Extracto
Organotípicos, tridimensional modelos (3D) de cultivo de células de tipos de tumores epiteliales como el cáncer de próstata recapitular aspectos clave de la arquitectura y la histología de los cánceres sólidos. El análisis morfométrico de organoides 3D multicelulares es particularmente importante cuando los componentes adicionales, tales como la matriz extracelular y microambiente tumoral se incluyen en el modelo. La complejidad de este tipo de modelos hasta ahora ha limitado su aplicación con éxito. Hay una gran necesidad de herramientas automáticas, precisas y robustas de segmentación de imágenes para facilitar el análisis de tales modelos de cultivo celular 3D biológicamente relevantes. Se presenta un método de segmentación basado en campos aleatorios de Markov (MFR) e ilustramos nuestro método utilizando datos de imagen pila 3D a partir de un modelo 3D organotípicos de células de cáncer de próstata co-cultivadas con fibroblastos asociados al cáncer (CAF). La salida de segmentación 3D sugiere que estos tipos de células están en contacto físico entre sí dentro del modelo, lo que tiene importantes implicaciones para la biología del tumor. rendimiento de la segmentación se cuantifica usando etiquetas terreno la verdad y nos muestran cómo cada paso de nuestro método aumenta la precisión de la segmentación. Proporcionamos las etiquetas de la realidad del terreno, junto con los datos de la imagen y el código. El uso de datos de imagen independiente mostramos que nuestro método de segmentación es también de aplicación más general a otros tipos de microscopía celular y no sólo se limita a microscopia de fluorescencia
Visto:. Robinson S, Guyon L, Nevalainen J, Toriseva M, Åkerfelt M, M Nees (2015) Segmentación de datos de imagen de complejos modelos 3D organotípicos de cáncer de tejidos con campos Aleatorios de Markov. PLoS ONE 10 (12): e0143798. doi: 10.1371 /journal.pone.0143798
Editor: Olivier de Wever, Universidad de Gante, Bélgica
Recibido: 3 Julio, 2015; Aceptado: 10 de noviembre de 2015; Publicado: Diciembre 2, 2015
Derechos de Autor © 2015 Robinson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. VTT Oy es una organización no lucrativa, institución totalmente propiedad del gobierno de investigación que tiene éxito oficialmente a la anterior organización, fundada en 1942, anteriormente conocido como Valtion Teknillinen tutkimuskeskus o VTT (Centro Nacional de Investigación técnica de Finlandia). VTT Oy fue incorporada en 01/01/2015 y mantiene la estructura de una institución de investigación a gran escala. La investigación que se describe aquí es de carácter exclusivamente académico, no relacionado de alguna manera con los productos comerciales, servicios o investigación por contrato en curso con terceros realizadas en VTT Oy. Este trabajo fue apoyado por la Academia de Finlandia, conceder los números 284.619 (M A) y 267.326 (MN). SR es el beneficiario de un contrato tesis CEA-Industria y un contrato tesis VTT. VTT prestado apoyo en forma de salarios de los autores SR, MA, y MN, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. MT ha trabajado como un investigador externo afiliado a VTT a través del grupo de investigación (dirigido por el MN). Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección autores contribuciones
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia relacionadas con su afiliación con VTT. Esta afiliación no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Los procesos celulares ocurren naturalmente en tres dimensiones (3D) y células normalmente están embebidas en la matriz extracelular , que es un componente clave de la microambiente celular. En consecuencia, fisiológicamente modelos de cultivo celular relevantes se diseñan cada vez más en los formatos 3D incrustados en la matriz extracelular para capturar la biología similar a un tejido complejo más fielmente [1]. Un tumor sólido representa un tejido alterado y complejo con su propia homeostasis del tejido característico y microambiente tumoral circundante. plasticidad de las células del tumor y las propiedades importantes tales como la diferenciación frente a invasión de células tumorales están fuertemente influenciadas por el microambiente tumoral. Para recapitular las características de los tumores sólidos
in vitro
requiere ensayos basados en células que imitan al mismo tiempo la matriz extracelular y el microambiente tumoral, homeotípica y heterotıpica contactos célula-célula, y permiten la formación de las interacciones célula-matriz pertinentes. técnicas de cultivo celular Organotípicos 3D representan actualmente los
in vitro y modelos biológicamente más relevantes para la investigación de la diferenciación de cáncer epitelial, la polarización y la invasión [1-3]. Sin embargo, la falta de métodos de análisis de imágenes de microscopía adecuados ha limitado hasta ahora a la aplicación e interpretación de este tipo de modelos de éxito.
