Extracto
SALL4 juega un papel importante en el desarrollo y la progresión de muchos tipos de cáncer. Sin embargo, el mecanismo molecular de papel y SALL4 en el cáncer de endometrio siendo difícil de alcanzar. En la presente investigación, hemos demostrado que la expresión de SALL4 se reguló en el cáncer de endometrio y positivamente correlacionado con el estadio tumoral, metástasis y baja supervivencia de los pacientes. La sobreexpresión de SALL4 promovió la invasión en las células de cáncer de endometrio, como se indica por la regulación al alza de marcador de células mesenquimales N-cadherina y regulación a la baja del marcador epitelial E-cadherina, y ensayos de invasión in vitro. Además, también hubo un aumento de la resistencia a los medicamentos en estos modelos celulares debido a la regulación al alza de casete de unión a ATP-expresión de múltiples fármacos transportador ABCB1. Por otra parte, también se encontró que ABCB1 era crítica para la resistencia de drogas inducida por SALL4. Por el contrario, desmontables restaurado sensibilidad a los fármacos SALL4, invertido EMT, la disminución de la metástasis de células y suprimieron la regulación a la baja de E-cadherina y la regulación al alza de N-cadherina y ABCB1. Por otra parte, hemos demostrado que SALL4 regula positivamente la expresión de c-myc y c-Myc era un objetivo directo de SALL4 por chip de ensayo, el agotamiento de c-Myc con siRNA abolió la regulación a la baja inducida por SALL4 de E-cadherina, la regulación positiva de N-cadherina y ABCB1 , lo que sugiere que el c-Myc era un blanco de abajo para SALL4 y se requiere para inducida por SALL4 EMT, la invasión y la resistencia a fármacos en células de cáncer de endometrio. Estos resultados indicaron que SALL4 podría inducir EMT y resistencia a los fármacos antineoplásicos por medio de la regulación de c-Myc. SALL4 y c-Myc pueden ser nuevas dianas terapéuticas para el cáncer de endometrio
Visto:. Liu L, Zhang J, Yang X, Fang C, Xu H, Xi X (2015) SALL4 como una transición epitelio-mesenquimal y Resistencia a las drogas inductor a través del Reglamento de c-Myc en el cáncer endometrial. PLoS ONE 10 (9): e0138515. doi: 10.1371 /journal.pone.0138515
Editor: Lu-Zhe Sun, Universidad de Texas Health Science Center, Estados Unidos |
Recibido: Abril 27, 2015; Aceptado: 30 Agosto 2015; Publicado: 25 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. Este proyecto fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF Nº 81172478). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio es el séptimo cáncer más común con cerca de 200.000 mujeres diagnosticadas cada año en todo el mundo [1]. En Europa, hay aproximadamente 9000 mujeres mueren de cáncer de endometrio cada año. diagnóstico y tratamiento precoz no tienen ningún efecto significativo sobre la mortalidad [2]. La cirugía, la quimioterapia y la radioterapia adyuvante son los principales métodos terapéuticos a carcinoma endometrial. Sin embargo, una minoría de pacientes son sensibles a estas terapias [3]. Por lo tanto, es imperativo encontrar nuevas dianas terapéuticas para elaborar los mecanismos moleculares de la carcinogénesis endometrial subyacente.
SALL4, un miembro de la familia de genes Sall, es un factor de transcripción. Es un factor esencial en el mantenimiento de la pluripotencia y auto-renovación de células madre embrionarias [4-6]. Las investigaciones anteriores han demostrado que SALL4 participó en la regulación de la proliferación de células madre hematopoyéticas [7, 8]. SALL4 se ha demostrado que participar en el mantenimiento de la quimiosensibilidad a través de la regulación de la droga transportador de casete de unión a ATP-(ABC) en la leucemia [8-10]. La expresión aberrante de SALL4 fue encontrado en muchos tipos de cáncer, incluyendo tumores de células germinales [11], cáncer de mama [12], carcinoma hepatocelular [13, 14], cáncer gástrico [15]. Sin embargo, el papel funcional y el mecanismo molecular de SALL4 no están bien caracterizadas en el cáncer de endometrio.
