Extracto
El receptor de estrógeno (ER) variante β ERβ2 se expresa en el cáncer de próstata resistente a la castración agresivo y se ha demostrado que se correlaciona con una disminución de la supervivencia global. Análisis de la expresión de todo el genoma después de la expresión ERβ2 en células de cáncer de próstata reveló que la hipoxia fue un tema excesivamente. Aquí nos muestran que ERβ2 interactúa con y estabiliza la proteína HIF-1α en normoxia, induciendo con ello una expresión genética hipóxica. HIF-1α es conocida por estimular la metástasis aumentando la expresión de TWIST1 y el aumento de la vascularización por la expresión de VEGF activar directamente. Se encontró que ERβ2 interactúa con HIF-1α y lleva a cuestas al elemento de respuesta HIF-1α presente en las proximales TWIST1 y VEGF promotores. . Estos hallazgos sugieren que al menos parte de los efectos oncogénicos de ERβ2 está mediada por HIF-1α y que la orientación de este ERβ2 - la interacción de HIF-1α puede ser una estrategia para tratar el cáncer de próstata
Visto: Dey P, Velázquez-Villegas LA, Faria M, Turner A, P Jonsson, Webb P, et al. (2015) del receptor de estrógeno beta 2 induce hipoxia Firma de la expresión génica mediante la estabilización de HIF-1α en el cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (5): e0128239. doi: 10.1371 /journal.pone.0128239
Editor Académico: Sonia Rocha, Universidad de Dundee, Reino Unido
Recibido: November 26, 2014; Aceptado: April 23, 2015; Publicado: 26 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Dey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los archivos de microarrays se encuentran en la Expresión génica Omnibus base de datos del NCBI (número de acceso GSE35095)
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Prevención del cáncer & amp; Instituto de Investigación de Texas (CPRIT) concede HIRP100680 y RP110444, el Fondo de Tecnologías Emergentes de Texas, bajo el Acuerdo no. 300-9-1958, la Fundación Robert A. Welch (Grant E-0004), las acciones del Fondo de Cáncer de Suecia y Marie Curie FP7-PEOPLE-2011-COFUND (CRECIMIENTO 291.795) a través del programa de Movilidad VINNOVA para el Crecimiento (a C. W.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que ningún interés en competencia existe
Introducción
el cáncer de próstata es una enfermedad que progresa lentamente, en un principio se puede tratar con terapia de privación de andrógenos (ADT) [1], pero por lo general se repiten en una forma más agresiva que es independiente de andrógenos [2, 3]. La mayoría de los cánceres de próstata agresivos expresan altos niveles de receptor de andrógenos (AR) y, además, utilizar una variedad de mecanismos para activar AR en ausencia de su ligando. Por ejemplo, el cáncer puede adquirir la capacidad de sintetizar ligandos AR, AR fosforilar o, a través de corte y empalme alternativo, crear un AR constitutivamente activa [4]. En contraste, la expresión de la isoforma principal de los receptores de estrógenos β (ERβ /ESR2), ERβ1, se reduce durante la progresión del cáncer de próstata [5-8]. ERβ1 se ha demostrado que disminuye la expresión de AR, por lo que en el agotamiento de ERβ1, la expresión de AR se aumenta sustancialmente [9]. Además, ERβ1 recientemente se ha demostrado que induce la apoptosis en líneas celulares de cáncer de próstata mediante la activación de la vía FOXO3a /PUMA [10]. ERβ1 También se ha demostrado que inhibe epitelial a mesenquimal transición (EMT) upregulating dominio prolil hidroxilasa 2 (PHD2 /EGLN1) y, posteriormente, la disminución de los niveles de hipoxia 1α factor inducible (HIF-1α /HIF1A) [11, 12]. Por el contrario, ERβ variante de empalme ERβ2 [13] se expresa en la etapa tardía del cáncer de próstata metastásico y expresión ERβ2 nuclear se correlaciona con una disminución de la supervivencia general [14]. ERβ2 contiene un dominio truncado de unión a ligando (LBD) y una secuencia de aminoácidos C-terminal único codificado por un único alternativa exón-ERβ2 específico llamado cx [13]. Esta isoforma ERβ carece de capacidad para unirse al ligando, homodimerize canónicas y activar genes de expresión ERβ1 vías, pero puede heterodimerizarse con lo cual inhibe la actividad de ER ER [13]. Nuclear ERβ2 aumenta la invasividad de las células PC3 [14] y el aumento de la proliferación celular y la expresión de TWIST1 (TWIST1) y c-Myc (MYC) tanto en células 22Rv1 PC3 y, indicando posibles funciones oncogénicas de ERβ2 en el cáncer de próstata [15].