Además de las células cancerosas, las células del estroma diferentes representan el componente más crítico de la microambiente tumoral. fibroblastos asociados con el cáncer (CAF) son los más abundantes tipo de células del estroma en la mayoría de carcinomas y juegan un papel esencial en la progresión tumoral [4-6]. Por lo tanto, los CAF representan un importante objetivo para terapias contra el cáncer. La interacción entre las células tumorales y los CAF aún es poco conocido y modelos de cultivo celular más fiables y robustos que recapitular mejor la compleja histología de los
in vivo
tumores son necesarios para estudiar las interacciones tumor-estroma.
consideramos que los datos de imagen 3D pila multicanal desde un organotípicos 3D modelo de cultivo celular compleja de células tumorales del cáncer de próstata co-cultivadas con CAF. Nuestro modelo de cultivo celular y de formación de imágenes 3D protocolo relaciona con el nivel multicelular en el que los atributos generales de organoides tumorales y estructuras CAF son más críticos que la captura de células individuales o núcleos de las células. Adquirida con una distancia relativamente grande entre las imágenes en la pantalla, la resolución de los datos de imagen dentro de una imagen era hasta 20 veces la resolución de imagen en la pila.
tejidos de la próstata saludables se forman de acinos, que son grupos hueca de células que forman las unidades funcionales más pequeños de una glándula secretora. En el cáncer de próstata en etapa temprana estos acinos empiezan a llenarse de células premalignas o malignas para convertirse en esferoides sólidos. La forma y el tamaño de organoides multicelulares contiene información valiosa morfométricos [7] y nuestro interés radica en el tumor multicelulares y las estructuras de la CAF como objetos informativos distintos. la segmentación precisa tanto del tumor multicelulares y las estructuras de la CAF es el primer paso en la investigación y el formato de escala de estos tipos de células pueden formar contactos célula-célula directos. Por lo tanto, nuestro objetivo es producir una segmentación automática para ambos tipos de objetos sin asumir información de forma previa o en vista de las células individuales.
automatizada de visión por ordenador permite normalmente para una eficiencia mucho mayor y la objetividad que el análisis manual de humano [8]. La segmentación y la identificación de partes de la imagen que son de interés es el primer paso en muchas aplicaciones de visión por ordenador. métodos umbral simple forman la base de muchas metodologías típicas de segmentación [9]. plataformas de análisis de la imagen del freeware populares, tales como la célula de perfiles [10] y ImageJ /Fiji [11] proporcionan implementaciones prácticas de este tipo de metodologías de segmentación diseñados específicamente para los datos de microscopía celulares y permiten el análisis más allá de la segmentación en tuberías especializadas para determinados conjuntos de datos. Sin embargo, tales análisis se centra normalmente en los datos de microscopía de alta resolución en una sola célula o incluso los niveles subcelulares y también se centra fundamentalmente en dos culturas (2D) en monocapa de células dimensionales, aunque la visión volumen 3D y renderizado es posible en ImageJ. productos de software comercial que se centran en el análisis de imágenes de microscopía celular 3D como Imaris (Bitplane) y Volocity (PerkinElmer) están diseñados para su análisis muy detallado de imágenes de alta resolución a nivel de células individuales en los que puede ser tan poco como 0,5
μ
m entre las imágenes de la pila 3D. Las necesidades específicas de los datos de la imagen de nuestro modelo de cultivo celular compleja en 3D, siendo los datos de imagen de múltiples canales en 3D donde hay grandes distancias entre las imágenes de la pila 3D, requieren la manipulación en profundidad del método de segmentación que no está disponible dentro de estas plataformas.