EMT es un proceso biológico fundamental en el que las células epiteliales se someten a una remodelación dramático del citoesqueleto, perder polaridad basal-apical y adquirir una aumento de la capacidad de hacer metástasis a órganos distantes [16-18]. la invasión del miometrio es uno de los más importantes factores pronósticos en el carcinoma de endometrio [19]. Sin embargo, la EMT ha sido mal entendido en el cáncer de endometrio en relación con otros tipos de cáncer [20].
La multirresistencia es un fenómeno común en casi todos los tipos de cáncer y un obstáculo importante para la quimioterapia con éxito [21]. Los principales mecanismos de resistencia a los medicamentos estaban estrechamente relacionados con los transportadores ABC múltiples fármacos activados. Los transportadores ABC múltiples fármacos tales como ABCB1, ABCC1 y ABCG2 se consideraron para ser responsable de la mayoría de eflujo de fármaco en el cáncer humano [21, 22]. Un aumento en la expresión de los transportadores ABC tenía algo que ver con un mal pronóstico en muchos tipos de cáncer. ABCB1, también llamado MDR1, fue uno de los primeros transportadores ABC para ser identificados. La alta expresión de ABCB1 se encontró en la mayoría de los tejidos de cáncer de endometrio [23]. Sin embargo, la función exacta de ABCB1 en el cáncer endometrial aún no se ha dilucidado.
c-Myc oncogén codifica un factor de transcripción básico conservado evolutivamente, y la expresión de c-Myc fue comúnmente aberrante en muchos tipos de cáncer [24, 25]. La sobreexpresión de c-Myc se ha encontrado para estar implicado en la diferenciación, la iniciación y progresión de cáncer de endometrio [26]. Muchos estudios han demostrado que la sobreexpresión de c-Myc estaba estrechamente relacionada con resistencia a la quimioterapia y el proceso de EMT. Por lo tanto, estamos interesados en determinar si c-Myc está implicado en la resistencia a la quimioterapia y la EMT en el cáncer de endometrio.
En la presente investigación, hemos demostrado que la expresión SALL4 se reguló y se asocia con una pobre supervivencia en el cáncer de endometrio. SALL4 en células de cáncer de endometrio no sólo induce la adquisición de propiedades de EMT, pero también promovió la migración y la invasión a través de la activación de c-Myc. Además, también encontramos que c-Myc sirvió como un gen diana directa de SALL4 y participó en la resistencia a las drogas inducida por SALL4 mediante la regulación de la expresión de ABCB1. En conclusión, estos resultados indican que SALL4 juega un papel importante en el cáncer de endometrio metástasis y las drogas resistencia, con c-Myc como un objetivo importante aguas abajo.
Materiales y Métodos
Pacientes y tejidos
80 muestras de cáncer de endometrio y 10 muestras endometriales normales se obtuvieron de pacientes que se sometieron a tratamiento quirúrgico 2010-2013 en el hospital Universidad Shanghai Jiao Tong de Shanghai afiliadas Primeros Popular (Shanghai, china). Otros seis pares de tejidos congelados nontumorous y tejidos de cáncer de endometrio adyacentes emparejados se obtuvieron de seis pacientes en el Hospital de Shanghai First People desde 2014 hasta 2015. Ningún paciente había recibido terapia neoadyuvante antes de la cirugía. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. El Comité Ético de Investigación Humana del Hospital Afiliado de Shanghai Jiao Tong University de Shanghai First People aprobó este estudio.
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de endometrio RL95-2, Ishikawa, HEC1-A, B-HEC1 , AN3CA y KLE se obtuvieron de la Academia de Ciencias de china Comité Type Culture Collection (Shanghai, china). Las células se cultivaron en DMEM añadido con suero bovino fetal 10%
Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se llevó a cabo en tejidos embebidos en parafina utilizando anticuerpos primarios como sigue:. Anti-SALL4 (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.). Para la evaluación de la expresión de SALL4, intensidad de la tinción se puntuó como 3 (fuerte), 2 (medio), 1 (débil), o 0 (negativo). El grado de tinción se anotó como 4 (76% -100%), 3 (51% -75%), 2 (26% -50%), 1 (1% -25%), o 0 (0%). La suma de la puntuación de extensión y la puntuación de la intensidad fue considerado como el resultado final de la tinción. Una tinción cuenta final ≥ 4 fue positiva para la expresión.