Un tumor que prolifera a menudo está expuesta a condiciones de hipoxia, debido a sus necesidades metabólicas más altas y la falta de neo-vascularización de mantenerse al día con sus demandas. La hipoxia promueve la diferenciación neuro-endocrina del tumor de próstata, lo que aumenta su agresividad [16]. El factor de transcripción HIF-1α es un factor central en la respuesta de las células a la hipoxia. En las células con niveles normales de oxígeno, HIF-1α es hidroxilado por la prolil hidroxilasa, una enzima que utiliza oxígeno como cofactor y es activo sólo en condiciones de normoxia [17]. Prolil hidroxilación causa HIF-1α para interactuar con el factor de Von Hippel Lindau (VHL), dando lugar a la ubiquitinación y la degradación de HIF-1α por el complejo proteasoma [18-21]. Recientemente, varios estudios han encontrado que la proteína HIF-1α puede estabilizarse sin una disminución en la tensión de oxígeno por factores que interfieren con la degradación dependiente de oxígeno HIF-1α [22-24]. Después de la estabilización, HIF-1α se transloca al núcleo y activa la transcripción de genes implicados en la angiogénesis. En los cánceres, HIF-1α cambia la expresión de genes que conducen a un aumento del metabolismo del tumor y la metástasis, la creación de un tumor muy agresivo. Por ejemplo, la regulación de HIF-1α dependiente de expresión TWIST1 es un paso clave en la metástasis [25]. Desde ERβ2 tiene un papel oncogénico se sugiere en el cáncer de próstata, y su variante de empalme ERβ1 es un supresor tumoral conocido para inhibir HIF-1α, que aquí investigado si ERβ2 puede aumentar la estabilización de HIF-1α, y si este mecanismo que subyace a la correlación de ambos factores con , metástasis, el cáncer de próstata agresivo.
Materiales y Métodos
Reactivos y cultivo de células
las líneas celulares PC3 22Rv1 y se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). 22Rv1 células se mantuvieron en RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Sigma, St. Louis, MO), HEPES 25 mM de tampón y 2 mM L-glutamina (Invitrogen Carlsbad, CA), mientras que las células PC3 se mantuvieron en RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Sigma, St. Louis, MO). Todos los experimentos con células utilizan a continuación el paso 30.
anterior [26], pXP2-TWIST1-LUC y pXP2-mTwist1-LUC se han descrito [25].
Construcción
HIG2 se han descrito plásmido de luciferasa de un sistema inducible para ERβ2 y biotina ligasa expresando células PC3 (PC3 BirA)
un sistema basado en transposón mediar la expresión doxiciclina regulado de ERβ2 se utilizó para transfectar de forma estable 22Rv1 y las células de cáncer de próstata PC3. Estas líneas celulares se describen en otra parte [15]. Para la construcción de células PC3 que expresan biotina ligasa, las células PC3 se transfectaron con plásmido que expresa pBirA
Escherichia coli
biotina holoenzima sintetasa (BirA) a partir del promotor actina y se seleccionaron con G418 a 500 mg /ml. Después de dos semanas, se aislaron clones y se ensayaron para la actividad de biotinilación.
