Extracto
Ptp4a3 gratis (comúnmente conocido como PRL-3) es un miembro de enigmática de la
Ptp4a
familia de proteína tirosina fosfatasas prenilados que son altamente expresado en muchas cánceres humanos. A pesar de una fuerte correlación con la metástasis tumoral y mal pronóstico del paciente, existe una comprensión muy limitada del papel de esta familia de genes en tumores malignos. Por lo tanto, hemos creado un modelo murino knockout de genes blanco de
Ptp4a3
, el
Ptp4a
miembro de la familia más ampliamente estudiado. Los ratones deficientes para
Ptp4a3
eran sumamente normal. Se observaron menos machos homocigotos nulo en el destete, sin embargo, y mantuvieron una disminución de la masa corporal. Aunque
Ptp4a3
que normalmente se asocia con cáncer avanzado y metástasis, se observó el aumento
Ptp4a3
expresión en el colon de los ratones de tipo salvaje inmediatamente después del tratamiento con el carcinógeno azoximetano. Para investigar el papel de
Hoteles en Ptp4a3 malignidad, se utilizó el modelo de cáncer de colon asociado con la colitis murina más estudiada. los ratones de tipo salvaje tratados con sulfato de dextrano sódico azoximetano y desarrollaron aproximadamente 7-10 tumores por ratón en el colon distal. El tejido tumoral resultante tenía 4 veces más
Ptp4a3
ARNm en relación con el epitelio normal del colon y el aumento de la proteína PTP4A3.
Ptp4a3-
ratones nulos desarrolló el 50% menos de tumores de colon que los ratones de tipo salvaje después de la exposición a azoximetano y dextrano sulfato de sodio. Los tumores de la
Ptp4a3
-null ratones tenían niveles elevados de ambos IGF1Rβ y c-myc en comparación con los tumores repletas de
Ptp4a3, España lo que sugiere un aumento de la señalización vía de compromiso en ausencia de la fosfatasa celular. Estos resultados proporcionan la primera evidencia definitiva que implican a
Ptp4a3
en la tumorigénesis de colon y poner de relieve el valor potencial de la fosfatasa como diana terapéutica para la enfermedad maligna etapa temprana
Visto:. Zimmerman MW, Homanics GE, Lazo JS (2013) Supresión de la fosfatasa asociados a metástasis
Targeted Ptp4a3 gratis (PRL-3) Suprime el cáncer de colon murino. PLoS ONE 8 (3): e58300. doi: 10.1371 /journal.pone.0058300
Editor: Manlio Vinciguerra, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: 22 Noviembre 2012; Aceptado: February 1, 2013; Publicado: 28 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Zimmerman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este era financiado por los Institutos nacionales de Salud de subvención AA10422 y F31AA019597A comunión. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la proteína tirosina fosfatasa-4A3 (
Ptp4a3
), junto con
Ptp4a1
y
Ptp4a2
, comprenden la 4a-familia de proteínas tirosina fosfatasas. Esta familia de genes modesta se refiere comúnmente como las fosfatasas de la regeneración del hígado (PRL), debido al descubrimiento de
Ptp4a1
en las células del hígado en regeneración de ratones después de la hepatectomía parcial [1]. La homología significativa (& gt; 75% de identidad de aminoácidos) encontraron entre
Ptp4a
miembros de la familia puede denotar enzimología similar, pero todos los tres miembros de la familia se conservan a lo largo de las especies de mamíferos, lo que sugiere papeles biológicos no redundantes para cada uno. El
in vivo
propiedades y funciones de estas fosfatasas enigmáticas permanecen notablemente poco conocidos.
El interés por
Ptp4a3
se puede atribuir a su importante potencial como biomarcador y como agente terapéutico objetivo para los cánceres malignos. Muchos cánceres humanos expresan niveles altos PTP4A3 incluyendo tumores de colon [2], de mama [3], ovario [4], el hígado [5], el estómago [6], y el estroma [7], y la expresión PTP4A3 elevada a menudo se correlaciona con el aumento de invasividad tumoral y mal pronóstico [8]. Además, la sobreexpresión ectópica PTP4A3 mejora la migración de células tumorales y la invasión
in vitro
[9]. Mientras que la evidencia definitiva es deficiente,
Ptp4a3
se ha propuesto para modular múltiples vías de señalización que implican SRC [10], Rho GTPasas [9], y PI3K-Akt [11] en varias formas de cáncer. La complejidad de las alteraciones de la vía visto cuando
Ptp4a3
se sobreexpresa también puede reflejar su capacidad de actuar como un fosfatidilinositol 5-fosfatasa [12]. No hay informes han demostrado de manera concluyente un papel para
Ptp4a3
en la fisiología de las células o tejidos normales.