Desmontables de SALL4 en las células AN3CA
La línea celular de carcinoma de endometrio alta expresión SALL4 AN3CA se utilizó para establecer la SALL4 estables desmontables línea celular. SALL4-shRNA1 y SALL4-lentiviral plásmidos shRNA2 (GenePharma, Shanghai, China) se utilizaron para llevar a cabo el experimento de caída. AN3CA células infectadas con un shRNA revueltos eran respecto como control. eficiencia desmontables SALL4 fue confirmada por Western Blot. Las secuencias para shRNA revueltos y SALL4 shRNAs se enumeran de la siguiente manera: SALL4shRNA1: 5'GCCTTGAAACAAGCCAAGCTA3 '; SALL4shRNA2: 5'CTATTTAGCCAAAGGCAAA3'. Y Scr-shRNA: 5'CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG3 '
La transfección
El plásmido la construcción se realiza de acuerdo con procedimientos estándar. Para la clonación de SALL4A (GenBank adhesión no. AY172738) y SALL4B (GenBank adhesión no. AY170621) isoformas, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se diseñaron los cebadores. SALL4A y SALL4B cDNA en un vector de expresión se sintetizaron a partir GenePharma (Shanghai, China). Ishikawa células fueron transfectadas de forma estable con SALL4A o SALL4B. Las secuencias para c-Myc siRNA: Sentido: 5'-GGACUAUCCUGCUGCCAAGdTdT-3 ', antisentido: 3'-dTdT CCUGAUAGGACGACGGUUC-5'. Las secuencias para ABCB1 siRNA: Sentido: 5'-AGAGAAGAAACCAGUGGUC-3 ', antisentido: 5'-GACCACUGGUUUCUUCUCU-3'. De acuerdo con el protocolo del fabricante, siRNA fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Western blotting
Western Blot se realizó como se describió anteriormente [27]. En resumen, las proteínas se extrajeron a partir de células cultivadas y separadas por SDS-PAGE. Las proteínas de interés se determinaron utilizando anticuerpos específicos correspondientes después de la transferencia a membranas de PVDF. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el análisis: anticuerpo contra c-Myc (policlonal de conejo, Señalización Celular (Beverly, MA, EE.UU.); D84C12), SALL4 anti- (monoclonal de ratón, Santa Cruz Inc, SC-101147) y anti-ABCB1 ( monoclonal de ratón, Inc Santa Cruz, SC-55510). Anti-E-cadherina (policlonal de conejo, ab53226), anti-N-cadherina (policlonal de conejo, ab18203) y GAPDH (monoclonal de conejo, ab181603) se adquirieron forma Abcam (Cambridge, Reino Unido).
cuantitativa RT- PCR
de acuerdo con las instrucciones del fabricante, el ARN total se preparó usando TRIzol (Invitrogen) y transcripción inversa como se describe anteriormente [28]. Los cebadores para ABCB1, E-cadherina, N-cadherina, c-Myc y genes GAPDH se sintetizaron a partir Invitrogen Bioingeniería Corporation (Shanghai, China). QRT-PCR reacciones se establecieron con la plantilla de ADNc 2μl, 10μl SYBR Green PCR Master Mix y la mezcla de imprimación 1μl. Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 45 s.
inmunoprecipitación de la cromatina
de acuerdo con el protocolo del fabricante, el chip de ensayo se llevó a cabo mediante el uso del kit de chIP-IT (Active Motif). ADN Chromatinimmunoprecipitated se sometió a amplificación por PCR para el sitio de unión SALL4 en el promotor de c-Myc. cebadores específicos de c-myc son las siguientes: hacia adelante: 5'-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3 '; inversa: 5'-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3 '. El producto de PCR (c-Myc: 110bp). Se resolvió por electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio
viabilidad de las células de ensayo
una concentración diferente de carboplatino (0, 20, 40 y 60μg /ml) células tratadas en placas de 96 pocillos. se utilizó Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japón) para evaluar la viabilidad celular después de tratar con carboplatino para 24 h. La absorbancia se examinó a 450 nm mediante un lector de microplacas.