preparación extracto de proteína
Para preparar extractos de células enteras, las células se lavaron dos veces con PBS, se lisaron en 10 veces el volumen de células empaquetadas de lisis buffer [0,1% Nonidet P-40, KCl 250 mM, HEPES 5 mM, pH 7,9, 10% (vol /vol) de glicerol, NaF 4 mM, ortovanadato de sodio 4 mM, EDTA 0,2 mM, EGTA 0,2 mM, ditiotreitol 1 mM, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, cóctel inhibidor de la proteasa, PhosStop (Roche, Indianapolis, IN)] durante 15 minutos en hielo y luego se centrifugó a 14.000 x
g
durante 10 minutos
. transferencia Western
Veinte microgramos de proteína se cargaron en una SDS-PAGE 10% Bis-Tris gel con tampón de Tris y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa después de la separación electroforética. Las membranas se bloquearon con leche sin grasa en polvo 5% en tampón TBST 0,1% y se sondaron con anti-ERβ2 (producida en el laboratorio), TWIST1 (sc-15393), y HIF-1α (sc-10790) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Los anticuerpos primarios se utilizaron a 1: 200-1000 diluciones, y se usó anticuerpo secundario a 1:. 10.000
extracción de RNA y PCR en tiempo real
extracción de ARN se realizó con el kit de extracción Qiagen mRNA según el protocolo estándar. cDNA fue sintetizado a partir de 1 g de ARN total con el primer sistema Strand acuerdo con el protocolo estándar (Invitrogen Inc. NY). PCR en tiempo real se llevó a cabo con SYBR Green I tiño mezcla maestra (Applied Biosystems Foster City, CA). Cebadores (Integrated DNA Technologies, Inc. Coralville, IA) fueron: 18s rRNA de avance (F), 5'-CCT GCG GCT TAA TTT GAC TCA-3 'y marcha atrás (R), 5'-AGC TAT CAA TCT GTC AAT CCT GTC C-3; gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa F, 5'-TGA CAA CTT TGG TAT YCG TGG AAG G-3 'y R', 5'-GGA AGG CAG TGT TGA TCT GGA GAG-3 '(genes de referencia); ERβ2 F, 5-ACT TGC TGA ACG CCG TGA CC-3 y R, 5'-CCA TCG TTG CTT CAG GCA A-3 '; TWIST1 F, 5'-GGA GTC CGC AGT CTT ACG AG-3 'y R', 5'-GGA TCT GGA CCT GGT AGA GG-3 '. qPCR reacciones se realizaron con un sistema de PCR 7500 Fast Real-Time (Applied Biosystems) usando condiciones optimizadas para SYBR Green I tiño sistema: 50 C durante 2 minutos, 95 C durante 10 minutos, seguido de 40-50 ciclos a 95 C durante 15 segundos y 60 C durante 50 segundos. concentración óptima de imprimación se determinó en experimentos preliminares, y la especificidad de amplificación confirmado por análisis de la curva de disociación.
traducción in vitro y la expresión bacteriana
HIF-1α y ERβ2 se convirtieron utilizando el sistema de transcripción TNT Rápida /La traducción de Sistemas (Promega Madison, WI). Brevemente, 0,2 g de HIF-1α o vectores de expresión ERβ2 (promotor T7) se añadieron a una parte alícuota de la mezcla maestra TNT Quick y se incubaron en un volumen de 50 l durante 60 minutos a 30 ° C. La síntesis in vitro de la proteína se verificó por SDS-PAGE. Para la expresión bacteriana se utilizaron células bacterianas BL21-DE3 para expresar Su-LBD-ER, Su-LBD-ERβ1, Su-LBD-ERβ2 y Su-LBD-ERβ2ΔCX plásmidos de expresión.
Despliegue del PC3 o HEK293 células
p>
et al
y Yan
et al
. [27, 28] en una placa de cultivo de tejidos de 100 mm. Para las células HEK293 la ligasa de biotina se transfectó transitoriamente. Después de 48 h, se rasparon, sedimentaron y se lisaron en 300 l NETN (Tris 20 (pH = 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,5% Nonidet P-40) células, brevemente sonicado y se centrifugó para eliminar los residuos. perlas de estreptavidina 10μl magnéticos (Pierce Rockford, IL) se lavaron en NETN y se incubaron con 300 l de extracto celular durante 2 horas en la cámara fría. Las perlas se lavaron (rotación 3 x 10 minutos) con 300 NETN l y se hierven con 20 l de 2 x tampón de muestra [125 mM de Tris HCl (pH 6,8), con 4% de SDS, 20% (vol /vol) de glicerol, y 0.004 % de azul de bromofenol] y se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa para transferencia de Western. La transferencia se sondeó con anticuerpos HIF-1α (Santa Cruz Dallas, TX) dilución 1: 1000 y secundaria de anticuerpos. 1: 10.000 dilución
in vitro bajadas de extracción
2μl
In vitro
