Extracto
Antecedentes
A pesar de la pérdida relacionada con la edad del cromosoma Y (LOY) en las células hematopoyéticas normales es un fenómeno bien conocido, las consecuencias fenotípicas de LOY haber sido difícil de alcanzar. Sin embargo, LOY se ha encontrado en asociación con el tabaquismo, la supervivencia más corta y un mayor riesgo de cáncer. Se sugirió que LOY en los glóbulos podría convertirse en un biomarcador predictivo de la carcinogénesis masculina
Objetivos, Métodos & amp.; Hallazgos
Para investigar la asociación de LOY en las células de la sangre con el riesgo de desarrollo de cáncer colorrectal (CC) y los cánceres de próstata (PC), se han analizado muestras de ADN a partir de sangre periférica de 101 pacientes masculinos CC (media de edad de 60,5 ± 11,9 años), 70 pacientes con CP (edad media de 68,8 ± 8,0 años) y 93 varones sanos de control (edad media de 65,8 ± 16,6 años). La metodología incluye co-amplificación de las secuencias homólogas en el cromosoma Y y otros cromosomas utilizando fluorescente cuantitativa multiplex (QF) PCR seguido por la detección automática y el análisis en ABI 3500 Genetic Analyzer. La relación /X media Y fue significativamente menor en todo el grupo de pacientes con cáncer (0,907 ± 0,12; p = 1.17x10
-9) en comparación con los controles (1,015 ± 0,15), así como en CC (0,884 ± 0,15; p = 3.76x10
-9) y los pacientes con CP (0,941 ± 0,06; p = 0,00012), cuando se analizó por separado. El análisis de regresión logística multivariable de ajustar por LOY y edad demostró que LOY es un predictor más significativo de la presencia de cáncer de edad, y que la edad probablemente no contribuye al aumento del número de sujetos con detectable LOY en pacientes con cáncer cohorte.
conclusión
en conclusión, nuestros resultados apoyan los hallazgos recientes de asociación de LOY en las células sanguíneas con la carcinogénesis en los hombres
Visto:. Noveski P, S Madjunkova, Sukarova Stefanovska E, Matevska Geshkovska N, Kuzmanovska M, Dimovski A, et al. (2016) Pérdida del cromosoma Y en la sangre periférica de cáncer colorrectal y de próstata pacientes. PLoS ONE 11 (1): e0146264. doi: 10.1371 /journal.pone.0146264
Editor: Ezio Laconi, Universidad de Cagliari, Italia
Recibido: 14 Septiembre, 2015; Aceptado: 15 de diciembre de 2015; Publicado: 8 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Noveski et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el proyecto de 13 a 3.595 /1 del Ministerio de Educación y Ciencia, Macedonia (a DPK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Pérdida de cromosoma y (LOY) es un fenómeno bien conocido que se asocia con el envejecimiento y observó con diferentes frecuencias en células de médula ósea [1,2] o en células de sangre periférica [3,4] de saludable varones de más edad. La asociación de LOY con cánceres hematológicos ha sido difícil de alcanzar. Sin embargo, LOY se ha informado en leucemias [5,6,7,8] y en pacientes predice que tienen una mala respuesta a la terapia del cáncer [9]. Otros estudios han encontrado la asociación sólo en pacientes que mostraron LOY en más del 75% [10] o el 100% de las células afectadas [11]. LOY reciente estudio de investigación en dos fracciones celulares separadas de la sangre periférica encontró significativamente mayor frecuencia de LOY en células CD34 + en pacientes con síndromes mielodisplásicos comparación con los hombres de edad avanzada sin enfermedades hematológicas [12]. Un estudio que muestra ninguna asociación entre Loy y cánceres hematológicos también se ha publicado [13].
Una asociación de LOY ha sido reportado en las células de cáncer de cáncer urotelial de vejiga [14], el cáncer de páncreas [15], el carcinoma de esófago [16], las líneas celulares de cáncer de cabeza y de carcinoma de cuello [17], carcinoma de células renales [18] y en de carcinoma hepatocelular [19]. Estos estudios se han centrado en LOY en el tumor en sí como un marcador para subtipo de cáncer y /o progresión de la enfermedad y la posible resultado.