Colonia ensayo de formación de
Cerca del 10
3 células se sembraron en una placa de cultivo de seis pocillos. Las células se fijaron con solución de formaldehído al 10% y se tiñeron con Giemsa al 10% después de tratar con carboplatino 20 microgramos /ml a 37 ° C incubadora durante 10 días. El número de colonias que contienen & gt; 50 células se contó con un microscopio
cicatrización de heridas ensayo
Un cero se vio envuelta en la capa de células después de 24 h de incubación en una placa de 6 pocillos. . Las fotografías fueron tomadas a las 0 h y 48 h para medir la migración. Se examinó la distancia de la migración de las células.
ensayo de invasión celular
1 × 10
5 células fueron sembradas en la cámara superior de las placas Transwell de 24 pocillos (Corning, Nueva York, EE.UU.) recubierto con matriz de membrana basal Matrigel BD con medio libre de suero. DMEM /F12 suplementado con suero bovino fetal al 10% se añadió a la cámara inferior. Después de incubar durante 16 h, las células invasoras se contaron bajo un microscopio. Todas las muestras se sembraron por triplicado.
Los análisis estadísticos
Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar. La significación estadística se analizó mediante la prueba t de Student. prueba de chi cuadrado para tablas 2 × 2 se utilizó para comparar los datos categóricos. El valor de P & lt; 0,05 se consideró significativo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Resultados
La expresión de SALL4 está regulada positivamente y se asocian con una mala supervivencia en el cáncer de endometrio
Para identificar la función de SALL4 en el cáncer de endometrio, en primer lugar se evaluó la expresión de SALL4 en seis tejidos nontumorous frescos y combinados tejidos de cáncer de endometrio adyacentes. Como se muestra en la figura 1A, la expresión SALL4 en tejidos de cáncer de endometrio era significativamente más alta que en los tejidos no tumorosas (P & lt; 0,05). La expresión de SALL4 en 80 tejidos de cáncer de endometrio y 10 tejidos normales del endometrio se examinó mediante inmunohistoquímica. Se encontró que SALL4 fue mayor en el cáncer de endometrio (56/80) en comparación con los tejidos normales de endometrio (0/10) (Fig 1B, S1 Tabla). La diferencia fue estadísticamente significativa en los dos grupos (P & lt; 0,01). La asociación entre la expresión de SALL4 y las características clinicopatológicas se mostró en la Tabla 1. Hemos demostrado que un aumento de la expresión SALL4 en el cáncer de endometrio se asoció significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos (P = 0,048), el estadio tumoral (p = 0,001), la invasión del miometrio ( P = 0,007) y la supervivencia de los pobres (figura 1C). En conclusión, estos resultados indican que la expresión SALL4 en el cáncer de endometrio está estrechamente relacionada con la mala supervivencia de los pacientes.
(A) La expresión de SALL4 en tejidos de cáncer de endometrio y tejidos nontumorous se evaluó mediante Western Blot. (B) Las imágenes mostraron tinción inmunohistoquímica de SALL4 en tejidos de cáncer de endometrio y endometriales normales (00D7200). análisis (C) de Kaplan-Meier indicó que la expresión de SALL4 se asoció con una pobre supervivencia de los pacientes.
SALL4 induce la EMT y el fenotipo invasivo en las células de cáncer de endometrio
queríamos determinar si SALL4 participó en la EMT y la metástasis entre las células de cáncer de endometrio, se evaluó la expresión SALL4 para elegir líneas celulares adecuadas para nuestra investigación en líneas celulares de cáncer de endometrio: AN3CA, la demandante, HEC1-B, HEC1-a, RL-952 y Ishikawa. Como se muestra en la figura 2A, las células AN3CA y KLE mostraron fenotipo mesenquimal obvio, pero las células de Ishikawa y RL-952 mostraron características epiteliales aparentes (S1 FIG). La expresión de SALL4 se asoció con las características del epitelio /mesenquimales en estas líneas celulares de cáncer de endometrio. Células asociadas con características mesenquimales relativamente fuertes mostraron una expresión de alto SALL4. Dos shRNA específicamente dirigidos tanto SALL4A y SALL4B se utiliza para derribar SALL4 endógeno en células AN3CA con relativamente más alta expresión de SALL4. Desmontables de los niveles de proteína SALL4 en células AN3CA provocado un aumento de la proteína y los niveles de mRNA de la etiqueta epitelial E-cadherina y la disminución de la del marcador mesenquimal N-cadherina, que acompaña con células de transición morfológica de un aspecto mesenquimal en forma de huso dispersa a una ronda, morfología apretada (figura 2B, 2C y 2D). Además, desmontables de SALL4 (Fig 2E y 2F) en las células AN3CA atenúa la migración celular y la capacidad de invasión. Por el contrario, las células de Ishikawa con bajo nivel endógeno de SALL4 fueron transfectadas con SALL4A y el vector SALL4B ADNc (vector de control). La sobreexpresión SALL4 llevó a un cambio morfológico de una apretada, morfología redonda con una morfología dispersa en forma de huso en las células Ishikawa, disminuir los niveles de proteína y ARNm de la etiqueta epitelial E-cadherina y aumentar la del marcador mesenquimal N-cadherina (Figura 2B , 2C y 2D). La sobreexpresión de SALL4 aumentó drásticamente la migración y la invasión capacidad de las células de Ishikawa (Fig 2E y 2F). En resumen, estos datos sugieren que SALL4 induce la EMT y la metástasis en células de cáncer de endometrio