traducido proteína HIF-1α se incubó con 25 l de lisado bacteriano que contiene Su-ERβ2 (LBD) durante la noche, y los complejos se adsorbieron sobre perlas de agarosa níquel durante 2 h. Las perlas se lavaron tres veces con NETN enfriado con hielo (Tris 20 mM (pH = 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,5% Nonidet P-40). Los complejos se hierven con 20 l de 2 x tampón de muestra, se sometió a SDS-PAGE y transferidos a una membrana de nitrocelulosa para el análisis occidentales. La transferencia se sondeó con el anticuerpo anti-HIF-1α (Santa Cruz). Los anticuerpos primarios fueron en dilución 1: 1000, y anticuerpo secundario a 1:. 10.000
mamíferos 2 híbridos de ensayo
ERβ2 se clonó en el plásmido que expresa Gal4DBD PM2 en marco con el dominio Gal4DBD usando BamHI y los sitios de restricción HindIII-PM2 hacer ERβ2. El plásmido pVP16 (Clontech) se usó para clonar el HIF-1α N-terminal (aminoácidos 1-401), el dominio de desestabilización de oxígeno (aminoácidos 401-603) y el dominio C-terminal (aminoácidos 603-826) en el marco de con el dominio de activación VP16 usando sitios de restricción BamHI y PstI. Para los ensayos de interacción en células PC3 la Gal4 informador sensible FR-LUC 300 ng, PM2-ERβ2 500 ng y VP16 fusionan dominios HIF-1α 200 ng se transfectaron usando el método de transfección PEI como se describe por Longo et al. [29]
microarrays y la bioinformática análisis
El bicolor análisis de microarrays comparado incluye el transcriptoma totalmente conocida codificación de la proteína de 39.600 transcripciones y variantes utilizando matrices OpArray humano adquiridos a partir de microarrays Inc. ( Huntsville, AL). La matriz se complementó con 133 oligonucleótidos sintetizados específicamente para el análisis detallado y riguroso de los receptores nucleares, variantes de corte y empalme, y coregulators. El análisis de microarrays se realizó esencialmente como en Richter
et al
. [30]. Para cada síntesis de ADNc, se utilizaron 20 g de ARN total y cada comparación se replicó y teñir a intercambiar. Los análisis bioinformáticos se realizaron utilizando GenePix, R, y el software Pathway Studio (Elsevier, Filadelfia, PA). Genes expresados diferencialmente se definieron mediante un p-valor de corte de p = 0,005 en combinación con un valor M (log2 del cambio de tapa) de corte de +/- 0,3. análisis de enriquecimiento de ontología de genes (GO) de los procesos biológicos se realizó con la prueba exacta de Fisher utilizando conjuntos de genes del software. Pathway imágenes fueron diseñados en Pathway Studio. microarrays de datos está disponible en Gene Expression Omnibus del NCBI bajo el número de GSE35095.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
PC3 Sub-confluentes y las células 22Rv1 (90%) fueron cultivadas en una placa de 150 mm y se lavaron dos veces con PBS frío y luego se fija en PFA (1%) durante 10 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS frío inhibidor de la proteasa +, rasparon con 150 l de tampón de resuspensión, y se centrifugaron (4000 rpm, 10 minutos). Los sedimentos se resuspendieron en 750 l de tampón de lisis ChIP (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, Triton 1%, inhibidor de la proteasa) y las células se mantuvieron en hielo durante 30 minutos. Los lisados celulares se sometieron a ultrasonidos (60 pulsos, 30 segundos cada una) con 30 segundos romper a 4 ° C. Después de la sonicación, se recogieron 25 muestras mu l y se almacenaron a -20 ° C (entrada). El resto de la fracción de lisado de células 125 l se utilizó para los siguientes pasos. Las muestras fueron pre-absorbido en 20 l de proteína G acoplada FLAG etiquetados perlas magnéticas a 4 ° C durante 2 horas y el sobrenadante recogido. Las muestras se dividieron en dos fracciones y anticuerpos contra FLAG (2,5 mg) o IgG (2,5 g) se añadieron y se incubaron durante la noche. El día siguiente, las perlas se lavaron tres veces con tampón de ChIP lisis, una vez con tampón de alta concentración de sal de lavado ChIP (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, Triton 1%), y finalmente una vez con tampón de lavado ChIP (Tris 10 mM, LiCl 250 mM, NP40 0,5%, EDTA 0,1 mM). Las perlas se volvieron a suspender en 40 l de tampón de elución (Tris 50 mM, SDS 1%, EDTA 10 mM) y se incubaron a 65 ° C durante la noche con un pequeño agujero en la tapa. La entrada recogido previamente también se colocó a 65 ° C. El día siguiente, las muestras se purificaron usando el kit de purificación de PCR (Qiagen) y se utiliza para el análisis de qPCR utilizando los siguientes cebadores. promotor Phre-TWIST1 (F) 5'-CGGGGGAGGGGGACTGGAAAGC-3 '; (R) 5 'AGGCCTCCTGGAAACGGTGCCG-3', el promotor de VEGF: (F) 5'-ACAGACGTTCCTTAGTGCTGG-3 '; (R) 5'-AGCTGAGAACGGGAAGCTGTG-3 '.