Markov (MFR) que se utilizan para la visión artificial en muchas áreas diferentes y para una amplia gama de problemas [12]. Tales modelos son populares porque la estructura de Markov 'vecino' permite que las relaciones espaciales de los píxeles que deben tenerse en cuenta al mismo tiempo ser computacionalmente factible. Para los datos de imagen de microscopía celular, metodologías basadas MRF se han aplicado para el seguimiento de las células individuales [13, 14], la clasificación [15], la detección de movimiento [16], la restauración de imágenes y deconvolución [17, 18], y la identificación de la mitosis [19, 20]. MFR también se han utilizado ampliamente para la segmentación de imágenes en un amplio número de áreas, muchos (no-microscopía) aplicaciones [21] «imagen natural 'con. Para
in vivo
imágenes de microscopía celulares, MFR han sido utilizados para la segmentación en aplicaciones histológicas específicas [22, 23] y para la segmentación de características particulares, tales como los vasos sanguíneos [24]. Se han utilizado para
in vitro
imágenes de microscopía celulares en segmentar núcleos de las células individuales [25] incluyendo el uso de una forma específica núcleos antes [26, 27]. Un método basado MRF también se ha utilizado para la segmentación y la clasificación de las estructuras subcelulares en las células individuales [28].
Implementamos nuestro método de segmentación 3D basado en MFR y mostramos que realiza con precisión en los datos de imagen procedentes de complejo modelos 3D organotípicos de cáncer de próstata. Los puntos fuertes de nuestro método de segmentación se demuestran mediante el uso de diferentes pero estrechamente relacionados los datos de imagen experimental y cuantitativamente en comparación con otros métodos de segmentación utilizando etiquetas terreno la verdad. Se demuestra que nuestro método basado en MRF captura con precisión las características biológicamente relevantes, pero a menudo más delgados y más débiles, tales como estructuras complejas de la CAF y la distinción de tumor frente células del estroma en un entorno 3D. También mostramos que nuestro método de segmentación es más generalmente aplicable a otros tipos de datos de imagen de microscopía celular y no sólo se limita a microscopia de fluorescencia.
Materiales y métodos
datos de imagen de microscopía celular
Utilizamos datos de imágenes de microscopía confocal 3D pila de tres modelos de cultivo celular 3D organotípicos diferentes pero estrechamente relacionados, lo que nos referimos como "SI imagen de datos", los "datos de imagen en vivo" y el "datos de imagen FAK '. Los detalles completos de los protocolos experimentales y de imagen han sido publicados anteriormente [29] y se describe brevemente a continuación. Todas las pilas de imágenes en 3D, tanto de los datos de imagen en vivo si y fueron segmentados manualmente por los biólogos que realizan los experimentos. La segmentación manual fue realizada en Adobe Photoshop (Adobe Systems) y dio lugar a cada píxel de haber recibido una etiqueta planta verdad de cualquiera 'en las células tumorales enfoque' ', en los CAF de enfoque "o" fuera de foco /fondo'. Estas etiquetas terreno la verdad se utilizan en la validación de nuestro método de segmentación.
preparaciones de matriz extracelular disponibles comercialmente (factor de crecimiento reducido Matrigel con una concentración de solución madre de 8 mg /ml y el colágeno de tipo I con una culata 3 mg /ml) se compraron de BD Invitrogen y se utilizó para todos los experimentos de co-cultivo 3D. Se utilizó una dilución 25% o 50% de Matrigel y una mezcla 1: 1 de ambas preparaciones se utilizó rutinariamente (2-4 mg /ml de Matrigel, 1,5 mg /ml de colágeno). Tanto las células tumorales y estroma fueron sembradas como suspensiones de células individuales, con densidades iniciales de 700-1500 células /pocillo. Los co-cultivos 3D se prepararon utilizando un principio "sándwich", donde se sembraron todas las células del estroma incluyendo los componentes de la misma capa plana para facilitar la obtención de imágenes. Bajo estas premisas, la densidad de siembra inicial era de aproximadamente 1800 células /cm
2.