(A) N-cadherina, E-cadherina, SALL4A y SALL4B se evaluaron por transferencia de Western en líneas celulares de cáncer de endometrio:. AN3CA , la demandante, HEC1-B, HEC1-A, RL-952 e Ishikawa. morfología (B) de la célula fue examinado en Ishikawa células transfectadas con el vector SALL4A o SALL4B expresión y las células transfectadas con AN3CA SALL4-SH1 o SALL4-SH2. (C) (D) La proteína y los niveles de ARNm de E-cadherina y N-cadherina se analizaron en células de Ishikawa transfectadas con vector SALL4A o SALL4B expresión y las células transfectadas con AN3CA SALL4-SH1 o SALL4-SH2. (E) La migración celular y la invasión de Ishikawa o AN3CA fueron examinados a través de ensayo de la cicatrización de heridas y transwell ensayo de invasión. (F) El grado de migración y la invasión en las células de Ishikawa y AN3CA se analizó. * P & lt;. 0,01
unidades SALL4 resistencia a los medicamentos de quimioterapia en las células de cáncer de endometrio
La resistencia a fármacos es un obstáculo importante que afecta a la tasa de supervivencia general de los pacientes con cáncer de endometrio avanzado y recurrente. Hemos tratado de probar si SALL4 en células de cáncer de endometrio participó en la mediación de la resistencia celular a los fármacos quimioterapéuticos. Se puso de manifiesto por el ensayo de viabilidad celular que un aumento en la viabilidad celular tras la exposición a carboplatino fue mucho más pronunciada en las células Ishikawa transfectadas con cualquiera de SALL4A o SALL4B que en las células transfectadas con el vector vacío (Fig 3A). Mientras tanto, SALL4 sobreexpresión en el papel de la proliferación de las células se examinó mediante ensayo de formación de clon en células Ishikawa tratados con 20 microgramos carboplatino /ml. Ishikawa células transfectadas con SALL4A o SALL4B muestran una mayor resistencia carboplatino y la proliferación celular en comparación con el control (Figura 3B). Por el contrario, el ensayo de viabilidad celular y ensayo de formación de clon indicaron que desmontables de SALL4 redujo significativamente la resistencia al carboplatino en células AN3CA (Fig 3A y 3B). En resumen, estos resultados indican que SALL4 induce resistencia a fármacos en células de cáncer de endometrio.
células (A) Ishikawa transfectadas con células SALL4A o vector de expresión SALL4B y AN3CA transfectadas con SALL4-SH1 o SALL4-SH2 fueron tratados con el se realizaron concentraciones indicadas de carboplatino, y ensayo de viabilidad celular. células (B) Ishikawa transfectadas con el vector SALL4A o SALL4B expresión y las células transfectadas con AN3CA SALL4-SH1 o SALL4-SH2 fueron tratados con carboplatino, se realizaron análisis de formación de clon. ** P & lt; 0,01, * P & lt;. 0,05
ABCB1 es crítica para la resistencia a las drogas inducida por SALL4
La mayoría de resistencia a los fármacos en el cáncer humano están asociados con ATP-binding cassette (ABC) los transportistas a múltiples fármacos. No está claro si ABCB1 está involucrado con resistencia a la quimioterapia SALL4 inducida y un gen diana aguas abajo directamente regulada por SALL4 en el cáncer de endometrio. Se puso de manifiesto a través de Western Blot que SALL4 upregulation en SALL4A- o células Ishikawa SALL4B transfectadas aumentó significativamente la expresión de la proteína de ABCB1 en comparación con el vector vacío (Fig 4A). Un experimento SALL4 caída similar se llevó a efecto en las células AN3CA. Como se muestra en la figura 4A, el silenciamiento SALL4 podría parecer disminuir la expresión de la proteína ABCB1. Estos datos indicaron que SALL4 podría regular positivamente la expresión de ABCB1. Debido ABCB1 (MDR1) era esencial para la resistencia a los medicamentos y upregulated en el cáncer de endometrio, quisimos determinar si ABCB1 estuvo implicado en la resistencia a fármacos inducida por SALL4. Nos expresión de ABCB1 más silenciados por siRNA en células que sobreexpresan Ishikawa SALL4, y encontramos que la regulación negativa de ABCB1 reduce la resistencia a fármacos inducida por SALL4 (Figura 4B y 4C). La regulación a la baja de los niveles de ARNm y proteínas de ABCB1 se confirmó mediante qRT-PCR y Western Blot (Figura 4D y 4E). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que SALL4 induce resistencia a fármaco quimioterapéutico a través de la regulación de ABCB1 en células de cáncer de endometrio.