azoximetano (OMA) es una procarcinogen que cuando se metaboliza en el colon es mutagénico y recurre a la tumorigénesis. AOM en combinación con el sulfato de dextrano de sodio agente inflamatorio (DSS) produce un modelo murino ampliamente utilizado que se replica fielmente tumores malignos de colon impulsadas por las condiciones inflamatorias crónicas tales como colitis ulcerosa [13]. Varias vías de señalización están implicadas en la patogénesis del cáncer de colon inducida por AOM incluyendo KRAS [14], β-catenina [15], c-MYC [16], similar a la insulina del factor de crecimiento-1 del receptor β (IGF1Rβ) [17], y factor de crecimiento transformante β (TGF) [18]. Curiosamente,
Ptp4a3
ha sido identificado como un objetivo de regulación directa de TGF señalización en cáncer de colon [19].
En el presente estudio, se utilizó un enfoque de reconocimiento de genes para generar ratones que carecen
Ptp4a3
e interrogar el papel potencial de
Ptp4a3
en el colon tumorigénesis. la exposición OMA se incrementó agudamente
Ptp4a3
expresión en el colon.
Ptp4a3
-null ratones eran resistentes a la tumorigénesis de colon implican a este gen en la patogénesis de la enfermedad maligna. Por otra parte, los tumores derivados de ratones
Ptp4a3
-null overexpresssed la participación del cáncer asociado IGF1Rβ y c-MYC sugiriendo de estas vías de señalización oncogénicas.
> Creación de Ptp4a3 ratones mutantes
interrumpió el
Ptp4a3
locus genómico usando el sistema Cre-lox de recombinación específica de sitio sobre la base de la posición de dos sitios loxP insertados (Fig. 1A y con más detalle en la Fig. S1) . Los ratones mutantes se retrocruzaron a la cepa C57BL /6J durante al menos cinco generaciones. El alelo knockout fue creado por el cruce de
Ptp4a3-
floxed ratones con ratones transgénicos que expresan la recombinasa CRE-conducido de un promotor general (EIIA) para recombinar el sitio de destino y crear ratones knockout globales [20]. La inserción de sitio loxP la 3 'destruyó un sitio HindIII endógeno aumentar el tamaño del fragmento de ADN genómico producido por digestión de restricción de 5,6 a 10,2 kb. eliminación subsiguiente de la secuencia diana reduce el tamaño de los fragmentos de restricción de 10,2 a 6,4 kb. Se observan distintos tamaños de las bandas correspondientes a cada alelo cuando se analizó mediante hibridación de transferencia Southern con una sonda de ~ 300 pb correspondiente al exón 6 (fig. 1B).
A) El
Ptp4a3
floxed alelo era creado por la inserción de sitios loxP (puntas de flecha roja) alrededor de exón 2. Esta mutación dio lugar a la interrupción de una secuencia HindIII que aumenta el tamaño del fragmento de ADN producido por digestión de restricción de 5,6 a 10,2 kb. Después de la expresión de Cre recombinasa, la secuencia entre los sitios loxP se elimina dejando un solo sitio loxP y la disminución del tamaño del fragmento de restricción de 6,4 kb. Esta mutación da lugar a la supresión del codón de iniciación que causa una mutación de desplazamiento de marco que produce un producto de proteína no funcional. B) Análisis de transferencia Southern de ADN genómico se utiliza para monitorizar estos cambios genéticos y ratones de genotipo de tipo salvaje que contienen el, floxed, o alelos de final. Cada carril es de un ratón individual. C) Análisis cuantitativo de RT-PCR sobre ARNm total a partir de tejido cardíaco fetal no reveló cambios en
Ptp4a1
y
Ptp4a2
niveles de ARNm, mientras que
Ptp4a3
se redujo y no detectables en heterocigotos y el tejido homocigotos nulo, respectivamente. (* = P & lt; 0,05; n = 4 /genotipo). D) El producto proteico PTP4A3 se detectó por Western blot de lisados de proteínas de tipo salvaje y el tejido cardíaco fetal heterocigóticos, pero no en homocigotos
Ptp4a3-
muestras nulas.