En el ajuste de co-cultivo SI 3D, LNCaP células de cáncer de próstata [30] fueron co-cultivadas con CAF PF179T aislar de una cáncer de próstata de los pacientes [31], a una relación de la siembra de células inicial de 1: 2 en la matriz extracelular. Después de 14 días de cultivo, las células se fijaron y se realizó la tinción de inmunofluorescencia indirecta. Se utilizó un anticuerpo específico para pan-queratina para la tinción específica de organoides tumorales, mientras que los CAF se tiñeron con un anticuerpo contra vimentina humana. CAF células finalmente se fusionaron en grandes estructuras multicelulares, que rodeaban característicamente la periferia de organoides tumorales.
En el entorno 3D co-cultivo vivo, se utilizaron variaciones de las mismas celdas que los datos de la imagen si se ha ajustado. En este experimento, las células tumorales LNCaP que expresan la proteína DsRed se co-cultivaron con CAF PF179T que expresan GFP. Las mismas condiciones experimentales, los extractos de la matriz extracelular y otros ajustes se utilizaron como anteriormente. La formación, crecimiento, diferenciación y morfogénesis de organoides tumorales, así como la formación de estructuras multicelulares de CAF individuales se controló durante un período de 14 días, después de lo cual se llevó a cabo formación de imágenes. El ajuste de co-cultivo FAK 3D era el mismo que el entorno en vivo con la adición de inhibidores de la quinasa de adhesión focal (FAK) Y11 y PF-573228 comprados a Tocris Bioscience. Las tres condiciones fueron: control de DMSO (0,01%), 5
μ M de concentración
Y11 y 5
μ M de concentración
PF-573228
digitales confocal
multicanal 3D. las imágenes fueron adquiridas en las células tumorales y los CAF se obtuvieron imágenes por separado. Ambos tipos de células se presentan a continuación en diferentes canales (falsas) de color: rojo para las células tumorales y verde para los CAF. Los datos en caso de imagen en directo y fueron adquiridas con un microscopio Zeiss Axiovert-200M, equipadas con una unidad de disco confocal de hilado-Yokogawa CSU22 utilizando un Zeiss Plan-Neofluar 20 × objetivo (apertura numérica 0,17). Los datos de imagen si consisten en 8 pilas de imágenes, mientras que los datos de imagen en vivo consisten en 12 pilas de imágenes. Cada imagen tiene dimensión 512 x 672 píxeles y el número de imágenes en un solo rangos pila de 9 a 22. Para todas las imágenes de los dos conjuntos de datos, un píxel ≈ 0,5
μ
m dentro de una imagen y la distancia entre las imágenes adyacentes en una pila es 10
μ
m. Los datos de imagen FAK fueron adquiridas con la misma configuración de microscopio utilizando un Zeiss Plan-Neofluar 5 × objetivo (apertura numérica 0,16) y se componen de 24 pilas de imágenes (8 para cada condición). Un píxel ≈ 2,5
μ m
dentro de una imagen y la distancia entre las imágenes adyacentes en una pila es de 40
μ
m. Cada imagen tiene dimensiones de 512 × 672 píxeles y el número de imágenes en una sola pila es de 18
Una, menor complejidad imagen 2D conjunto de datos independientes (BBBC003v1) previsto en la Colección de Referencia Amplio BioImage [32] también es utilizado para la validación de la segmentación. Los datos consisten en 15 imágenes individuales de embriones de ratón multicelulares, cada uno de los cuales es una imagen en escala de grises de 640 × 480 píxeles capturado con diferencial microscopía de contraste de interferencia y con una segmentación de la verdad básica de toda la estructura del embrión. Estamos, además, consideramos el rendimiento de segmentación con el contraste 'melanoma "fase 2D y datos de imagen' Tscratch '(BBBC019), también de la Colección de Referencia Amplio BioImage. Los datos de imagen del melanoma constan de 20 imágenes cada una con una dimensión de 1024 × 1280 píxeles, mientras que los datos de imagen Tscratch constan de 24 imágenes cada una con una dimensión de 1028 x 1384 píxeles. Ambos conjuntos de datos son de experimentos '' con la cicatrización de heridas segmentaciones terreno la verdad también se proporcionan.