Varios estudios han investigado mosaico LOY en células de sangre periférica en relación a la presencia de la enfermedad. Una se encontró asociación con cirrosis biliar primaria [20], la tiroiditis autoinmune [21], pero no con el cáncer de mama masculino [22]. Los estudios basados en arreglos grandes cohortes SNP encontraron una asociación de mosaico LOY en las células de sangre periférica con mayor riesgo de cáncer, la supervivencia más corta y el tabaquismo [23,24].
Damos a conocer los resultados de un estudio de asociación de LOY en células de sangre periférica en pacientes varones con cánceres colorrectales y de próstata.
Materiales y Métodos
Los sujetos
Se estudiaron 101 pacientes varones con cáncer colorrectal (edad media de 60,5 ± 11,9 años ), 70 pacientes varones con cáncer de próstata (edad media de 68,8 ± 8,0 años) y 93 varones sanos de la población general (edad media de 65,8 ± 16,6 años). sujetos con cáncer fueron reclutados en el Departamento de Urología de la Facultad de Medicina, Skopje, Macedonia y se remitieron al Laboratorio de Farmacogenética, Facultad de Farmacia, mientras que las muestras de ADN de los controles sanos se obtuvieron del banco de ADN en el RCGEB "Georgi Efremov D. ". Algunas de las características clínico-patológicas de los tumores de los pacientes con cáncer se dan en la Tabla 1. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Academia de las Ciencias de Macedonia y Artes (Aprobación Nº 2010/1) y el Comité de Ética de la Facultad de Farmacia, Universidad de los Santos Cirilo y Metodio (Aprobación No. 03-95), Skopje, Macedonia. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
aislamiento del ADN
Se aisló el ADN de la sangre entera. Después de la lisis, los leucocitos se aglomeraron y se digirieron con proteinasa K y el ADN se extrajo siguiendo el protocolo estándar de fenol-cloroformo.
Determinación de LOY mosaico en
sangre
Presencia de LOY se determinó con múltiple cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa de fluorescencia (QF-PCR) desarrollado originalmente para la detección de microdeleciones en regiones AZF del cromosoma y y aneuploidías de los cromosomas sexuales en pacientes con infertilidad masculina [25,26]. La cantidad relativa de cromosoma Y se evaluó a través de la chromosomeY /chromosomeX (Y /X) Relación de señal fluorescente de secuencias cortas co-amplificado a partir de Y-X genes amelogenin homóloga (
AMELY
y
AMELX
).
AMELX
contiene un par 6 base de deleción (pb) en el intrón 1 que falta en
AMELY
, de modo que los fragmentos de co-amplificado son de tamaño 112 pb del cromosoma Y, y 106 pares de bases del cromosoma X y están separadas y se cuantifica por electroforesis capilar fácilmente (~ 1: 1 relación de 112/106 pb picos en las muestras de ADN masculino normales y la presencia de solamente 106 pb pico en las muestras de ADN femenino) [27]. Los resultados falsos positivos en caso de pérdida o ganancia del cromosoma X se controlan mediante la amplificación del fragmento de 152 pb de la
TAF9B
gen en el cromosoma X con cebadores que también co-amplifican 148 pb secuencia homóloga en el cromosoma 3. La relación de las áreas de los picos de los dos fragmentos de co-amplificado (148/152 pb; cromosoma 3 /cromosoma X) es de ~ 2: 1 en muestras de ADN masculinos normales y ~ 1: 1 en muestras de ADN hembra normales
. deleciones o duplicaciones en
AMELY
región fueron excluidos por otros dos conjuntos de cebadores. El primero de ellos amplifica secuencias homólogas de
DAZL
gen en el cromosoma 3 (dos copias del fragmento de 217 pb) y
DAZ
genes en el cromosoma Y (cuatro copias del fragmento de 214 pb). El otro conjunto de cebadores amplifica la
MYPT2
gen en el cromosoma 1 (175 bp) y dos secuencias homólogas (fragmentos de 180 pb) a partir del cromosoma Y. secuencias de cebadores y condiciones de PCR multiplex para la QF-PCR fueron como se describe en otro lugar [ ,,,0],26]. Co-amplificado productos de PCR marcados con fluorescencia se realizaron en Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer con LIZ500 como patrón interno y se analizaron con software GeneMapper 4,1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). electroforegramas representativos de dos sujetos, uno con con amelogenina Y /X proporción de ~ 1 y otro con amelogenina Y /X proporción de 0.28 se muestran en la Fig 1.