Un análisis de & gt; 500 crías que fueron producidos por parejas de apareamiento heterocigóticos indicado se observaron todos los genotipos posibles en la descendencia resultante. Mientras que se observaron las hembras en las proporciones mendelianas esperados, se observó una disminución significativa (p & lt; 0,05) en el número de
Ptp4a3
-null machos al destete con relación a la frecuencia predicha (Tabla 1). Teniendo en cuenta este resultado, es posible que el golpe de gracia a los hombres, ya sea que poseen una desventaja de supervivencia o que
Ptp4a3
-null células germinales tenían un fenotipo antes de la concepción.
Ptp4a3
-null ratones macho exhibió una disminución aproximada del 10% de la masa corporal (p & lt; 0,003) y 7% de disminución en el índice de masa corporal (p & lt; 0,004) en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje a las 6 semanas de edad (Fig. S2). Este fenotipo también parecía estar confinado a ratones macho como hembra
Ptp4a3
-null ratones no mostraron una disminución significativa en la masa corporal o índice de masa corporal.
Dado que el tejido del corazón del feto tenía ha sugerido anteriormente que tienen altos niveles de
Ptp4a3
expresión [21], a continuación realizó RT-PCR cuantitativa en muestras de ARN total de tejido cardíaco fetal (E19.5) para determinar los niveles de mRNA relativa de
Ptp4a1
,
Ptp4a2, España y
Ptp4a3.
Mientras
Ptp4a1
y
Ptp4a2
niveles se mantuvo similar entre los genotipos,
Ptp4a3
ARNm se redujo en el tejido heterocigotos y no detectables en las muestras de
Ptp4a3
-null tejido cardíaco fetal (Fig. 1C). Por lo tanto, la compensación por
Ptp4a3
pérdida por la regulación positiva de cualquiera de los familiares
Ptp4a1
o
Ptp4a2
en el ARNm se excluyó. Proteína lisados de tejido del corazón fetal se analizaron por Western blot para la presencia del producto de proteína PTP4A3. Aunque son detectables en las muestras de los embriones de tipo salvaje, PTP4A3 fue menor en lisados de embriones heterocigotos y homocigotos nulo tejido no contenía PTP4A3 detectable (Fig. 1D). Aparte de las observaciones fenotípicas antes mencionadas, los ratones sin funcional
Ptp4a3
aparecieron relativa normalidad evidente a los compañeros de camada de tipo salvaje.
Expresión y octavos de final de Ptp4a3 en tejidos de ratón
Debido a que la expresión de endógeno PTP4A3 proteínas en los tejidos normales no ha sido bien caracterizado, se examinaron muestras de proteínas de tejido de tipo salvaje y ratones
Ptp4a3
-null. En primer lugar, que ensayaron varios tipos de tejido para PTP4A3 expresión de la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western (Fig. S3). corazón fetal, intestino fetal, corazón adulto, músculo esquelético, páncreas, pulmón, bazo, cerebro, timo, colon, intestino delgado y todos expresaron niveles detectables de PTP4A3 en contraste con el hígado y el riñón, que no tenía proteína PTP4A3 detectable. Estos resultados también confirman la eficacia del enfoque global de supresión de genes, como ninguna proteína PTP4A3 era detectable en ninguno de los lisados de ratones
Ptp4a3
-null. El análisis histológico se realizó también en la de tipo salvaje y
Ptp4a3
-null muestras de tejido (Fig. S4). Tras el examen de múltiples tipos de tejidos, no se observaron anormalidades abiertas y todas las muestras parecían cualitativamente normal.
Ptp4a3 expresión aumenta inmediatamente después de la exposición AOM
Dado que los niveles bajos de PTP4A3 fueron detectables en el epitelio normal del colon, que ensayaron
Ptp4a3
la expresión de genes inmediatamente después del tratamiento con el AOM intestinal procarcinógeno (12,5 mg /kg) o solución salina de control de tipo salvaje en ratones C57BL /6J. Los ratones se sacrificaron 8 y 24 horas después de la inyección de AOM y las células epiteliales de colon se recogieron para su análisis. El ARNm total se aisló y cuantitativos de RT-PCR se realizó para ensayar
Ptp4a3
niveles de expresión génica. Curiosamente,
Ptp4a3
se reguló en un 78% a las 8 horas y el 60% a las 24 horas en el tratado con la OMA relativa epiteliales normales de control (Fig. 2C). Proteína lisados de los ratones tratados con AOM sugieren que los niveles de proteína PTP4A3 también se incrementan en estos tejidos (Fig. 2D). Si bien el papel de
Ptp4a3 Hoteles en el cáncer de colon se cree tradicionalmente para involucrar a los tumores en etapa tardía y la metástasis, este hallazgo sugiere un posible papel en la enfermedad en estadio temprano y la tumorigénesis.