(A) Western Blot mostró que la sobreexpresión ectópica de SALL4 regula positivamente la expresión de proteínas en células de Ishikawa ABCB1 y desmontables de SALL4 AN3CA en células regulados a la baja expresión de ABCB1. (B) (C) células de Ishikawa transfectadas con SALL4A o vector SALL4B o vector de control fueron transfectadas con si-ABCB1 o ARNsi de control. sensibilidad a los fármacos de las células Ishikawa a carboplatino se examinó mediante ensayo de viabilidad celular y ensayo de formación de clon. (D) (E) La proteína y los niveles de ARNm de ABCB1 se evaluaron mediante transferencia Western y QRT-PCR. ** P & lt;. 0,01
c-Myc se requiere para la resistencia inducida por SALL4 EMT y drogas
c-Myc juega un papel importante en muchos procesos oncogénicos, incluyendo resistencia a los medicamentos tumor y metástasis. La investigación anterior ha demostrado que SALL4 en células de cáncer de endometrio promovido la actividad transcripcional de c-Myc [29]. Estábamos interesados en determinar si se requiere c-Myc para EMT inducida por SALL4 y resistencia a la quimioterapia. En consonancia con el estudio anterior, hemos demostrado que la expresión de c-Myc se correlacionó positivamente con la de SALL4 por el Western Blot, y c-Myc fue un objetivo directo de SALL4 través de chip de ensayo en células de cáncer de endometrio (Figura 5A, 5B y S2 Higo). A continuación silenciado la expresión de c-Myc de siRNA en SALL4A- y Ishikawa células transfectadas con SALL4B, y demostramos que c-Myc regulación a la baja reduce dramáticamente la invasión de células SALL4 inducida y la resistencia a los medicamentos (figura 5C, 5D y 5E). Los niveles de proteína y de ARNm de c-Myc se detectaron por transferencia de Western y QRT-PCR (Fig 5F y 5G). Por otra parte, la inversión del fenotipo invasivo inducido por c-Myc silenciar en SALL4 sobreexpresión en células de Ishikawa se confirmó por regulación a la baja de mesenquimales marcador N-cadherina y la regulación positiva de epitelial marcador de E-cadherina por Western Blot y QRT-PCR (Fig 5F y 5H ). Al mismo tiempo, también se encontró que el tratamiento de c-Myc siRNA redujo significativamente el nivel de proteína ABCB1 SALL4 inducida (Figura 5F). Estos resultados indican que se requiere de c-Myc para EMT inducida por SALL4 y resistencia a la quimioterapia.
(A) La expresión de c-Myc se asoció positivamente con la de SALL4 en las células de Ishikawa y AN3CA mediante análisis de Western Blot. (B) c-Myc era un objetivo directo de SALL4 través de chip de ensayo. (C) La regulación por disminución de c-Myc por siRNA redujo inducida por la invasión SALL4 en Ishikawa células que sobreexpresan SALL4 por transwell ensayo. (D) (E) Regulación a la baja de c-Myc reduce la resistencia a las drogas inducida por SALL4 en Ishikawa células que sobreexpresan SALL4 través de ensayo de viabilidad y el ensayo de formación de clon. (F) La expresión de marcadores y ABCB1 relacionados con la EMT se evaluó mediante Western Blot en las células de Ishikawa. (G) (H) Los niveles de ARNm de c-Myc, E-cadherina y N-cadherina se detecta a través de QRT-PCR en las células de Ishikawa. ** P & lt;. 0,01
Discusión
Cada vez es más claro que las células tumorales agresivas muestran un plástico, fenotipo pluripotente similar al pluripotentes /estado de tallo como en las células embrionarias y células tumorales de tipo basal [30]. El vástago de la firma de la expresión génica de células como embrionario se ha demostrado que estar estrechamente relacionado con los tumores humanos agresivos pobremente diferenciados y ha sido considerada como un objetivo potencial para futuras terapias contra el cáncer [31]. SALL4 es un factor de transcripción que mantiene la pluripotencia y la auto-renovación de las células madre embrionarias y juega un papel importante en el desarrollo embrionario. Sin embargo, el mecanismo molecular de los roles funcionales y de SALL4 en el cáncer de endometrio no están bien caracterizados.