electroforegramas de sujetos con a) amelogenina normal de Y /X relación (áreas de los picos aproximadamente iguales de cromosoma X y las secuencias del cromosoma y) yb) del paciente con cáncer colorrectal y aumentó significativamente la proporción de células con LOY (relación y /X amelogenina de 0,28).
para validar la metodología QF-PCR hemos utilizado dos diferentes muestras de ADN: una muestra normal de sexo masculino (46, XY), y una muestra con el síndrome de Turner (45, X0) (para imitar las células con LOY). Ambas muestras se mezclaron en diferentes proporciones para representar las muestras con 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% y 90% LOY. Previo al análisis ambas muestras se ajustaron a la misma concentración. concentración de ácido nucleico y la pureza de la muestra se determinaron mediante NanoVue ™ Plus espectrofotómetro (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), mientras que la concentración de ADN de doble cadena precisa se midió con Qubit
® kit de ensayo de ADN de doble cadena SH sobre un qubit 2.0 fluorómetro (Thermo Fisher científica, de Waltham, Massachusetts, EE.UU.). Con las dos mediciones de ADN concentraciones y pureza para ambas muestras eran idénticas.
La reproducibilidad de la determinación de proporción A /X Y se midió mediante la repetición de la amplificación QF-PCR y análisis en 11 sujetos con amelogenina Y /X relación inferior a 0,80 . Además, el coeficiente de variación de la Y /X relación de amelogenina se calculó a partir de la repetida QF-PCR análisis realizados en 14 sujetos con Y /X relación entre 0,8-1,0 y 12 sujetos entre 1,0-1,2. Para eliminar el posible sesgo de la PCR diferentes montajes, las reacciones de PCR de un tercio de los controles sanos y dos tercios de los pacientes con cáncer se llevaron a cabo de forma simultánea en cada una de la PCR se ejecuta.
El análisis estadístico
las diferencias entre las medias de los dos grupos se analizaron con la prueba t de Student después de evaluar para la igualdad de las diferencias con la prueba Levene`s. La correlación entre dos variables se analizó utilizando Pearson coeficiente de correlación (r). El límite de detección se calculó en base a la desviación estándar de la respuesta y la pendiente de una recta de regresión [28]. Las diferencias entre las medias de las mediciones repetidas se analizaron con la prueba t de muestras apareadas. multivariante de regresión logística se utilizó para modelar la asociación de Loy y las variables de edad, con la presencia de cáncer. El nivel de significación se consideró cuando el valor de p fue menor de 0,05. El coeficiente de variación de las mediciones duplicadas se calculó con MedCalc para Windows, versión 12.5 (MedCalc Software, Ostende, Bélgica) de acuerdo con su metodología descrita. Los análisis de datos para todas las demás pruebas estadísticas se realizaron utilizando el paquete estadístico para Ciencias Sociales, versión 19 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Validación del amelogenina /X Y la relación de pico como un método para la detección de mosaico LOY en las células de sangre y pruebas de reproducibilidad
normal 46, muestra de ADN XY y nueve muestras de ADN mixtas con diferentes proporciones de 46, XY y 45, las muestras de ADN X0 se amplificaron por triplicado y los correspondientes se obtuvo relación amelogenina Y /X para cada proporción. El análisis de correlación basada en los valores promediados de mediciones por triplicado mostró una fuerte correlación negativa (r = -0,999, p = 8.03x10
-13) entre el porcentaje de 45, muestra X0 y amelogenina Y /X relación.
La se calculó el límite de detección (LOD) de LOY en el 4,6%, utilizando la desviación estándar y la pendiente de la recta de regresión de los valores medios de mediciones por triplicado (figura 2). amelogenin
los puntos representan un promedio de los valores de y /X de relación correspondiente a 0%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% y 90% de la 45, X0 en las muestras de ADN mezcladas. línea de regresión se estimó mediante porcentaje de 45, X0 muestra como independiente y amelogenina X relación Y /como variable dependiente. Pendiente (s) y la desviación estándar (σ) de la línea de regresión se utilizaron para calcular el límite de detección mediante la fórmula LOD = 3.3σ /s [28].