A) La OMA paradigma de tratamiento-DSS usado en este estudio cuenta con una sola dosis de AOM seguido de 3 ciclos de tratamiento de DSS en el agua potable. B) Representación histológico de tejido normal del colon con respecto al tejido tumoral demuestra la eficacia del modelo de AOM-DSS. Después de un ciclo de tratamiento DSS, displasia cripta y la infiltración de células mononucleares fueron evidentes. El tejido tumoral estuvo presente en ambas las 12 y 16 semanas de puntos finales. Antes de sacrificio, los ratones se trataron con BrdU durante 4 horas y la proliferación de células se visualizaron por tinción con un anticuerpo de BrdU. C) RT-PCR cuantitativa se utilizó para ensayar
Ptp4a3
la expresión génica en tejido epitelial colon normal después del tratamiento ya sea con AOM o control de solución salina.
Ptp4a3
fue elevada 73% en el tejido de colon siguiente cuando se mide 8 hr después de la inyección y 60% a las 24 horas (* = p & lt; 0,001; n = 6 /grupo de tratamiento; barras = SEM). D) Western blot de lisados de colon indica un aumento de la proteína PTP4A3 después de la exposición OMA. E) RT-PCR cuantitativa indica los cambios en niveles de expresión génica de
Ptp4a Buscar miembros de la familia en el colon normal y tejido tumoral.
Ptp4a3
se elevó 3,7 veces (** = p & lt; 0,01), mientras que
Ptp4a1
y
Ptp4a2
niveles disminuyeron significativamente (* = p & lt; 0,0001 y p & lt; 0,05, respectivamente) (n = 15, barras = SEM). F) Análisis de transferencia Western que demuestra más altos niveles de proteína PTP4A3 en los tumores de colon en comparación con tejido normal. G) Western blot combinado con QRT-PCR análisis también demostró que cuando se comparan
Ptp4a3
niveles de mRNA (enumerados encima de cada calle) a la proteína PTP4A3, la expresión de genes de alta parecía corresponder a los niveles más altos de proteína.
Knockout de Ptp4a3 suprime la formación de tumores intestinales
para explorar un papel funcional potencial de
Ptp4a3 Hoteles en la formación de tumores, los ratones sometimos a un modelo OMA-DSS ampliamente utilizado de la colitis asociada cáncer de colon. Wildtype y
Ptp4a3
- null ratones fueron inyectados con una sola dosis de AOM (12,5 mg /kg) seguido de tres ciclos de consumo de DSS 2,5% (Fig 2A.). Este modelo produce cambios histológicos distintos relación con los controles normales, incluyendo la inflamación correspondiente a DSS tratamiento, y la posterior displasia (Fig. 2B). Los tumores eran visualmente evidente en el colon distal de ratones de tipo salvaje en el sacrificio a las 12 o 16 semanas después del tratamiento inicial de OMA y eran (Fig. 2B y 3A). Como se indica en la Figura 3B,
Ptp4a3
-null ratones muestran una reducción del 54% en el número de tumores (p & lt; 0,004) después de 16 semanas de tratamiento. Aunque en menor número de tumores promedio se observaron a las 12 semanas en
Ptp4a3
-null ratones relativos al tipo salvaje, esto no fue estadísticamente significativa (p & gt; 0,2). Curiosamente, el número de tumores (p = 0,05), así como el diámetro del tumor (P & lt; 0,001) aumentó significativamente del 12 al 16 semanas, mientras que
Ptp4a3
-null tumores no aumentaron significativamente en número o tamaño. El diámetro medio de los tumores producidos por este modelo fue de 3-4 mm (Fig. 3C).