En el presente estudio, hemos demostrado que la expresión SALL4 se reguló en el cáncer de endometrio y positivamente correlacionado con mal pronóstico y las propiedades agresivas. Hemos demostrado que un aumento de la expresión de SALL4 promueve la metástasis al proceso de EMT, así como resistencia a la quimioterapia a través de la modulación de ABCB1 en células de cáncer de endometrio. Significativamente, se encontró que un objetivo corriente abajo de SALL4, c-Myc, era indispensable para EMT inducida por SALL4 y la expresión de ABCB1. Estos resultados revelaron que SALL4 y c-Myc podrían ser dianas terapéuticas prometedoras en cáncer de endometrio (Figura 6).
SALL4 expresión EMT y ABCB1 inducida, que posteriormente contribuyó a la invasión y la quimiorresistencia en células de cáncer de endometrio. ABCB1 era crítica para la quimio-resistencia inducida por SALL4. Además, SALL4 también regula positivamente la expresión de c-Myc, que se requiere para la EMT inducida por SALL4 y expresión de ABCB1. En resumen, EMT y resistencia a los medicamentos SALL4 inducida por la activación de c-Myc en el cáncer de endometrio.
SALL4 juega un papel importante en varios procesos asociados a tumores, incluyendo metástasis de las células y la resistencia a los medicamentos. La metástasis es no sólo la principal causa de muerte por cáncer, sino también las propiedades malignas de cáncer. Las células cancerosas que experimentan procesos de EMT adquirirán la capacidad de invasión y metástasis. La presente investigación mostró que SALL4 inducida proteínas relacionadas EMT-incluyendo una disminución de moléculas de adhesión celular E-cadherina y un aumento en el marcador mesenquimal N-cadherina. La expresión de E-cadherina y N-cadherina estaba estrechamente asociado con las células cancerosas capacidad invasiva y metastásica. Nuestros resultados fueron apoyados por los estudios previos que muestran que la expresión regulado por disminución de la E-cadherina se asoció significativamente con la invasión del miometrio y la supervivencia de los pacientes en el carcinoma de endometrio [32, 33]. Las investigaciones recientes han demostrado que SALL4 estuvo implicado en la metástasis y la progresión en el cáncer colorrectal [34]. Además, SALL4 sobreexpresión inducida EMT en células de cáncer gástrico, con una mayor expresión de TWIST1, N-cadherina y disminución de la expresión de E-cadherina [15]. Mientras tanto, se informó de que SALL4 suprimió la expresión del gen de la adhesión CDH1 (E-cadherina), y regulada positivamente la ZEB1 supresor CDH1 y se mantiene la dispersión celular en el cáncer de mama basal-como [35]. Esta evidencia sugiere que SALL4 podría inducir EMT y promover la invasión en una variedad de tumores. De acuerdo con un estudio previo [29], se encontró que la regulación positiva de SALL4 aumentó significativamente la migración de células de cáncer de endometrio y la invasión. Más importante aún, hemos demostrado que la sobreexpresión SALL4 fue capaz de inducir la EMT y promover la metástasis en células de cáncer de endometrio.
