Extracto
El efecto Warburg y la hipoxia tumoral subyacen a un fenotipo metabólico único cáncer caracterizado por la dependencia de la glucosa y la fermentación aeróbica. Anteriormente puso de manifiesto que dos terapias metabólicas no tóxicas - la dieta cetogénica concurrente con oxígeno hiperbárico (OHB KD +) y la suplementación dietética - cetona podrían aumentar el tiempo de supervivencia en el modelo de ratón VM-M3 de cáncer metastásico. La hipótesis de que la combinación de estas terapias podrían proporcionar un mayor beneficio terapéutico en este modelo. Los ratones que recibieron la terapia de combinación demostraron una marcada reducción en la tasa de crecimiento del tumor y la diseminación metastásica, y vivieron doble de tiempo que los animales de control. Para entender mejor los efectos de estas terapias metabólicas, se caracterizaron los efectos de los altos de glucosa (control), niveles bajos de glucosa (LG), la administración de suplementos de cetona (βHB), oxígeno hiperbárico (OHB), o terapia de combinación (LG + βHB + OHB) en células VM-M3. De forma individual y combinada, estas terapias metabólicas disminuyeron significativamente la proliferación celular VM-M3 y viabilidad. TOH, solo o en combinación con LG y βHB, el aumento de la producción de ROS en células VM-M3. Este estudio apoya firmemente una mayor investigación sobre esta terapia metabólica como un tratamiento no tóxico potencial de cánceres metastásicos en etapa tardía
Visto:. Capilla de la mañana, la sala N, Seyfried TN, Arnold P, D'Agostino DP (2015 ) no tóxico Gestión metabólico del cáncer metastásico en ratones VM: Combinación Novel de la dieta cetogénica, cetona suplementación, y terapia de oxígeno hiperbárico. PLoS ONE 10 (6): e0127407. doi: 10.1371 /journal.pone.0127407
Editor Académico: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos |
Recibido: 4 de Junio, 2014; Aceptado: 14 de abril de 2015; Publicado: 10 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Poff et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. 12B152PRWO la patente; Universidad del Sur de Florida; DP D'Agostino, A. Capilla, P. Arnold, "Orientación de cáncer con terapia metabólica y oxígeno hiperbárico." P. Arnold (Savind Inc.) ha recibido apoyo financiero (ONR N000140910244) de D. D'Agostino (USF) para sintetizar ésteres cetónicos. el resto de autores no tienen ningún conflicto de intereses. los fondos para este proyecto fue apoyado en parte por una contribución de caridad de Scivation, Inc .; sin embargo, la compañía no ha influido en el diseño del estudio, la recogida de datos, análisis o interpretación de los resultados . los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. la patente 12B152PRWO; University of South Florida; DP D'Agostino, A. Capilla , P. Arnold, "Identificación de cáncer con terapia metabólica y oxígeno hiperbárico." P. Arnold (Savind Inc.) ha recibido apoyo financiero (ONR N000140910244) de D. D'Agostino (USF) para sintetizar ésteres cetónicos. El resto de autores no tienen ningún conflicto de intereses. Autor (P. Arnold) afiliaciones con Savind Inc. y el apoyo financiero de Scivation, Inc. no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
> Cánceres exhiben un fenotipo metabólico dysregulated caracterizado por fermentación de lactato en presencia de oxígeno, un fenómeno conocido como el efecto Warburg [1]. El interés en el metabolismo del cáncer ha aumentado en la última década, con investigadores que sugiere numerosas causas y consecuencias del efecto Warburg, y la investigación de nuevas estrategias terapéuticas para explotarla [1-5]. la dependencia de la glucosa y la producción de lactato, dos características clave del efecto Warburg, se correlacionan fuertemente con capacidad agresiva y potencial invasivo [3, 4, 6, 7]. Metástasis, o la diseminación de las células tumorales de un sitio primario a los tejidos distales, es responsable de más del 90 por ciento de las muertes relacionadas con el cáncer. No existen terapias contra el cáncer actualmente disponibles que pueden gestionar con eficacia la metástasis sistémica. Dado que el efecto Warburg es un fenotipo prominente en las células metastásicas, terapias metabólicas que explotan este fenómeno puede ofrecer nuevas opciones terapéuticas para los pacientes con cánceres agresivos o en etapa tardía.