Estadísticas
Los valores se expresan como la media, con intervalos de confianza del 95%. Una de dos colas no apareada
t-test
se utilizó para comparar las diferencias entre los dos grupos. El significado se presenta como *
p Restaurant & lt; 0,05, ** p
Restaurant & lt; 0,005 y *** p
Restaurant & lt; 0,001, y no significativas diferencias se presentan como NS.
resultados
microarrays y el análisis bioinformático de las células del cáncer de próstata que expresan ERβ2 muestran incremento en la expresión de genes implicados en la respuesta hipóxica
Hemos demostrado previamente que aumentó ERβ2 expresión de genes EMT asociado TWIST1 y Slug (SNAI2) en células de cáncer de próstata [15]. A continuación, se realizó un estudio transcriptómica para explorar los efectos de ERβ2 de una manera imparcial. Se han comparado las células PC3 que expresan de forma estable ERβ2 con las células de control, y encontramos 585 genes que pueden modificar significativamente el uso de nuestra corte definido. Curiosamente, TGFB2, que se sabe que está estimulada por HIF-1α, fue uno de los genes más altamente upregulated (casi 9 veces, de acuerdo con microarray). El análisis de enriquecimiento de genes ontología categorías entre los genes regulados, '
respuesta a la hipoxia de búsqueda:' fue la segunda función más excesivamente representados (p = 8.0e-6), sólo superada por 'la expresión génica "(Tabla 1). El '
respuesta a la hipoxia de búsqueda:' grupo incluye 17 genes regulados significativamente (TGFB2, EGLN1 (PHD2), EGLN3 (PHD3), Smad3, HSD11B2, CAT, CCL2, CDKN1B, MMP13, PLOD2, IL1B, Plau, SCNN1G , CRYAB, IL18, ITPR1, SOD2, ADM). Además, la sub-red enriquecido, que se define como los genes diana que son expresión del nodo respectivo, los vecinos de HIF-1α 'fue el más excesivamente representados (p = 1.5E-09) con 41 miembros reguladas (Tabla 2). Además, se encontraron muchos genes inducidos por ERβ2 estar involucrados en la angiogénesis (Tabla 2), que también fue un tema excesivamente representados (p & lt; 0,05). De estos genes, SOD2, SCNN1G, CD24, HIG2, IGF2 y TGF-β2 están estimulados por HIF-1α [26]. También '
proceso de metabolismo de la glucosa'
la que HIF-1α es conocido para regular, fue excesivamente representados (p & lt; 0,007), incluyendo 9 genes (PFKP, AKT1, IGF2, GOT2, PGM5, CRYAB, GBE1, UGP2, FABP5). Por lo tanto, el análisis de microarrays indica claramente la hipoxia y la función de HIF-1α como temas principales de la función ERβ2 (Ver Figura S1 para los genes validados).
Para validar estos datos, se analizó la expresión de HIF-1α en PC3 y otra célula del cáncer de próstata línea 22Rv1, que son a la vez que sobreexpresan ERβ2. Se observó un aumento en el nivel de proteína HIF-1α en ERβ2 expresar frente a las células de control, pero no hay cambios en el nivel de ARNm correspondiente (Fig 1A-1D). Esto está de acuerdo con nuestros resultados de microarrays, que no se detectan cambios en los niveles de transcripción HIF-1α, pero indican un cambio en las funciones de HIF-1α (basado en vías enriquecidos). Además, se confirmó aumento ERβ2-dependiente en los niveles de proteína HIF-1α ir acompañada de aumento ERβ2 dependiente de la actividad de HIF-1α. La actividad de luciferasa de un reportero impulsado por la hipoxia HIF-1α dependiente de genes 2 (HIG2 /HILPDA) promotor inducible (HIG2-A-luc) [26] se incrementó en presencia de vector de expresión ERβ2 transfectadas (Fig 2A-2C). En un estudio anterior, hemos demostrado que ERβ2-que expresan las células PC3 han aumentado el nivel de TWIST1 [15]. Aquí, se muestra que ERβ2 también aumentó la actividad de un informador de luciferasa dirigido por el promotor TWIST1 HIF-1α-dependiente en las células de cáncer de próstata LNCaP y que este efecto era dependiente de la elemento de respuesta a HIF-1α (Fig 3A-3C). Esto demuestra que la actividad de HIF-1α en general es mayor en células de la próstata que expresan ERβ2.