método de segmentación
En el marco campo aleatorio de Markov (MRF), se da cada píxel de una imagen digital de una etiqueta de algún conjunto predefinido (clásicamente 'plano' y 'fondo' de la segmentación). Nos encontramos con el etiquetado que optimiza una función de energía correspondiente, de manera que la etiqueta de cada píxel corresponde al valor de píxel observado y de manera que hay un etiquetado "suave" a través de toda la imagen. Para cada píxel
i
en una imagen digital, vamos a
X
i
y
Z
ser las variables aleatorias para la etiqueta de píxel (no observada) y la intensidad de los píxeles (observado), respectivamente. Deje que la colección de variables aleatorias para todos los píxeles tienen la gráfica independencia condicional dada en la figura 1. A continuación, la colección de variables aleatorias es un MRF condicional con función de energía (1) para los píxeles
i
y pares adyacentes de píxeles correspondientes (
i
,
j
) con las etiquetas
l
y
k
, y donde
I
es la función indicadora, ( 2) guía empresas
Nos encontramos con las etiquetas energéticas mínimas (segmentación) guía
los potenciales unarios
u
i
;
l ¿Cuáles son determinados, que debe (3) donde
z
i
es el valor de píxel observado y π
l
es la densidad de probabilidad la función que corresponde a la etiqueta
l
. Los potenciales parejas
w
ij
;
lk
se definen como (4) donde
z
i Opiniones y
z
j ¿Cuáles son los valores de los píxeles observados,
λ
0,
λ
1 y
β ¿Cuáles son los parámetros que se establezcan, y dist (
i
,
j
) es la distancia entre los píxeles
i
y
j
. Tenga en cuenta que la distancia puede ser diferente para los píxeles vecinos dentro de una imagen en comparación con los píxeles vecinos entre las imágenes en función de la resolución de los datos de imagen en cada dimensión.
Los vértices y aristas de un condicional codificación gráfica independencia de la independencia condicional propiedades del correspondiente conjunto de variables aleatorias. En el gráfico MRF condicional (figura 1), cada arista corresponde ya sea a un unario (
X
i
,
Z
i
) o por parejas (
X
i
,
X
⋅) potencial en función de la energía correspondiente ecuación (1). La figura 1 muestra un 6-vecino condicional MRF (6 potenciales parejas para cada píxel), que utilizamos para nuestro método de segmentación 3D. Cada píxel tiene 4 vecinos dentro de una imagen y 2 vecinos entre las imágenes en 3D de la pila, con menos vecinos de píxeles en los bordes de la pila.
Los potenciales unarios y por parejas establecen la correspondencia y 'suavidad' de la etiquetado general pixel respectivamente. Los parámetros
λ
0,
λ
1 y
β
determinar la cantidad de influencia que los potenciales parejas tienen sobre los potenciales unarios en la minimización de la función de energía (1). La desventaja es que se requiere un etiquetado con regiones segmentadas 'suaves' contiguos (los píxeles vecinos tienen la misma etiqueta), pero también queremos preservar discontinuidades presentes en la imagen (S1 figura). La forma de los potenciales unarios y por pares es estándar para el problema de la segmentación MRF [33]. Los potenciales satisfacen la condición de sub-modularidad que garantiza la existencia de una solución de energía mínima en el caso de etiquetas binario y permite una aproximación a la solución de energía mínima en el caso de múltiples etiqueta [34].