El glicolítica dependencia asociada con el efecto Warburg ha llevado investigadores para investigar terapias dietéticas que disminuyen la disponibilidad de glucosa para el tumor. La dieta cetogénica (KD) es un alto contenido de grasa, proteína adecuada, la dieta muy baja en carbohidratos que se ha utilizado en estudios preclínicos y clínicos para frenar la progresión del cáncer [8-21]. El KD obliga a un cambio fisiológico de metabolismo de las grasas, Lowing glucosa en la sangre, la supresión de la insulina, y la elevación de los niveles de cetonas en la sangre mediante la estimulación de la cetogénesis de grasas de la dieta y almacenados. Aunque los efectos anti-cáncer de los KD se atribuyen en gran medida a la reducción de los sustratos glucolíticas y señalización de la insulina que metabolismo del cáncer de combustible, la evidencia emergente sugiere que las cetonas tienen un potencial terapéutico de su propio [17, 22, 23]. Mientras que las células sanas se adaptan fácilmente a las cetonas como sustrato energético eficiente, muchos tipos de cáncer no son capaces de realizar esta adaptación [24, 25]
.
La expresión de las enzimas uso de la acetona se reduce a menudo en cánceres malignos en comparación con su habitual contraparte de tejidos [26, 27]. De hecho, a diferencia de las neuronas sanas, cetonas fallan para rescatar células de glioma de la muerte inducida por la privación de glucosa [28]. Recientemente hemos descrito este fenómeno y se investigó el uso potencial de la suplementación dietética cetona en un modelo de ratón de cáncer metastásico [22]. Nuestro estudio demostró que la suplementación cetona exógena ejerce potentes efectos anticancerígenos
in vivo
, incluso cuando se administra con una dieta alta en carbohidratos, con efectos similares sobre las células cancerosas en la presencia de los medios de glucosa altos
in vitro
[22].
metabolismo energético celular está íntimamente ligada a la condición de la oxigenación de los tejidos [29, 30]. Cuando el oxígeno está fácilmente disponible, las células normales producen hasta 90 por ciento de su ATP por la respiración mitocondrial. Cuando la disponibilidad de oxígeno se ve limitada, tal como en el músculo en ejercicio, las células se convierten en el uso de la fermentación anaeróbica para preservar la producción de ATP. Este interruptor metabólico sostiene la función celular y promueve la supervivencia en la cara de la hipoxia transitoria, y su mecanismo es impulsado en gran medida por la HIF-1 factor de transcripción [30, 31]. HIF-1 aumenta la expresión de más de 60 genes, muchos involucrados en la glucólisis y la fermentación, la angiogénesis, el crecimiento y la supervivencia [30, 32]. La señalización aberrante que conduce la angiogénesis tumoral crea vasos sanguíneos inmaduros y con fugas que son incapaces de perfundir adecuadamente todo el tumor [33]. Esto conduce a la formación de regiones hipóxicas en el interior del tumor que mejoran el efecto Warburg y promover la progresión del cáncer, invasión y metástasis [33-35]. La hipoxia tumoral y HIF-1 de señalización son a la vez se correlacionan fuertemente con la capacidad agresiva y mal pronóstico [36]. hipoxia tumoral también se conoce para mediar algunos quimio- y radio-resistencia [37-40]. Debido a que estas terapias funcionan en gran parte por la estimulación de la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro del tumor, la disponibilidad limitada de oxígeno disminuye su eficacia [41, 42].
La oxigenoterapia hiperbárica (OHB) es la administración de 100% de oxígeno a presión elevada.
In vivo
, TOH satura plasma de la sangre con oxígeno, lo que permite que se difunda más en los tejidos y regiones tumorales hipóxicas oxigenados [43-45]. Del mismo modo, OHB aumenta la difusión de oxígeno en las células en cultivo y por lo tanto sus efectos se pueden evaluar fácilmente en el
in vitro
medio ambiente. TOHB se ha demostrado que inhibe la angiogénesis y el crecimiento del tumor y aumentar el tiempo de supervivencia como terapia independiente o adyuvante a la atención estándar en una variedad de células, animales y estudios en humanos [46-52]. Anteriormente puso de manifiesto que la dieta cetogénica con la terapia de oxígeno hiperbárico concurrente fue una terapia de combinación eficaz contra el cáncer metastásico [9].