A) Imagen que representa la aparición de tipo salvaje y
Ptp4a3
-null tejido del colon después de 16 semanas de tratamiento con OMA-DSS. B) Se registró el número medio de tumores en ratones por genotipo después de 12 y 16 semanas de tratamiento. El número medio de tumores aumentó significativamente en los ratones de tipo salvaje entre los 12 a 16 puntos de tiempo wk (* = p = 0,05). Durante este tiempo el número de tumores observados en
Ptp4a3
-null ratones fue la misma (p = 0,70). A las 12 semanas, los ratones de tipo salvaje (n = 6) no tenían significativamente más tumores por ratón que
Ptp4a3
-null (n = 5) ratones (p = 0,27). A las 16 semanas, los ratones de tipo salvaje (n = 14) muestran significativamente menos tumores por ratón que
Ptp4a3
-null ratones (n = 7) (** = p & lt; 0,005). C) El tamaño del tumor (medido por el diámetro medio de los tumores para cada ratón) se determinó en cada punto de tiempo. Se observó el diámetro del tumor para aumentar significativamente en los ratones de tipo salvaje de 12 a 16 semanas (* = p & lt; 0,001). No se observó ninguna diferencia significativa en
Ptp4a3
-null ratones de 12 a 16 semanas, o entre genotipos en cualquiera de los puntos de tiempo. Barras = SEM.
Ptp4a3 es elevada en los tumores de colon derivados de la OMA
Debido a la alta expresión de PTP4A3 se ha informado en los tumores de colon primarios humanos [22], hemos examinado
Ptp4a3
expresión en el modelo de ratón de cáncer de colon. En primer lugar, el ARNm total fue extraído a partir de tejido tumoral de los ratones de tipo salvaje y cuantitativa de RT-PCR se utilizó para ensayar el nivel de expresión de cada
Ptp4a
miembro de la familia (Fig. 2E). En relación con el epitelio normal del colon,
Ptp4a3
fue elevado 3,7 veces de media (p & lt; 0,01). Mientras considerable heterogeneidad en
se observó Ptp4a3
expresión, fluctuaban entre 1,4 y 6,7 veces la regulación positiva,
Ptp4a3
niveles de mRNA en tejido tumoral fueron consistentemente más alta que el tejido normal para cada muestra analizada (n = 15 ). Curiosamente, los niveles de expresión génica de
Ptp4a1
y
Ptp4a2
eran ambos downregulated 64% y 36% (p & lt; 0,0001 y p & lt; 0,05), respectivamente, en los tumores de colon respecto al tejido normal. los niveles de proteína en lisados PTP4A3 epiteliales de colon normales fueron muy bajos cuando se ensaya por Western Blot (Fig. 2F). Por el contrario, PTP4A3 era fácilmente detectable, pero variable, en muestras de tumores de colon. Como era de esperar, no parece haber una cierta correlación entre los niveles de proteína PTP4A3 y los niveles de mRNA (Fig. 2G). La falta de anticuerpos funcionales para PTP4A1 y PTP4A2 impidió la evaluación de los niveles de proteína tumoral para estos miembros de la familia.
Pérdida de Ptp4a3 aumenta IGF1Rβ y c-myc expresión en tumores
A continuación examinó lisados obtenidos a partir tanto de tipo salvaje y
tumores Ptp4a3
-null de colon. Hemos utilizado por primera matriz de proteína de fase inversa para analizar los niveles de más de 130 productos diferentes de proteínas contenidas en el tipo salvaje y
Ptp4a3
-null tumores (Fig. S5). Mientras que los niveles de proteína en estos tumores exhiben una considerable heterogeneidad, dos conocidos proteínas de señalización oncogénicas, la tirosina quinasa del receptor IFG1Rβ y el factor de transcripción c-MYC se expresaron a niveles más altos en
Ptp4a3
-null tumores (Fig. 4A). Después de la cuantificación, la proteína IGF1Rβ fue en promedio 2,1 veces mayor (p & lt; 0,001) y c-MYC fue aproximadamente 2,5 veces mayor (p & lt; 0,02) en
Ptp4a3
-null relativo a los tumores de tipo salvaje de colon (Fig. 4B-C). Por el contrario, no se observó una diferencia significativa en la activación de AKT entre genotipos (Fig. 4D). Este resultado sugiere que los tumores potencialmente pueden compensar
Ptp4a3
deficiencia a pesar de las vías de señalización alteradas.