para establecer los potenciales ecuación unarios (3) que requieren una función de densidad π
l
sobre los valores de los píxeles correspondientes a cada etiqueta
l
. El método estándar consiste en emplear un procedimiento de 'segmentación interactiva' y que el usuario manualmente regiones "semilla" de la imagen para cada etiqueta [33]. A continuación, las distribuciones empíricas de las regiones de semilla se usan para calcular los potenciales unarios. En lugar de la siembra manualmente la imagen, nos ajustamos un modelo de mezcla gaussiana univariante con tres componentes a la densidad de los valores de píxel observados en los canales rojo y verde separado. Las densidades utilizadas para las etiquetas de segmentación luego son medias, tablas de mezclas de los componentes univariados obtenidos en cada canal de color (Figura 2): perfil
Las etiquetas son tres:. '' En foco células tumorales con una mezcla de 'fuera de foco 'CAF y el "fondo" en la otra dimensión (rojo),' en el enfoque 'CAF con una mezcla de "fuera de foco" células tumorales y "fondo" en la otra dimensión (verde) y una mezcla de "fuera de foco" y 'fondo' en ambas dimensiones (línea de puntos).
Los parámetros
λ
0,
λ
1 y
β ¿Cuáles son encomendadas a partir de las distribuciones de los potenciales unarios para equilibrar el compromiso entre la correspondencia y suavidad en la salida de la segmentación. Aunque existen métodos para el aprendizaje de estos parámetros utilizando un conjunto de entrenamiento de datos de imágenes etiquetadas realidad del terreno, estos métodos son muy caros computacionalmente y por tanto no utilizan a menudo en la práctica [35]. Por otra parte, un etiquetado terreno la verdad rara vez está disponible en la mayoría de las aplicaciones. Para cada pila de imágenes que setandso que los potenciales unarios y pares comparten la misma gama. El valor de
β
se configura manualmente en una pila candidato de imágenes y el mismo valor se utiliza para todas las otras pilas de un mismo experimento.
Como tratamiento previo paso, se utiliza una filtro de entropía local, [9] para cuantificar la textura local (entropyfilt función incorporada en el MATLAB Image Processing Toolbox). El filtro de entropía local se aplica tanto a los canales rojo y verde separado. Las imágenes en escala de grises primas han bajado a tomar muestras de 8 bits de manera que cada píxel corresponde directamente con un valor de intensidad en el conjunto {0, 1, ..., 255}. Para cada pixel
i
, el valor filtrado entropía local de iswhere
p
j
es la proporción de píxeles en el barrio que tienen la misma intensidad de pixel
j
. La vecindad de cada píxel
i
es el cuadrado de 9 × 9 píxeles centrada en
i All Inclusive con el acolchado simétrica alrededor del borde de la imagen.
Nuestro método de segmentación 3D es se resume en los siguientes pasos (figura 3): Read
Proceso de la pila 3D de imágenes utilizando el filtro de entropía local en números rojos (células tumorales) y (CAF) canales verde separado, España
univariados Fit modelos de mezclas gaussianas a los valores filtrados de píxeles en números rojos (células tumorales) y verdes (CAF) canales por separado, España
Combinar las densidades de mezcla (figura 2) y calcular los potenciales unarios y por parejas, España
para el etiquetado energético mínimo.
la microscopía confocal se utiliza para modelos de imágenes en 3D co-cultivo resultante en una pila de imágenes en 3D. Nuestro método de segmentación 3D se aplica a la pila 3D de las imágenes resultantes de la producción segmentación 3D.
Hemos aplicado nuestro método de segmentación en MATLAB y utilizamos el
α
-Ampliación algoritmo para encontrar la etiquetado energético mínimo [34, 36, 37].
método de validación
No hay una única herramienta está disponible para llevar a cabo la segmentación requerida para cualquier conjunto de datos dado. Cada método tiene sus propias ventajas y desventajas y, a menudo se adapta a aplicaciones específicas, tales como el uso de información de la forma previa cuando la segmentación de las células individuales o núcleos de células [25 a 27]. Aunque existen muchos métodos de segmentación sofisticados, no tenemos conocimiento de cualquier que sería adecuado para aplicar a los datos de la imagen en 3D de pila de nuestro modelo de cultivo celular 3D compleja. Por lo tanto, a efectos comparativos, se utiliza una serie de métodos de segmentación estándar que pueden ser considerados 'construir' en nuestro enfoque de MRF:
intOtsu Usando el método de Otsu [38] para los canales de intensidad umbral de rojo y verde separado y la combinación de las etiquetas para que "célula tumoral" o "fondo '' CAF 'sobrescribe, o si un píxel está marcado tanto" célula tumoral "y" CAF "se asignó al azar a una de esas etiquetas.