La dieta cetogénica, la administración de suplementos de cetona, y el objetivo TOH superposición de las vías metabólicas que son especialmente prominentes en las células metastásicas . La hipótesis de que la combinación de estas tres terapias metabólicas podría proporcionar un tratamiento adyuvante rentable segura para el cáncer metastásico. Pusimos a prueba esta hipótesis
in vivo
y en
in vitro
utilizando el modelo de ratón VM-M3 de cáncer metastásico [9, 22, 53].
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
células VM-M3 /Fluc (VM-M3) se adquirieron como un regalo de T. Seyfried de la universidad de Boston, donde se obtuvieron de un tumor cerebral espontánea en una máquina virtual /Dk endogámica ratón, adaptado para el cultivo de células, y transducidas con un vector de lentivirus que contiene luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor de citomegalovirus como se describe anteriormente [53]. células VM-M3 se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco, Life Technologies) con 5 mM de L-glutamina (ATCC), 10% de suero bovino fetal (Invitrogen), 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), tampón HEPES 10 mM (Gibco, Life Technologies), y alto contenido de glucosa (25 mM de D-glucosa; Fisher Scientific). Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C en el 95% de aire y 5% de CO
2.
Ratones fueron recibidos
Las parejas reproductoras de la cepa endogámica VM /Dk de los ratones como un regalo de T. Seyfried de la Universidad de Boston, y se utilizaron para establecer y propagar una colonia de ratones en la Universidad del Sur de Florida Morsani Colegio de Medicina Vivarium cría de acuerdo con el protocolo estándar. Los ratones macho (8-20 semanas de edad) fueron utilizados en el estudio descrito. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Florida del Sur Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC USF; Número de protocolo R4137) y llevan a cabo bajo la estricta adhesión a la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
VM-. M3 Cell Implantación
Aproximadamente 1 millón de células VM-M3 en 300 l de PBS estéril se implantaron subcutáneamente en el flanco lateral abdominal de ratones VM /Dk utilizando una aguja 27G como [9] se describe anteriormente. la inoculación de células VM-M3 de este sitio resultados en la metástasis rápida y sistémica [9].
Administración dietética
Los animales fueron asignados al azar a un grupo de estudio y comenzó a recibir sus respectivas dietas en el día de la inoculación del tumor a fin de maximizar la ventana terapéutica en el modelo altamente agresivo VM-M3. Antes de la primera día del estudio, todos los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche para fomentar un rápido cumplimiento con el protocolo de la dieta. Los animales de control recibieron comida estándar para roedores (2018 Teklad Global 18% de proteínas Dieta de roedores, Harlan)
ad libitum
durante la duración del estudio. los ratones recibieron TOHB KD + KD-USF, una dieta cetogénica personalizado diseñado por los autores y producido por Harlan Laboratories, alimentado
ad libitum
. ratones TOHB KD + KE y KD + KE + recibieron KD-USF mezclado con KE a 10% en volumen con 1% de la sacarina en palatabilidad. KE se sintetizó en colaboración con Patrick Arnold (Savind Inc., Seymour, IL) tal como se describe anteriormente [54]. El perfil de macronutrientes y densidad calórica de SD, KD-USF y el KE se muestran en la Tabla 1. Todas las dietas fueron monitorizados continuamente y reemplazados dos veces por semana o según sea necesario para mantener la frescura durante la duración del estudio.
Terapia de oxígeno hiperbárico
ratones TOHB KD + KE + recibieron 90 sesiones de hora de oxígeno hiperbárico de 100% de O
2 a 2,5 ATA (calibre 1,5 ATM) tres veces por semana (M, W, F) en una cámara hiperbárica estándar (modelo 1300B, Sechrist Industries) durante la duración del estudio. KD + KE + OHB recibió su primera sesión de OHB 24 horas después de la inoculación de las células tumorales.
Medidas arterial y el peso
La sangre (aproximadamente 10 l) se recogió una vez por semana a partir de la cola usando CICUAL aprobados por la métodos. La glucosa en sangre y β-hidroxibutirato (βHB) se midió usando el Precision Xtra de glucosa en sangre & amp; Sistema de Control de cetona (Abbott Laboratories). Los ratones se pesaron en la mitad de la tarde, dos veces por semana durante la duración del estudio utilizando la AWS-1kg escala portable Digital (AWS).
bioluminiscente de imágenes y el crecimiento tumoral Análisis
La bioluminiscencia de la células VM-M3 luciferasa-etiquetados
in vivo
fue adquirida mediante el IVIS Lumina enfrió sistema de cámara CCD y el software Image Living (Caliper LS). Quince minutos antes de la imagen, los ratones recibieron una inyección i.p. inyección de 50 mg /kg de D-luciferina (Caliper LS). señal bioluminiscente animales Total (fotones /sec) se midió una vez por semana como un indicador del tamaño del tumor metastásico y propagación. Tumor tomar y diseminación metastásica se confirmó en todos los animales dentro de los 14 días siguientes a VM-M3 de la inoculación de células por bioluminiscente de imágenes.