A. Western blot de extractos de mando y dos clones 22Rv1 y PC3 que expresan diferentes ERβ2 ensayó con anticuerpo HIF-1α. B. expresión de mRNA relativa de ERβ2 y HIF-1α en los ERβ2clones de la línea celular 22Rv1. El gráfico muestra los datos como factor de cambio en comparación con el control (media de tres experimentos separados (± E.E.M.) Calculado utilizando
t-test
, * p≤0.016 de Student). C. expresión relativa del mRNA de HIF-1α en el ERβ2#2 clon de la línea celular 22Rv1. El gráfico muestra los datos como factor de cambio en comparación con el control (media de tres experimentos separados (± SEM) calculados utilizando de Student
t-test
, ** p≤0.006).
A. esbozo esquemático del promotor HIG2 construcción en la que (X) representa la secuencia de elementos de respuesta a HIF-1α (HRE). B. El aumento de la cantidad transitoria transfectadas ERβ2 plásmido de expresión en células PC3 activa sucesivamente el promotor HIG2 transfectadas transitoriamente como se muestra por el ensayo de luciferasa de HIG2-A-LUC. El gráfico muestra los datos como un aumento de la luminiscencia de las células transfectadas con el aumento de la concentración de ERβ2 (media de tres experimentos separados (± E.E.M.) Calculado utilizando
t-test
, *** p≤0.0002 de Student). Comparación de las concentraciones de 0μg a 1000 g. C. La adición del plásmido de expresión de HIF-1α activa al promotor de HIG2 en líneas celulares PC3. El gráfico muestra los datos como un aumento de la luminiscencia de las células transfectadas con HIF-1α (media de tres experimentos separados (± SEM) calculados utilizando de Student
t-test
, p≤0.0001 ****).
A. Descripción de TWIST1 construcciones del promotor utilizado. B. Las células LNCaP transfectadas con el reportero TWIST1-promotor-luciferasa y la creciente concentración del plásmido de expresión ERβ2. El gráfico muestra los datos como un aumento de la luminiscencia de las células transfectadas con el aumento de la concentración de ERβ2 (media de tres experimentos separados (± E.E.M.) Calculado utilizando de Student
t-test
, ** p≤0.0034). C. La transfección de reportero TWIST1-promotor-luciferasa con (torcedura) o mutado elemento (mTwist) la respuesta de HIF-1α, junto con plásmidos de expresión para HIF-1α o ERβ2 en células LNCaP. El gráfico muestra los datos como un aumento de la luminiscencia de las células transfectadas con el aumento de la concentración de ERβ2 (media de tres experimentos separados (± SEM) calculados utilizando
t-test
, **** p≤0.0001 de Student,### p≤0.002).
ERβ2 interactúa directamente con HIF-1α causando la estabilización
Desde ERβ2 aumenta la expresión de la proteína HIF-1α, pero no ARNm, se especuló que HIF-1α la estabilización se produce a través de la interacción proteína-proteína entre ERβ2 y HIF-1α. Para probar esta hipótesis, se adjunta expresada en bacterias LBD de ER, ERβ y ERβ2 a un soporte sólido y se determinaron las interacciones con los
in vitro
traducida HIF-1α. HIF-1a une fuertemente a ERβ2, pero no a cantidades equivalentes de tipo salvaje ER o ERβ LBD. Esta interacción fue independiente de secuencias específicas ERβ2 porque truncamiento de aminoácidos codificados por el exón ERβ2 específica no eliminó la unión (ERβ2ΔCX) (Fig 4A) HIF-1α. Desplegable de RE biotina-etiquetados expresa en células PC3 reveló una interacción específica de HIF-1α transfectadas con ERβ2 y ERβ2ΔCX y única interacción con ERβ1 modesta (figura 4B). Desde ERβ5 tiene la misma secuencia de aminoácidos y se trunca en el mismo aminoácido que ERβ2, es decir, solamente los pequeños péptidos C-terminal difiere entre las dos variantes que decidimos probar esta variante e investigar su interacción con HIF-1α. Como se muestra en la figura 4B, ERβ5 interactúa fuertemente con HIF-1α.
A. Su-etiquetados LBD-ERβ2 tire hacia abajo con perlas de agarosa níquel de
in vitro
traducida HIF-1α en comparación con Su-etiquetados LBD-ER, Su-etiquetados LBD-ERβ1, Su-etiquetados LBD-ERβ2 y His- etiquetados ERβ2ΔCX TNT es carriles con lisado de reticulocitos acoplado solamente. B. Expresión de la ligasa de biotina BirA, HA-HIF-1α, y el receptor de N-terminal consenso biotina péptido fusionado construye B7TEV-ER, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2, B7TEV-ERβ5, y B7TEV-ERβΔCX en células PC3. Los extractos celulares se sometieron a continuación a telecine con perlas magnéticas de estreptavidina y las proteínas separadas por SDS-PAGE seguido de detección con anticuerpos HIF-1α.