A) muestra Cluster del mapa de calor generado a partir de análisis de RPPA que se realizó usando lisados de tumor de colon de AOM-DSS de tipo salvaje y ratones
Ptp4a3
-null tratada. dianas proteicas eran o superior (amarillo), inferior (azul), o sin cambios (negro). B) Los niveles de proteína fueron confirmados por Western blot de lisados de tumor de colon de tipo salvaje y ratones
Ptp4a3
-null. IGF1Rβ y la proteína c-myc fueron escogidos debido a que parecían ser las proteínas upregulated más consistentemente en muestras
Ptp4a3
-null. C) Cuando cuantificado, los niveles de proteína IGFIRβ eran 2,1 veces más alta en
tumores Ptp4a3
-null (p & lt; 0,001). D) c-Myc los niveles de proteína fueron 2,5 veces más alta en
Ptp4a3
-null tumores (p & lt; 0,02). E) Los niveles de AKT activado, como se indica por la fosforilación de Ser473, no fueron significativamente diferentes en función del genotipo con respecto al total de proteínas AKT.
Discusión
Una serie de genes han sido implicados en el desarrollo y progresión del cáncer colorrectal. Anterior expresión génica estudios de perfiles identificaron 144 genes que son regulados hasta en muestras de hígado colorrectal metastásico [2]. El único gen, sin embargo, que fue elevado consistentemente en todas las muestras metastásicas fue
Ptp4a3
. Tanto la amplificación de genes y la actividad transcripcional mejorada es probable causal de los altos niveles. A pesar de la aparente importancia de
Ptp4a3 Hoteles en la biología del tumor, nuestra comprensión de la funcionalidad de
Ptp4a3
está solidariamente limitada debido en parte a la ausencia de modelos animales informativos. El modelo de ratón dirigida de genes para la interrupción de la
Ptp4a3
locus genómico que hemos desarrollado es útil no sólo para el estudio de los cambios fenotípicos que se producen con la pérdida global de la fosfatasa, sino también para futuras investigaciones sobre el tejido y temporal supresión de genes específicos y las interacciones de colaboración con otros genes, incluyendo los otros dos miembros de la familia
Ptp4a
. Nuestro modelo establece que los ratones pueden sobrevivir en ausencia de un gen funcional
Ptp4a3
, aunque hubo un número ligeramente inferior de ratones machos producidos, y que son capaces de vivir hasta la madurez en condiciones normales sin grandes deficiencias de salud . Esto está en contraste con lo que se ha reportado con ratones que carecen de la altamente homóloga
Ptp4a2, España, que se cree que es el miembro más de la familia de expresión ubicua en condiciones normales.
Ptp4a2
-null ratones expuestos desarrollo de la placenta defectuosa y ambos sexos mostró un crecimiento retardado en las etapas embrionarias y adultas [23].
Ptp4a2
pérdida disminuye las capas spongiotrophoblast y decidua de la placenta que menoscabe el transporte de nutrientes y causando un retraso del crecimiento embrionario. Por otra parte, la pérdida de
Ptp4a2
resultados en la inactivación de AKT, que no era evidente en nuestros datos con respecto a
Ptp4a3
pérdida. Colectivamente, las diferencias en los dos modelos de supresión de genes son coherentes con las funciones que no se solapan de estos dos miembros de la familia de la fosfatasa cercanos.
Supresión de proteína PTP4A3 se confirmó por análisis de transferencia de Western usando una variedad de lisados de tejido de tipo salvaje y
Ptp4a3
-null ratones. Aunque habían sugerido estudios iniciales
Ptp4a3
expresión se limitaba a corazón, músculo esquelético y páncreas [24], nuestros datos revelaron un patrón de expresión más omnipresente. Mientras que se observaron los niveles más altos de PTP4A3 en el corazón fetal, la proteína también era detectable en niveles inferiores de corazón adulto, músculo esquelético, bazo, páncreas, cerebro, pulmón, timo, colon y el intestino delgado; PTP4A3 ninguna proteína fue detectable el hígado o el riñón
.
Debido a PTP4A3 humana se ha implicado en la patogénesis del cáncer colorrectal metastásico humano, se investigaron los efectos de
Ptp4a3
supresión en un modelo de ratón de cáncer de colon cáncer. El tratamiento con AOM /DSS es uno de los modelos de ratón de tumor de colon más populares y la cepa C57BL /6J a los que se backcrossed este modelo es particularmente susceptible al cáncer de colitis asociada a [13], [16], [17].