In vivo
señal bioluminiscente (fotones /s) de las regiones cerebrales metastásicos (clave, los pulmones y el hígado) se midió como un indicador de la carga tumoral metastásico y diseminarse a los 21 días después de la inoculación en los animales de estudio de supervivencia [43 , 55]. Extensión de la diseminación metastásica se analizó adicionalmente en un grupo separado de control y tratados con terapia de combinación con los animales
ex vivo
órgano bioluminiscente de imágenes. Los animales fueron inoculados con células VM-M3, tratados durante 21 días, y humanamente sacrificados. Los tejidos fueron cosechadas y se colocan en una placa de Petri que contiene 300 ug /ml de luciferina en PBS estéril durante 5 minutos antes de la adquisición de la señal bioluminiscente.
Análisis de supervivencia
La salud física y conductual de los ratones eran evaluado a diario durante todo el estudio. Los ratones fueron sacrificados humanitariamente por CO
2 asfixia según las directrices del IACUC aprobados previa presentación de criterios definidos asociados con la progresión de la enfermedad (comportamiento de alimentación anormal, ascitis asociado a un tumor, disminución de la respuesta a los estímulos, retraso del crecimiento).
Análisis inmunohistoquímico de un tumor Vascularización
Después de 21 días de tratamiento, los animales en el referido estudio de tratamiento de 3 semanas fueron sacrificados humanitariamente y los hígados se recogieron y se conservan en un 10%, formalina neutra tamponada con fosfato. El tejido hepático fue-incluidas en parafina, cortado en secciones de 5 micrómetros, y montado sobre portaobjetos de microscopio en la USF Morsani Colegio de Medicina Histología Core. Una serie de diapositivas se tiñeron con hematoxilina y eosina y se monta con cubreobjetos para el análisis morfológico. Otro conjunto de diapositivas se sondeó para el marcador CD31 endotelial celular para visualizar los vasos sanguíneos. Los portaobjetos se rehidrata a través de una serie de xileno y etanol lavados, y el antígeno fue recuperado por un método tampón de citrato mediada por calor estándar. Las láminas fueron incubadas en el 0,3% de H
2O
2 en DH
2O para inhibir la actividad de peróxido endógeno. El análisis inmunohistoquímico de las diapositivas se realizó utilizando el kit Elite Vectastain ABC. Los portaobjetos se bloquearon durante 30 minutos en suero de bloqueo normal y después se incubaron en anticuerpo anti-CD31 (1:25; ab28364, Abcam) durante una hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron entonces en el anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado en el suero de bloqueo normal, durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de reactivo VECTASTAIN ABC que contiene avidina y solución de peroxidasa de rábano picante biotinilado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se desarrolló usando el kit de sustrato VECTOR Novared peroxidasa (HRP). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina, se lavaron, montado con cubreobjetos, y se visualizó con microscopía de luz. Se analizaron al menos 3 cuadros que contienen tejido tumoral por muestra. El número de CD31
+ vasos sanguíneos asociados con tumores en cada cuadro se contó y se comparó entre el control y los grupos tratados como una medida de la vascularización tumoral.
Proliferación Celular VM-M3
50.000 células VM-M3 se chapada en 35 mm placas de 6 pocillos en 1 ml de medio de alto contenido en glucosa (control; 25 mM) o medio nivel bajo de glucosa (LG; 3 mM) con o sin diaria HBO tratamientos (OHB; 100% de o
2 , 90 min, 2,5 ATA). Un grupo recibió el tratamiento combinado bajo de glucosa, la administración de suplementos de cetona (5 mM βHB), y los tratamientos diarios de HBO (LG + + βHB OHB). Estos estudios se realizaron en conjunto con el trabajo de investigar el efecto de la suplementación de cetona en la proliferación celular VM-M3; Por lo tanto, las curvas de proliferación de glucosa 25 mM y 3 mM presentados son los mismos que se informó anteriormente [22]. Las células se hicieron crecer durante 24, 48, 72, y 96 horas para determinar una curva de crecimiento. Se reemplazó el medio en todos los tratamientos a las 48 horas, y cada grupo de puntos de tiempo y el tratamiento se realizó por triplicado. Las células se rasparon y se contaron usando hemocitometría azul de tripano estándar. Las placas se inspeccionaron visualmente para asegurar que todas las células fueron cosechadas antes del recuento.