Entotsu utilizando el método de Otsu al umbral de la entropía local, filtra canales rojo y verde por separado y combinar las etiquetas utilizando el mismo procedimiento que el anterior.
mezclas umbralización las imágenes filtradas utilizando entropía local de las densidades de la mezcla de dos variables (figura 2).
MRF el método presentado en este documento.
método de Otsu encuentra el umbral global que maximiza la varianza entre clases de los grupos resultantes y es una técnica ampliamente utilizada para una imagen en escala de grises de base de segmentación [ ,,,0],9]. modelos de mezcla son a su vez también se usa ampliamente para muchas aplicaciones de segmentación de imágenes [39]. Dado que las mezclas de dos variables se utilizan para calcular los potenciales unarios en nuestro método de segmentación basado MRF, el método de las «mezclas» es equivalente al método de MRF presentado en este documento con
λ
0 =
λ
1 = 0.
la salida de los cuatro métodos de segmentación se compara con las etiquetas de terreno la verdad mediante la macro global F
1-score, la media armónica de la precisión de clasificación y recordar [40]. Por lo tanto F
1-score = 1 para un etiquetado perfecto. Los datos de imagen IF y vivo, así como los datos de imagen embrión de ratón independientes se utilizan para la validación.
Resultados y Discusión
Se presenta una serie de resultados con el fin de discutir los beneficios de nuestra MRF método basado para nuestra aplicación biológica particularmente complejo, en particular, de varios canales de datos, la imagen 3D con grandes distancias entre imágenes en la pila. Uso de la salida de segmentación 3D, es posible investigar si las células tumorales y los CAF se están formando los contactos célula-célula o se separan físicamente en nuestro modelo 3D co-cultivo, lo que tiene importantes implicaciones para la biología del tumor. además, se muestra la utilidad del filtro de entropía local y que nuestro enfoque basado en MRF obtiene los resultados de segmentación más precisa. El código para nuestro método de segmentación, los datos de imagen y las etiquetas de terreno la verdad son proporcionados como material complementario (S1, S2 y S3 Archivos).
Segmentación de salida sugiere el contacto físico del tumor multicelular y estructuras CAF
La salida de nuestro método de segmentación 3D se puede utilizar para investigar si organoides tumorales multicelulares y estructuras CAF están en contacto directo.
Usando microscopía confocal para los resultados del cultivo de células de imagen 3D en una pila 3D de imágenes correspondientes a una serie de planos focales en paralelo. Una proyección de intensidad máxima se puede obtener mediante la proyección de los valores máximos de intensidad de los píxeles en el plano (
x
,
y
). Aunque una gran cantidad de información puede perderse, el análisis de imágenes 2D prospectivo es mucho más desarrollados y menos costoso computacionalmente que considerar toda la pila de imágenes en 3D. Por estas razones, los marcos de análisis de imágenes actuales de los modelos de cultivo de células de cáncer de próstata en 3D se basan en proyecciones de intensidad máxima [41, 42]. Aunque proyecciones de máxima intensidad pueden ser adecuados para analizar los modelos de monocultivos para ciertas aplicaciones, no son apropiados para los modelos organotípicos más complejas, tales como modelos de co-cultivo. Puesto que toda la información estructural se proyecta en el (
x
,
y
) avión, no sería posible determinar si organoides tumorales y CAF están en contacto directo o físicamente separados utilizando un análisis 2D .
Fig 4 (a) muestra la proyección de intensidad máxima de ambos los canales rojo y verde (color falso) para una pila ejemplo 3D. Aún no está claro si el tumor central y las estructuras de la CAF están directamente en contacto. Las estructuras CAF parecen estar situado dentro de la estructura del tumor (flecha azul), que es biológicamente irrelevante. En muestras de tumores clínicos, los fibroblastos no se encuentran normalmente dentro de organoides tumorales, pero característicamente sólo agregados (tumorales) envolvente epiteliales. Sólo de vez en cuando, los CAF pueden entrar en contacto con las células tumorales en la superficie de las estructuras tumorales
.