Ptp4a3
se clasifican tradicionalmente como un gen asociado con la metástasis y no sabe que están implicados en las primeras etapas de la progresión del cáncer. En el estudio actual, aportar pruebas de que los
Ptp4a3
los niveles de proteína de ARNm y PTP4A3 se incrementan poco después de la exposición a la OMA, la etapa de iniciación en nuestro modelo de cáncer de colon. Esta es una evidencia importante que PTP4A3 podría ser también intervenga en la fase preneoplásica de malignidad.
ratones sometidos al modelo /DSS AOM tumores desarrollados constantemente en la región distal del colon. Estos tumores primarios muestran niveles consistentemente altos de
Ptp4a3
en relación con el epitelio normal del colon - similar a lo que se ve en pacientes con cáncer de colon humano [22]. En particular, los ratones deficientes para
Ptp4a3
Had & gt; 50% de reducción en la formación de tumores proporcionando una prueba más que
Ptp4a3
es un mediador clave de la progresión del cáncer de colon. Sin embargo, la ausencia completa de PTP4A3 fosfatasa era insuficiente para suprimir la tumorigénesis de colon, lo que sugiere que un subconjunto de tumores puede no requerir
Ptp4a3
como conductor de la enfermedad. Esto es apoyado por el hallazgo de que no todos los tumores en este modelo tenían alta. (& Gt; la regulación al alza de 2 veces)
Ptp4a3
niveles de expresión
El modelo animal hemos desarrollado presenta una oportunidad única para abordar el papel de
Ptp4a3 Hoteles en la biología del tumor. la exposición OMA provoca daños en el ADN y el estrés genotóxico. Una respuesta importante al daño del ADN es la inducción de
p53
, lo que puede inducir a
Ptp4a3
expresión [25] y puede proporcionar una explicación para la inducción de
Ptp4a3
en el colon de los ratones tratados con AOM. Además,
Ptp4a3
ha sido identificado como un objetivo de regulación directa de TGF señalización en células de cáncer de colon. La señal de TGF activa induce SMAD3 /4 unión a la
Ptp4a3
locus genómico y por lo tanto la inhibición de la transcripción de genes [19]. La pérdida de TGF es un fenómeno observado con frecuencia en el cáncer de colon humano [26], así como el modelo de ratón AOM de cáncer de colon [18]. Es probable que este evento contribuye a elevados
Ptp4a3
la expresión de genes en el cáncer a través de SMAD3 /4 inactivación. Curiosamente, un modelo de ratón deficiente para
Smad3
se ha informado que desarrollan espontáneamente cáncer de colon [27], y
Smad4
deficiencia exacerba en gran medida un modelo de ratón de cáncer de colon [28]. La formación de lesiones neoplásicas en el
Ptp4a3
-null ratones podría ser la consecuencia de la participación de las vías de señalización de los oncogenes o factor de crecimiento adicionales, tales como IFG1Rβ y c-myc. c-MYC es conocido por ser el aumento en los tumores después del tratamiento OMA /DSS y ambos IFG1Rβ y c-myc fueron marcadamente elevados en el
Ptp4a3
-null tumores en relación con los tumores derivados de tipo salvaje.
Mientras
Ptp4a3
producto del gen inicialmente se cree que participan en la metástasis del tumor y la enfermedad de etapa avanzada, nuestros resultados proporcionan evidencia de posibles funciones en otras fases de la enfermedad incluyendo la transformación de pre-neoplásicas y la carcinogénesis temprana. El concepto de focalización terapéuticamente
Ptp4a3
podría, por lo tanto, ser atractivo en múltiples etapas del cáncer.
Materiales y Métodos
Creación de
Ptp4a3
ratones mutantes
El vector de reconocimiento de genes condicional se construyó utilizando un
E basados en fagos. coli
sistema de recombinación [29]. Los detalles específicos con respecto a la construcción del vector y de orientación estrategia se describen en la figura. S1. Nos centramos específicamente el exón 2 debido a que contenía el sitio de inicio de la transcripción y era necesario para la traducción apropiada de la transcripción del ARNm. Después de la transfección del constructo en R1 células madre embrionarias [30], los ratones se crean a partir de clones correctamente orientados usando técnicas de producción animal quimérico estándar con C57BL /6J blastocistos. La nueva cepa se backcrossed a C57BL /6J (The Jackson Laboratory) de & gt; 5 generaciones y ratones para los experimentos fueron producidos usando parejas reproductoras heterocigotos. La genotipificación se realizó por análisis de transferencia de Southern con una sonda radiomarcada correspondiente a ~ 300 pb del exón 6, que era externo a la orientación de genes vector. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos pertinentes fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh.