VM-M3 viabilidad celular
La viabilidad se evaluó con el LIVE /DEAD viabilidad /citotoxicidad kit (Invitrogen). 50.000 células VM-M3 se sembraron en 22 mm 12 placas de pocillos que contenían cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina (BrainBits) en los medios de control de 1 ml y se dejaron crecer durante 24 hrs. A las 24 horas, las células se les administró tratamiento: medios altos de glucosa (control; 25 mM), medios de baja glucosa (LG; 3 mM), los medios de control (25 mM glucosa) con una sola sesión de oxígeno hiperbárico (OHB; 100% de O
2 , 90 min, 2,5 ATA), o la terapia de combinación de bajos niveles de glucosa, los suplementos de cetona (5 mM βHB), y una sola sesión de oxígeno hiperbárico (LG + + βHB OHB). Estos estudios se realizaron en conjunto con el trabajo de investigar el efecto de la suplementación de cetona en la viabilidad celular VM-M3; Por lo tanto, los datos de viabilidad 25 mM y βHB son los mismos como se informó anteriormente y se muestran aquí para referencia [22]. A las 48 horas, las células se lavaron con D-PBS y se incubaron en 2 micras calceína AM (Ex /Em: 495/515) y 4 micras EthD-1 (Ex /Em: 525/590) en D-PBS durante 30 min a 37 ° DO. Los cubreobjetos se invirtieron, montados, y se sellan en un portaobjetos de microscopio, y las células se visualizaron con un Nikon TE200E usando microscopía de fluorescencia confocal con filtros TRIT-C FIT-C y para identificar las células vivas y muertas, respectivamente. Los tratamientos se realizaron por triplicado. El número de células vivas y muertas se contaron en 10 fotogramas por cubreobjetos usando un objetivo 10x para determinar el porcentaje de viabilidad.
VM-M3 celular ROS Detección
50.000 células VM-M3 se sembraron en 35 FluoroDish de vidrio recubiertas con placas de cultivo de tejidos mm poli-D-lisina (World Precision Instruments) en 1 ml de medios de control y se dejaron crecer durante 24 horas. A las 24 horas, las células se les administró tratamiento: Se reemplazó el medio con medio de alto contenido en glucosa (control; 25 mM), medios de baja glucosa (LG; 3 mM), los medios de control con los suplementos de cetona (βHB; 5 mM βHB), los medios de control con una sola sesión de oxígeno hiperbárico (OHB; 100% de O2, 90 min, 2,5 ATA), o terapia de combinación (LG + + βHB OHB). A las 48 horas, las células se incubaron en 10μM DHE (Ex /Em: en CSF durante 30 minutos a 37 ° C, y la producción de superóxido se midió mediante microscopía confocal de fluorescencia con un filtro de TRIT-C como se ha descrito anteriormente se realizaron [56] Tratamientos. en la replicación. la producción de superóxido se midió mediante el cálculo de la media de las unidades de intensidad de fluorescencia (UIF) por célula en 10 fotogramas por muestra usando un objetivo 10x.
Estadísticas
la supervivencia se analizó con el método de Kaplan -Meier y log-rank pruebas de Mantel-Cox para la distribución de supervivencia. La viabilidad celular y la vascularización del tumor se analizaron mediante la prueba t no pareada. señal bioluminiscente se analizó por Mann-Whitney U test. La viabilidad celular, la proliferación celular, la supervivencia media, glucosa en sangre y βHB y el porcentaje de cambio de peso corporal fueron analizados por ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc Todo el análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 6 Los resultados se consideraron significativos cuando p & lt;... .05 Los datos para este estudio está disponible como información suplementaria (S3 archivo).