No se requiere el dominio de la desestabilización de oxígeno (ODD) de HIF1α para la interacción con ERβ2 y ERβ5
para investigar, si se requiere el oxígeno desestabilizar dominio de HIF-1α para la interacción con ERβ2 se construyó un plásmido de expresión de HIF-1α con aminoácidos 401-603 eliminados como se describe anteriormente [31] . Después juntos co-immunoprecipitated este dominio elimina HIF-1α con ERβ2 biotinilado y ERβ5. Como puede verse en la figura 5A la HIF-1α con ODD suprimido (Δ401-603) interactúa tan fuertemente como la de tipo salvaje que indica que el dominio ODD es prescindible para la interacción. Para asignar la interacción adicional que utiliza mamíferos ensayo de doble híbrido en el que el N-terminal, dominio ODD y C-terminal de HIF-1α se fusionaron a VP16 y se transfectó en células PC3 junto con Gal4DBD fusionado ERβ2 y un reportero con Gal4 sitios de unión en delante de la luciferasa. Como puede verse en la figura 5B la interacción se produce preferiblemente con el N-terminal de HIF-1α.
A. células PC3 transfectadas con plásmidos que expresan GFP, HIF-1α, HIF-1α ΔODD, BirA (biotina ligasa), ERβ2 y ERβ5 con el consenso de biotinilación N-terminal. Complejos fueron derribadas con perlas magnéticas de estreptavidina. Derribado HIF-1α y HIF-1α ΔODD se detectó utilizando anticuerpo anti-HIF-1α. B. La transfección de 200 ng de FR-luciferasa solo, con 500 ng-PM2 ERβ2 y 300 ng de cualquiera de VP16-N-término HIF-1 (aminoácidos 1-401), VP16- ODD de HIF-1a (aminoácidos 401-603) o VP16-C plazo HIF-1α (aminoácidos 603-826). Medición de la actividad de la luciferasa 24 h después de la transfección.
Es bien sabido que prolinas 405 y 564 de HIF-1α bajo normoxia son hidroxilados por hidroxilasas prolina (PHD de) y luego reconocido por el factor de VHL y posteriormente destinada a la degradación [32]. Queríamos averiguar si la interacción ERβ2 y ERβ5 con HIF-1α es dependiente de la hidroxilación de estas prolinas por lo que la interacción podría incluso ocurrir durante condiciones de normoxia. En la figura 6, se demostró que el TE y P405 /P564-A /A mutados interactúan HIF-1α fuertemente con ERβ2 independientemente de destrucción de sitios de hidroxilación prolil lo que sugiere que la interacción se produce tanto durante la normoxia e hipoxia.
células PC3 transfectadas con GFP, HIF-1α, HIF-1α P405 /A-P564 /A, BirA (biotina ligasa), ERβ2 y ERβ5 con el consenso de biotinilación N-terminal. Complejos fueron derribadas con perlas magnéticas de estreptavidina.
ERβ2 es reclutado a elementos de respuesta de HIF-1a de la TWIST1 y promotores de VEGF
Por último, se exploró si ERβ2 puede unirse al HIF -1α elementos de respuesta utilizando el chip-qPCR. Hemos detectado un aumento de los niveles de ERβ2 reclutados en los elementos de respuesta a HIF-1α en los promotores de HIF-1α dependiente TWIST1 y VEGF, tanto en las células PC3 y 22Rv1. Sin embargo, ERβ2 no se une a los promotores del elemento de respuesta a estrógenos clásica en el gen PS2 (figura 7A y 7B).
En las células PC3 (A) y células 22Rv1 (B) que expresan la expresión ERβ2 doxiciclina regulado , esta isoforma se une a ERβ (elemento de respuesta a HIF-1α en promotor TWIST1) HRE y promotor VEGF (elemento de respuesta a HIF-1α en promotor VEGF), pero no a pS2 promotor (ERE). Resultados chip-qPCR se muestran con una IgG no específica y una inmunoprecipitación específica de anticuerpos anti-M2-FLAG. La unión ERβ2 se enriquece sólo en elemento de respuesta a HIF-1α contiene TWIST1 y promotores de VEGF, pero no en el promotor pS2 que carecen de elemento de respuesta a HIF-1α. El gráfico muestra los datos como un aumento en la unión de FLAG a la TWIST1 (Phre) y promotor de VEGF (media de tres experimentos separados (± SEM) calculados utilizando de Student
t-test
, p≤0.028 *,## p≤0.041 (células PC3) y ** p≤0.0049, ## p≤0.0481 (22Rv1 células).