La reproducibilidad de la amelogenina Y /X proporciones se evaluó en 37 sujetos. El bajo coeficiente de variación de 4,62% y ninguna diferencia significativa en los medios entre dos mediciones (p = 0,1097, prueba t pareada) confirman que QF-PCR es un método fiable para la estimación de la amelogenina y /x ratios.
mosaico LOY en las células de la sangre se asocia significativamente con la presencia de cáncer
Hemos analizado la relación Y /X usando QF-PCR en 264 muestras de ADN aisladas a partir de leucocitos de sangre periférica en pacientes con cáncer colorrectal (n = 101 ), cáncer de próstata (n = 70) y controles sanos (n = 93), la misma edad. Distribución de las relaciones /X Y se presenta como histogramas en la Fig 3. La media razón Y /X fue significativamente menor en pacientes con cáncer (0,907 ± 0,12; p = 1.17x10
-9) que los controles (1.015 ± 0.15) . La significación estadística se conservará incluso medias y /x proporciones de pacientes con cáncer colorrectal (0,884 ± 0,15; p = 3.76x10
-9) y los pacientes con cáncer de próstata (0,941 ± 0,06; p = 1.15x10
-4) se analizaron por separado.
también se muestran los valores medios y las desviaciones estándar.
el uso de regresión logística multivariable hemos modelado porcentaje de LOY (inferirse de amelogenina y /X ratio) y la edad para evaluar su fuerza para predecir la presencia de cáncer. Ambas variables predictoras se utilizaron como variables continuas, mientras que el resultado fue la presencia de cáncer y no cáncer como referencia (Tabla 2). porcentaje LOY predice la presencia de cáncer con una fuerza significativa (p = 2.043x10
-9), mientras que la edad mostró sólo una importancia marginal (p = 0,024). Las dos variables predictoras en el modelo sugieren que el aumento de la edad al ajustar por LOY porcentaje no aumenta el riesgo de la presencia de cáncer en nuestra cohorte de pacientes con cáncer.
Discusión
Varios grupos de investigación están investigando biomarcadores de cáncer no invasivo para mejorar el diagnóstico precoz y el tratamiento de pacientes con cáncer. Recientemente, LOY fue sugerido como un posible marcador biológico para diferentes tipos de cáncer en los hombres. Los datos de grandes cohortes asociados LOY en sangre periférica con el riesgo de mortalidad por todas las causas y la mortalidad por cáncer no hematológica [23]. Se necesitan estudios de casos y controles de confirmación que asocian LOY mosaico en células de sangre periférica con mayor riesgo de cáncer.
Para contribuir a la clarificación del papel de la LOY en sangre periférica como un biomarcador de cáncer en los hombres, hemos realizado caso estudio de control en pacientes varones con dos tipos diferentes de cáncer.
la metodología se utilizó fue basado en la determinación indirecta de la presencia LOY por QF-PCR, la medición de la relación de áreas de los picos de la etiqueta fluorescente fragmentos de PCR de longitudes fijas en representación de secuencias homólogas en el cromosoma y y algún que otro cromosoma. Esta metodología de la medición de la relación de áreas de los picos es ampliamente utilizado en el diagnóstico prenatal de aneuploidías cromosómicas rápida comunes [29]. También se utiliza para la detección de aneuploidías cromosomas sexuales, así como para las deleciones y reordenamientos de las regiones AZF en cromosoma Y [25]. En contraste con el análisis citogenético de las células sanguíneas cultivadas (sólo los linfocitos T), que es mucho tiempo y propenso a los artefactos técnicos tales como la pérdida de cromosomas durante la preparación de los portaobjetos [3], la metodología QF-PCR se realiza en un ADN aislado a partir de leucocitos de sangre entera , y es barato y más robusto. No fue posible comparar los resultados de amelogenin Y /X proporciones utilizando recuento directo de células con el análisis citogenético, pero hemos validado nuestra metodología mediante la simulación de LOY con el uso de 45, muestra de ADN X0. La alta correlación entre 45, porcentaje X0 y amelogenina proporción A /X Y confirma que QF-PCR es un método fiable para la estimación de las Y /X ratios. Aunque hay informes de
AMELY
deserción alélica como resultado de la deleción en esta región del cromosoma Y, el aumento de la frecuencia se informa sobre todo en poblaciones de Asia [30,31,32]. No hemos detectado pérdida de
AMELY Estar entre los varones incluidos en este estudio, así como más de 4000 muestras masculinas analizado en nuestro laboratorio para detectar la presencia de la aneuploidías cromosómicas más comunes, la paternidad y la infertilidad masculina (datos no publicados).