resultados
terapia metabólica disminuye el crecimiento del tumor, inhibe la diseminación metastásica y la vascularización del tumor, y se extiende el tiempo de supervivencia en ratones con cáncer metastásico
bioluminiscente de imágenes mostró una tendencia de la tasa de crecimiento del tumor y la diseminación metastásica reducida en los animales tratados en comparación con los controles durante el transcurso del estudio (figuras 1 y 2). bioluminiscencia tumoral fue por debajo del umbral detectable en varios ratones TOHB KD + KE + a las 3 semanas (Fig 1). Tumor tomar y se observó propagación desde el sitio de la inoculación con bioluminiscente de imágenes en todos los ratones en el día 14, lo que indica que estas terapias metabólicas no prolongó la supervivencia simplemente mediante la prevención de la formación de tumores. Sin embargo, la bioluminiscencia tumor se redujo en los ratones de tratamiento de triple comparación con el control en las semanas 1 y 2, lo que sugiere que el entorno fisiológico inducido por nuestro terapia metabólica era menos propicio para el crecimiento del tumor y se puede haber reducido el crecimiento del tumor primario, así como metastásico untado. TOHB tratada ratones KD + KE + exhibieron una menor carga tumoral global, medido con señal bioluminiscente total que los controles de los puntos de tiempo en absoluto aplicables (semanas 1, 2, y 3; la figura 1). tratado TOHB ratones KD + KE + también mostraron una menor carga tumoral global que los ratones KD en las semanas 3 y 5 y de los ratones KD + KE en las semanas 1, 2, 3, y 5 (Fig 1). A las 3 semanas después de la inoculación de células VM-M3, tratado TOHB ratones KD + KE + tenían una carga tumoral global significativamente más pequeño y menos propagación metastásica en el cerebro, los pulmones, el hígado, los riñones, el bazo, y el tejido adiposo en comparación con los ratones control (** * p & lt; 0,001, ANOVA de una vía; Fig 1). KD, KD + KE, y KD + KE + ratones TOHB demostraron curvas de supervivencia significativamente prolongada en comparación con los animales control (p = 0,03, p = 0,009 y p & lt; 0,0001, prueba de Cox de Mantel-log rank para la distribución de supervivencia; la figura 3A) . tratamiento KD aumentado el tiempo de supervivencia media de aproximadamente 14 días (44,6%), tratamiento KD + KE por aproximadamente 20 días (65,4%), y el tratamiento de oxigenoterapia hiperbárica KD + KE + por aproximadamente 32 días (103,2%) en comparación con los controles (* P & lt; 0,05; ANOVA de una vía; figura 3B). No hubo diferencias significativas en la supervivencia entre los tres grupos de tratamiento. El análisis morfológico e inmunohistoquímico de hígados de ratones tratados con TOH KD + KE + reveló sólo lesiones micrometastásicas con poca vascularización notable en comparación con los controles (figura 4). La glucosa en sangre y el peso corporal disminuyó y la sangre βHB aumentaron en los ratones que recibieron la terapia de KD + KE por día 7, antes de la aparición de la progresión de la enfermedad significativa (Fig 5).
(A)
In vivo
imágenes de bioluminiscencia de animales representativos de cada grupo de tratamiento 3 semanas después de la inoculación de células tumorales. Los ratones tratados exhibió reducción de la carga tumoral y la diseminación metastásica. (B) bioluminiscencia animal entero (fotones /seg) se siguió en el tiempo como una medida de la tasa de crecimiento del tumor. Con el fin de evitar la representación errónea de la carga tumoral, los datos de los grupos de tratamiento en ≥50% de los animales había sucumbido a la progresión de la enfermedad ya no se muestra. bioluminiscencia Tumor fue muy variable, pero los animales tratados demostró una tendencia notable del crecimiento tumoral más lento en comparación con los controles durante todo el estudio. KD ratones tratados tenían menos de bioluminiscencia que los controles en la semana 2, mientras que los ratones TOHB KD + KE + tenían menos de bioluminiscencia que los animales de control en las semanas 1, 2, y 3. ratones TOHB KD + KE + también tenía menos de bioluminiscencia que los ratones KD + KE en semanas 1, 2, 3 y 5, y tenían menos bioluminiscencia tumor que los ratones KD en las semanas 3 y 5. Las barras de error representan ± SEM. Los resultados se consideraron significativos cuando p. & Lt; 0,05