En conclusión, nuestros resultados indican que ERβ2 se une y estabiliza HIF-1α y por otra parte, se co-reclutado a los elementos clave de HIF-1α en HIF-1a genes regulados aumentando de este modo la actividad de HIF-1α en condiciones de normoxia en las células del cáncer de próstata.
Discusión
Respuesta de la normalidad tejidos a la hipoxia es crucial para la vascularización adecuada y para el suministro de sangre posterior para oxigenar y proporcionar nutrientes al tejido. un tumor en crecimiento se convierte en hipóxica al llegar a más que 1 mm de tamaño [33]. la respuesta inmediata a la hipoxia es una disminución de la prolil-hidroxilación de HIF-1α lo que aumenta la estabilización de esta proteína. esto se debe a VHL, que induce ubiquitinylation y la posterior degradación de HIF-1α en condiciones de normoxia, no puede unirse a HIF-1α en ausencia de prolil-hidroxilación. La estabilización de HIF-1α permite la regulación de genes implicados en la angiogénesis, tales como VEGF, que es secretada por el tumor, que atrae a las células endoteliales mediante la unión a sus receptores de VEGF de la superficie, permitiendo así el aumento de la vascularización del tumor y el crecimiento. HIF-1α también aumenta la expresión de genes implicados en la glicólisis, para adaptar el tumor para sobrevivir en condiciones de bajo nivel de oxígeno [34], y los genes que participan en la invasión y la metástasis, tales como TWIST1 [25]
Expresión de ERβ2. se correlaciona con un peor pronóstico en el cáncer de próstata [14] y el cáncer de mama ER-negativos [35], pero las posibles acciones oncogénicas de ERβ2 no se entienden. Mostramos aquí que existe una fuerte correlación entre la expresión ERβ2 y el nivel de proteína HIF-1α, pero no el nivel de ARNm en el cáncer de próstata líneas celulares PC3 y 22Rv1. ERβ2 aumenta la actividad de los promotores dependientes de HIF-1α y es reclutado para los promotores TWIST1 y VEGF, probablemente por la inmovilización de HIF-1α. En conjunto, los hallazgos descritos anteriormente sugieren que HIF-1α media el efecto oncogénico de ERβ2 a través de una vía de señalización no clásica en la que ERβ2 se une a, y estabiliza HIF-1α en condiciones de normoxia. Esto está en consonancia con otros estudios que muestran que HIF-1α proteínas que interactúan estabilizar HIF-1α bloqueando su degradación [22-24].
Sorprendentemente, aunque nos pareció que ERβ1 no interactúa eficazmente con HIF-1α, correlacionar con su incapacidad para inducir genes de respuesta de HIF-1α, no se requiere la única último exón de ERβ2 para la unión HIF-1α. Al parecer, el truncamiento de la ERβ1 C-terminal expone una nueva superficie de la proteína que media la interacción con HIF-1α.
Queda por muestra si la expresión ERβ2 correlaciona con los niveles de Twist 1 u otros genes diana HIF-1α en clínica muestras. Un estudio reciente realizado por Ragnum et al. [36] muestra que la terapia de privación de andrógenos (ADT) provoca una reducción de expresión de muchos genes vinculados a la hipoxia. Proponemos que la expresión de ERβ2 o ERβ5 podría contrarrestar el efecto de ADT de genes de hipoxia-ligado en un tumor de próstata y por lo tanto causar resistencia a la castración que resulta en un resultado más pobre. De hecho, nuestros resultados de la estabilización no hipóxicas de HIF-1α sugieren que podría ser posible desarrollar una pequeña molécula que interfiere con la estabilización de HIF-1α inducida por ERβ5 ERβ2 y para uso en terapia de ciertas formas agresivas de cáncer de próstata. Un resumen de los hallazgos descritos se muestra en la figura 8.
Propuesta de modelo de cómo ERβ2 estabiliza HIF-1α y se reclutó a los promotores de VEGF y TWIST1.
En conclusión, la expresión de el ERβ variantes ERβ2 y ERβ5 previamente se ha demostrado que se correlaciona con el cáncer de próstata agresivo.