modelo de cáncer de AOM
Wildtype y ratones
Ptp4a3
-null (macho, 6 -8 semanas) se les administró una sola dosis de AOM (12,5 mg /kg) (Sigma) en solución salina estéril mediante inyección IP. se le dio solución DSS (2,5%) (MP Biomedicals)
ad libitum
durante 7 días seguidos de 14 d de agua potable normal y este ciclo se repitió un total de 3 veces [13]. los ratones experimentales se sacrificaron a los 12 o 16 semanas tras el inicio del tratamiento, en el que se aisló de tejido de colon punto, se aclara, y abrió longitudinalmente para su análisis. Tumor y el tejido normal fueron o bien se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido o sumergidos en 10% de formalina tamponada neutral. Para cada ratón, los tumores individuales se contaron y se midieron con un calibrador digital y el recuento medio de los tumores y el diámetro se determinaron para cada genotipo.
análisis de transferencia de Western
Las células y los tejidos se lisaron usando tampón RIPA y cuantificado mediante el ensayo de Bradford. Una muestra de proteína total de 40 mg se separó usando Novex reactivos SDS-PAGE (Invitrogen) y se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en tampón de Odyssey (LiCor Biosciences) y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche, seguido de anticuerpos fluorescentes secundarias de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios disponibles en el mercado: PTP4A3 clon 318 (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH, IGF1Rβ, c-myc, p-AKT (S473), y AKT (Cell Signaling Technology)
cuantitativa RT. PCR
ARN total fue extraído a partir de tejido utilizando reactivo Trizol según el protocolo del fabricante (Invitrogen). Un total de 500 ng de ARNm se convirtió en ADNc utilizando el kit de síntesis de la primera hebra iScript (Bio-Rad). Los cebadores (Tab. S1) utilizados para la amplificación de la diana se diluyeron a una concentración final de 500 pM, y la supervisión en tiempo real de la reacción de PCR se realizó en un termociclador iQ5 Biorad con 2X SYBR Green Mastermix (Bio-Rad). El siguiente programa se llevó a cabo durante 40 ciclos: 95 ° C durante doce y media; 58 ° C durante 1:00; y 72 ° C durante doce y treinta.
array de proteínas de fase inversa
Proteína lisados (100 ug cada una) a partir de muestras de tumor de colon (n = 5 /genotipo) fueron desnaturalizados y enviado congelado a MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) para el análisis. Brevemente, los lisados fueron de dos veces en serie diluida durante 5 diluciones y dispuestos en portaobjetos de nitrocelulosa recubierto, sondadas con anticuerpos, y se visualizó por diaminobenzidina reacción colorimétrica. los niveles de proteína relativos de cada muestra se determinaron por interpolación de cada uno de curvas de dilución de la corredera anticuerpo curva estándar. Todos los puntos de datos se normalizaron para la carga de proteínas y se transformaron con el valor lineal. valores lineales se transformaron con el valor log2 y luego mediana centrado en el análisis de agrupamiento jerárquico. El mapa de calor se genera en Cluster 3.0 como un agrupamiento jerárquico utilizando correlación de Pearson y una métrica centro (se proporcionan detalles adicionales es Fig. S5).
Estadísticas
El análisis estadístico de la descendencia genotipo se calculó la prueba de Chi-cuadrado comparando observado y los resultados esperados. Los datos de los ensayos celulares, Western blot, y cuantificaciones QRT-PCR se analizaron mediante la prueba t de 2 colas. En ambos casos, la significación se definió como p = 0.05.
Apoyo a la Información
Figura S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s001 gratis (PDF)
figura S2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s002 gratis (PDF)
Figura S3.
doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s003 gratis (PDF)
figura S4.
doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s004 gratis (PDF)
Figura S5.
doi: 10.1371 /journal.pone.0058300.s005 gratis (PDF) sobre Table S1.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0058300.s006 gratis (PDF)
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a Carolyn Ferguson por su experiencia técnica y asistencia