(A)
En vivo
bioluminiscencia de las regiones clave metastásicos 21 días después de la inoculación de las células tumorales demostró una marcada reducción de la carga tumoral metastásico y propagación para los animales tratados. ratones TOHB KD + KE + se había extendido significativamente menos metastásico al cerebro, los pulmones y el hígado en comparación con los controles en las 3 semanas. No hubo diferencias significativas en la diseminación metastásica entre los tres grupos de tratamiento. (B-C) para proporcionar una medida más sensible de la diseminación metastásica en nuestra terapia de combinación múltiple, un grupo separado de control y tratados TOHB animales KD + KE + fueron tratados durante 21 días después de la inoculación de células tumorales y la eutanasia. de formación de imágenes
Ex vivo
bioluminiscente de órganos extraídos confirmó una disminución significativa en la carga tumoral metastásico y se extendió en los animales tratados con la combinación en comparación con los controles. Todos los órganos probado-cerebro, los riñones, el bazo, los pulmones, el tejido adiposo, y la señal bioluminiscente reducido significativamente el hígado exhibido en comparación con los controles. Las barras de error representan ± SEM. Los resultados se consideraron significativos cuando p. & Lt; 0,05
(A) de Kaplan-Meier curva de supervivencia de los grupos de estudio. KD, KD + KE, y KD + KE + ratones tratados TOHB presentaron una supervivencia más prolongada en comparación con los controles (p = 0,03, p = 0,009 y p & lt; 0,0001, respectivamente; log-rank test de Mantel-Cox para la distribución de supervivencia). Hubo una fuerte tendencia de supervivencia más prolongado en los ratones de tratamiento de combinación en comparación con KD o KD + KE, pero estas curvas no fueron significativamente diferentes entre sí (KD vs. KD + KE + TOHB p = 0,0622; KD + KE vs. KD + KE + OHB p = 0,1924; log-rank test de Mantel-Cox). (B) el tamaño de la cohorte (N), la supervivencia media (días), y el porcentaje de aumento en el tiempo de supervivencia medio de control. KD, KD + KE, y KD + KE + ratones tratados TOHB exhibieron un 44,6%, 65,4%, y el aumento de 103,2% en el tiempo medio de supervivencia en comparación con los controles, respectivamente (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001; ANOVA de un factor). Similar al análisis de la curva de supervivencia, hubo una tendencia de aumento del tiempo medio de supervivencia en ratones tratados con la combinación en comparación con KD y KD + KE, pero estas diferencias no fueron significativas (KD vs. KD + KE + TOHB p = 0,1062; KD + KE vs. KD + KE + OHB p = 0,2763). Los resultados se consideraron significativos cuando p. & Lt; 0,05
Morfología y vascularización de los tumores de hígado de ratones tratados con TOHB KD + KE + fueron analizados por H & amp; E tinción inmunohistoquímica y CD31. Los tumores de los ratones TOHB tratados KD + KE + eran más pequeños con bordes más bien definidas (A, C) y mostraron una reducción significativa en la vascularización (B, D, E) de los controles (* p & lt; 0,05; desapareado t-test) . Las barras de error representan ± SEM.
(AC) KD + KE ratones tratados habían disminuido significativamente la glucosa en sangre y el peso corporal y el aumento de βHB sangre en comparación con los ratones de control por día 7. La glucosa en sangre se redujo significativamente sólo en KD + KE ratones tratados por día 7. Tanto TOHB ratones tratados KD + KE y KD + KE + exhiben una mayor βHB sangre en comparación con el control y KD ratones por día tratada 7. Sólo los ratones KD + KE tenía una reducción significativa en el peso corporal por día 7. (D) Sólo los ratones KD + KE demostraron una disminución significativa y constante en el peso corporal durante el curso del estudio. Los resultados se consideraron significativos cuando p & lt; 0,05. Las barras de error representan ± SEM.