(a) proyección de intensidad máxima de una pila 3D representativa. (B) - (d) Los diferentes puntos de vista sobre la correspondiente salida de segmentación 3D usando nuestro método basado en MRF. La flecha azul indica donde las CAF parecen estar dentro del tumor organoid en la proyección de intensidad máxima, pero se puede ver que estar fuera de la salida de la segmentación 3D. Ver S1 Video en un video de la salida de la segmentación 3D.
La segmentación 3D de las células tumorales (rojo) y CAF (verde) se ilustra en la figura 4 (b) y 4 (d). La salida de la segmentación destaca específicamente las regiones segmentadas correspondientes a las estructuras de CAF que están en contacto directo con las regiones segmentadas correspondientes a la estructura de tumor multicelular. En particular, los CAF que parecían estar ubicados dentro de la estructura del tumor en la proyección de intensidad máxima (Fig 4 (a)) puede ahora ser visto como fuera de, pero en contacto con ambos lados de la tumor central de organoide (flecha azul). S1 Video proporciona puntos de vista adicionales sobre la segmentación 3D.
El 3D representa la salida de la segmentación (figura 4 (b) y 4 (d)) parece más bien 'bloques', especialmente en
z donde el
organoid tumor tiene una "parte superior plana '. Esta es una característica de los datos de imagen y se debe a la escasez relativa de los datos en
z
. No sería apropiado para extrapolar la prestación de manera que los organoides tumorales se parecen más a '' esferoides redondos en 3D ya que esto podría confundir información estructural importante y no estaría apoyado por la resolución de los datos de imagen.
es posible identificar manualmente si y que dividen en segmentos regiones CAF están en contacto directo con los organoides tumorales segmentados con la visualización proporcionada de nuestra producción segmentación 3D. Con el fin de demostrar una prueba de concepto de cuantificar automáticamente contacto tumor de estroma con la salida de la segmentación, se consideran los datos de imagen FAK (S2 FIG). Con nuestra segmentación de MRF, consideramos que el contacto entre las células tumorales '' y las regiones segmentadas 'CAF' dará una estimación del contacto del tumor de estroma en el modelo.
La figura 5 muestra gráficos de dispersión de volumen total , superficie total y el contacto total para las células tumorales '' segmentados y regiones '' CAF en los datos de imagen FAK. El volumen total es el número total de píxeles marcados, superficie total es el número total de píxeles marcados adyacente a un pixel con otra etiqueta y de contacto total es el número total de células tumorales '' etiquetados y los píxeles 'CAF' que son adyacentes. El volumen total y el área superficial total de ambos los organoides tumorales y estructuras CAF son generalmente más pequeñas en la inhibición de FAK (Fig 5 (a) y 5 (b)) y este se ajusta a los estudios previos [29]. control de DMSO muestra una línea de base de contacto tumor-estroma (Fig 5 (c)) y los inhibidores de la FAK interrumpen claramente este contacto. Con el Y11 inhibidor, parece que hay menos contacto en promedio, sin embargo, el contacto también es más variable. Hay dos pilas de imágenes que tienen mayor volumen total, área de superficie y el contacto, en particular, (indicado por asteriscos azules en S2 Fig). Está claro que PF-573228 inhibe el crecimiento organoide tumor (Fig 5 (a) y 5 (b)) y por lo tanto hay pocos contactos físicos entre los dos tipos de células (Fig 5 (c)). Una prueba de Kruskal-Wallis se realizó en total contacto (figura 5 (c)) y la hipótesis nula de que las diferentes muestras son todas las realizaciones de la misma distribución fue rechazado (p-valor = 2.6 × 10
-4). Correspondientes comparaciones por pares se realizaron utilizando el Mann-Whitney
T
prueba.