausencia de BG4 después de recuperación del epítopo con proteinasa K.
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figura S2. tejidos humanos
no neoplásicas muestran tinción variable de BG4. tejidos no tumorales fueron teñidas por IHC usando el anticuerpo BG4 G-cuádruplex-específica. A. BG4 tinción (marrón) en la corteza renal muestra un rango de intensidades de tinción nuclear en los glomérulos y estructuras asociadas. Los núcleos celulares se counterstained con hematoxilina (azul). La barra de escala corresponde a 50 micras B. débilmente tinción positiva BG4 se ve en los núcleos de recogida de los túbulos de la médula renal. C. piel muestra una gama de intensidades BG4 en la epidermis con núcleos positivos y negativos repartidos por todo, mientras que la dermis es en su mayoría positivas. D. La mayoría de los núcleos en el colon son BG4-positivo. E. En el cuerpo del útero, el epitelio escamoso estratificado es en gran parte BG4-negativas mientras que la tinción positiva se ve más superficialmente. F. A lo largo de los lóbulos ductal de mama, tanto en las células mioepiteliales y luminal muestran fuerte tinción en general BG4 con células negativas solamente ocasionales
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
presencia elevada de las estructuras G-quadruplex en tejidos de cáncer de páncreas humano. tejidos pancreáticos no neoplásicas y cáncer se tiñeron por IHC usando el BG4 anticuerpo G-quadruplex-específica, y el número de núcleos BG4-positivos se puntuó usando software Aperio Imagescope. A. Los núcleos de mostrar el tejido del páncreas tinción moderada BG4 no neoplásico (marrón) con muchos núcleos no teñidas también presentes. Los núcleos celulares se counterstained con hematoxilina (azul). La barra de escala corresponde a 50 micras. B. BG4 tinción en el tejido de adenocarcinoma de páncreas es más extensa con mayor intensidad. C. En general, la cuantificación del número de núcleos BG4-positivo en todos los tejidos de cáncer no neoplásicas y pancreáticas. Las barras de error representan la s.e.m. * P & lt; 0,01, n = 6 y 12 para núcleos no neoplásicas y cáncer, respectivamente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s003 gratis (TIF)