terapia metabólica disminuye la proliferación y la viabilidad y aumentar la producción de ROS en células VM-M3
proliferación de las células VM-M3 fue significativamente inhibida por la disminución de la concentración de glucosa de los medios de cultivo y mediante la administración de TOHB (figura 6A). Hemos informado anteriormente de una respuesta similar en las células VM-M3 con βHB la suplementación de la concentración de glucosa variada [22]. La combinación de LG, βHB, y TOH provocó efectos antiproliferativos potentes
in vitro gratis (figura 6B). Las células que reciben esta terapia de combinación divididas muy lentamente, con una disminución significativa marcada de la densidad celular en comparación con los controles en todos los puntos de tiempo ensayados (* p & lt; 0,05, ANOVA de una vía; Fig 6B). A las 24 y 48 horas, la tasa de crecimiento fue significativamente más lenta en las células LG + TOHB que en las células de control. La tasa de crecimiento fue también significativamente más lenta en las células LG + βHB + TOHB que en las células LG. Las diferencias en la tasa de proliferación entre los grupos se hizo más clara con el tiempo, de tal manera que por 72 horas, la tasa de proliferación de todos los grupos de tratamiento difirió significativamente entre sí con la excepción de LG frente LG + TOHB, y a las 96 horas, todos los grupos diferían con la excepción de LG frente LG + TOHB. Hubo un efecto similar de terapia metabólica sobre la viabilidad celular VM-M3. La viabilidad fue del 19% menor en el grupo LG que en el grupo control en el tratamiento horas 24 (* p & lt; 0,05, ANOVA de una vía; Fig 7). Hemos informado anteriormente de un efecto similar en las células VM-M3 tratados con βHB suplementación [22]. Aunque TOHB no disminuyó la viabilidad por sí mismo, cuando se administra con LG y βHB, esta terapia de combinación redujo significativamente la viabilidad en aproximadamente un 38%. (*** P & lt; 0,001, ANOVA de una vía; Fig 7). VM-M3 producción de superóxido de células se incrementó significativamente con OHB, tanto sola como en combinación con LG + βHB (*** p & lt; 0,001, ANOVA de una vía; la figura 8).
células VM-M3 fueron cultivadas en condiciones que imitan la terapia metabólica, incluyendo combinaciones de concentración de glucosa variada (25, 15, o 3 mm) de los medios de comunicación, los suplementos de cetona (5 mM βHB), y sesiones diarias de OTHB (100% de o
2, 2,5 ATA, 90 min). La densidad celular se midió con hemocitometría azul de tripano para producir una curva de crecimiento durante 96 horas. (A) La proliferación de células VM-M3 se inhibió con la disminución de la concentración de glucosa y la adición de TOHB. A las 24 horas, la densidad celular de las células TOHB 3 mM glu glu y 3 mM + fue significativamente inferior al control de las células tratadas (25 mM) de glucosa. A las 48, 72, y 96 horas, la densidad celular de todos los grupos de tratamiento se redujo significativamente en comparación con el control (* p & lt; 0,05; ANOVA de dos vías). (B) La combinación de bajos niveles de glucosa, los suplementos de cetona, y TOH dieron como resultado una marcada disminución en la proliferación celular que fue significativa desde el control en todos los puntos de tiempo ensayados. (P & lt; 0,05; ANOVA de una vía). Las células que reciben la terapia de combinación tuvieron una disminución significativa en la proliferación en comparación con las células tratadas con LG solamente a los 24, 48, y 72 horas, y en comparación con βHB sólo a 48, 72, y 96 horas, y exhibieron una tendencia no significativa de disminución de la proliferación en comparación con las células tratadas LG + OTHB para la duración de la curva de crecimiento. Los resultados se consideraron significativos cuando p & lt; 0,05. Las barras de error representan ± SEM
células VM-M3 fueron tratados con alta (control; 25 mM). o baja; glucosa (LG 3 mM) durante 24 horas, con o sin 5 mM βHB o una sesión de OHB . La viabilidad se midió con calceína AM y EthD-1 microscopía de fluorescencia. (A-B) βHB, LG, y el tratamiento βHB + + OHB LG disminución de la viabilidad en comparación con el control y células tratadas con TOHB. LG viabilidad celular + + βHB OHB se redujo significativamente en comparación con βHB pero no las células tratadas LG. Los resultados se consideraron significativos cuando p & lt; 0,05. Las barras de error representan ± SEM
(A-B) células VM-M3 fueron tratados durante 24 horas con terapias metabólicas individuales o combinados:. LG, βHB, TOH, o LG + + βHB OHB. La producción de superóxido se midió con microscopía de fluorescencia DHE y se incrementó significativamente con TOH solo o en combinación con LG + βHB. Los resultados se consideraron significativos cuando p & lt; 0,05. Las barras de error representan ± SEM.
Discusión
La metástasis sigue siendo el mayor obstáculo en la identificación de tratamientos eficaces para la gestión a largo plazo de cáncer. A falta de modelos animales que reflejan el fenotipo metastásico impide mejoras importantes en el cuidado del paciente.