quimioterapéuticos es el tratamiento más eficaz para los pacientes con cáncer metastásico. Sin embargo, la resistencia a las drogas sigue siendo un serio impedimento para el éxito de la quimioterapia [21]. Entre los diversos mecanismos implicados en la resistencia a quimioterápicos, se pensaba que los transportadores ABC a estar estrechamente relacionado con la resistencia a fármacos. La evidencia creciente indica que los transportadores ABC desempeñaron un papel importante en la resistencia a la quimioterapia inducida por SALL4 en una variedad de cánceres. Por ejemplo, se informó recientemente que SALL4 estuvo implicado en la resistencia a quimioterápicos directamente mediante la regulación de la ABCA3 gen diana aguas abajo en la leucemia mieloide aguda [10]. Además, informes recientes han demostrado que SALL4 regula positivamente la expresión de ABCA3, que afecta a la sensibilidad al fármaco de quimioterapia en la leucemia mieloide crónica [36]. La sobreexpresión de SALL4 condujo a un aumento de la proliferación celular asociada con la expresión regulada por incremento de (ATP) unión a casete-G2 (ABCG2) en carcinomas hepatocelulares [13]. ABCB1 es el prototipo de esta superfamilia de genes, y su desregulación se ha asociado con la resistencia a fármacos en varios tipos de cáncer [21]. La evidencia ha demostrado que la expresión de ABCB1 fue anormal en el carcinoma de endometrio [23]. Estos resultados nos llevó a investigar si ABCB1 participó en la resistencia a la quimioterapia inducida por SALL4 en el carcinoma de endometrio. De acuerdo con el papel de la resistencia a los fármacos inducida por SALL4 a través de la modulación de los transportadores ABC en otros cánceres, se encontró que ABCB1 estuvo implicado en la resistencia a fármacos SALL4 inducida en el cáncer de endometrio. Regulación a la baja de ABCB1 bloqueó significativamente la resistencia a las drogas inducida por SALL4. Estos datos sugirieron que ABCB1 era un importante mediador entre la resistencia a fármacos SALL4 inducida en el cáncer de endometrio
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El estudio previo ha demostrado que la EMT inducida por c-Myc en las células epiteliales mamarias [37]. Además, c-Myc puede contribuir a la células de cáncer de fenotipo quimiorresistente través de la regulación genes transportadores ABC [38]. Se informó de que c-Myc combina con mecanismos epigenéticos regulados ABC transportador de genes de expresión en CML [39]. En el presente estudio, encontramos que c-Myc era un objetivo directo de SALL4 y necesaria para la EMT y la expresión de ABCB1 inducida por SALL4, dando lugar a metástasis y la resistencia a los fármacos en células de cáncer de endometrio. Se ha demostrado en estudios previos que el aumento de la expresión de c-Myc se asoció significativamente con la disminución de la supervivencia global en pacientes con carcinoma de endometrio [40, 41]. Además, también se informó de que la actividad transcripcional de c-Myc fue regulada directamente por SALL4 en células de cáncer de endometrio [29]. Nuestros datos estaban de acuerdo con la anterior estos resultados. Sin embargo, el presente estudio fue la falta de datos involucrados en la evaluación de la expresión de ABCB1 y c-Myc en muestras de cáncer de endometrio. Sería más convincente si los datos que el nivel de expresión de SALL4 se asoció positivamente con los de ABCB1 y c-Myc en un subconjunto de muestras de cáncer de endometrio se complementó. En resumen, c-Myc era esencial en la resistencia inducida por SALL4 EMT y de medicamentos y podría ser una diana terapéutica para el carcinoma de endometrio.
En conjunto, hemos demostrado que la expresión SALL4 se reguló en el cáncer de endometrio y positivamente correlacionado con un mal pronóstico y las propiedades agresivas. Identificamos que SALL4 no sólo induce EMT, sino que también aumenta la resistencia a fármacos a través de ABCB1 en células de cáncer de endometrio. Demostramos además que c-Myc era indispensable para la EMT inducida por SALL4 y resistencia a la quimioterapia. En conclusión, nuestro estudio proporciona un potencial de mecanismos moleculares relacionados con la resistencia inducida por SALL4 invasión y la quimioterapia en el cáncer de endometrio. SALL4 y c-Myc pueden ser nuevas dianas terapéuticas para el cáncer de endometrio.
Apoyo a la Información
S1 Fig. SALL4 induce EMT en células de cáncer de endometrio gratis (A) El nivel de ARNm de E-cadherina y N-cadherina se evaluó a través de QRT-PCR en líneas celulares de cáncer de endometrio:. AN3CA, la demandante, HEC1-B, HEC1-A, RL . -952 e Ishikawa
doi: 10.1371 /journal.pone.0138515.s001 gratis (TIF)
S2 Fig.