En nuestro estudio, hemos incluido pacientes varones con cáncer de próstata y colorrectal. Aunque la amelogenina X relación /Y no da un valor preciso del porcentaje de células con LOY, los valores de la relación medios obtenidos dentro mismas condiciones experimentales representan un reflejo aproximado para medida de LOY para los grupos estudiados. La media de Y /X proporciones fueron significativamente más bajos en pacientes con cáncer colorrectal que los pacientes con cáncer de próstata. El mayor porcentaje de pacientes con LOY en nuestra cohorte de pacientes con cáncer es consistente con los hallazgos recientes que muestran frecuencia significativamente mayor de los cromosomas sexuales monosomías en pacientes con cáncer de pulmón y vejiga en comparación con los controles sanos [33]
.
Debido LOY ha informado de que se asocia con la edad, hemos adaptado nuestros pacientes de cáncer y los sujetos de control no cancerosas con la edad y, posteriormente, la edad y el porcentaje LOY para las predicciones de presencia del cáncer de modelado. Los resultados mostraron que el aumento del número de sujetos con LOY en nuestra cohorte de pacientes con cáncer probablemente no está influenciada por su edad.
El mecanismo exacto por el cual las células están perdiendo cromosoma Y no se conoce. Un mecanismo propuesto es la influencia de acortamiento de los telómeros durante el envejecimiento que conduce a rallador inestabilidad y degradación del cromosoma Y, que tiene telómeros más cortos que los autosomas [34]. Otro mecanismo propuesto está relacionado con la propiedad del cromosoma Y para replicar al final de la fase S [21], lo que acorta el ciclo celular (y la pérdida de cromosoma Y) podría dar una ventaja proliferativa a un organismo de la enfermedad afectada. Diferentes vías pueden ser activados, dando lugar a diferentes tasas de proliferación, el número de células hematopoyéticas con LOY en diferentes tipos de cáncer en respuesta a las señales de las células cancerosas. La variación en el genoma entre las diferentes poblaciones de cáncer podría modular adicionalmente la respuesta de las células hematopoyéticas a las señales celulares de cáncer. Pruebas adicionales para este mecanismo propuesto de la señal inducida LOY está relacionado con el hecho de que fumar tiene un efecto mutagénico transitoria y dependiente de la dosis en LOY-estado [24]. Además, este mecanismo está de acuerdo con la influencia de la señalización propuesta microambientales tejido alterado en evolución somática de una manera dependiente de la edad [35]. Recientemente, la hematopoyesis clonal con mutaciones somáticas se demostró no sólo ser cada vez más común en las personas de edad avanzada, sino también para aumentar el riesgo de neoplasias hematológicas y muerte [36,37], con la posibilidad de que la mortalidad por todas las causas se debe a un aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular [36]. Estos estudios analizan sólo las variantes de nucleótido único y pequeños indeles y no reportan gran aberración como la pérdida del cromosoma Y. Además, las anormalidades cromosómicas grandes (& gt; 2Mb) se encontraron de autosomas en el ADN de la sangre a ser más frecuentes entre los individuos con tumores sólidos que en individuos sin cáncer [38]. Sería interesante ver si ocurrencia de LOY, las mutaciones somáticas y /o ciertos tipos de anomalías cromosómicas están vinculados y presentar juntos en las mismas células o tipos de células. Si deterioro de la salud promueve la ocurrencia simultánea de diferentes tipos de mutaciones genómicas, la LOY mosaico fácilmente detectable podría ser un biomarcador útil.
En conclusión, los resultados de nuestro estudio de casos y controles mostraron un fuerte vínculo entre el cáncer y la presencia de mosaico en LOY sangre periférica de los hombres afectados con cáncer de colon y de próstata son los dos tumores sólidos más comunes en los hombres. También apoyan los hallazgos recientes de asociación de LOY en la sangre con la carcinogénesis en los hombres.