Extracto
La adhesión de las células que producen metástasis de carcinoma de próstata se cuantificó por dos líneas celulares de carcinoma modelo LNCaP (nodo específico de linfa) y PC3 (médula ósea específica). Por microscopía de lapso de tiempo y la espectroscopia de fuerza que encontramos células PC3 a adherirse preferentemente a las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (línea celular SCP1). El uso de microscopía de fuerza atómica (AFM) espectroscopia de fuerza de base, el patrón mecánico de la adhesión a células SCP1 se caracteriza por las dos líneas celulares de cáncer de próstata y se compara con un sustrato que consiste en células PC3 I. Tipo de colágeno puro disipado más energía (27,6 AJ) durante los experimentos de AFM-des de adhesión forzadas y mostraron significativamente más adhesivo y enlaces más fuertes en comparación con las células LNCaP (20,1 aJ). Las firmas característicos de las huellas fuerza de separación revelaron que, en contraste con las células LNCaP, células PC3 parecen utilizar su filopodios además de establecer uniones adhesivas. Tomados en conjunto, nuestro estudio demuestra claramente que las células PC3 tienen una afinidad adhesivo superior a las células madre mesenquimales de la médula ósea, en comparación con LNCaP. PCR semi-cuantitativa en ambas líneas celulares de carcinoma de próstata reveló la expresión de dos receptores de la integrina de unión a Col-I, α1β1 y α2β1 en las células PC3, lo que sugiere su posible participación en la interacción específica de los sustratos. Una mayor comprensión de los mecanismos exactos detrás de este fenómeno podría conducir a aplicaciones terapéuticas dirigidas a optimizar el comportamiento metastásico de ciertas células de cáncer de próstata hacia el tejido óseo
Visto:. Sariisik E, D Docheva, Padula D, C Popov, Opfer J , Schieker M, et al. (2013) Sondeo de las Fuerzas de interacción de las células del cáncer de próstata con colágeno I y la médula ósea células madre derivadas del nivel de células individuales. PLoS ONE 8 (3): e57706. doi: 10.1371 /journal.pone.0057706
Editor: Daniel J. Muller, Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zurich, Suiza |
Recibido: 13 Agosto, 2012; Aceptado 28 de enero de 2013; Publicado: 5 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Sariisik et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación proporcionada por el Ministerio de Educación nacional de Turquía (http://egitek.meb.gov.tr), Iniciativa de Excelencia alemana a través de la "Iniciativa de nanosistemas Munich" (http://www.nano-initiative-munich.de/de/research es decir, áreas /) y la Fundación alemana de investigación (http://www.dfg.de/gefoerderte_projekte/informationssysteme/index.jsp). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los tumores malignos más comunes y una causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en Europa. Casi todos los pacientes con cáncer de próstata avanzado programa de la metástasis en los huesos, que a menudo es el único sitio detectable de la propagación del cáncer [1]. Además, el cáncer de próstata en el hueso se diagnostica frecuentemente antes de la detección de la enfermedad primaria y una vez que las células de cáncer de próstata son injertados en el esqueleto, terapia curativa ya no es posible y el tratamiento paliativo se convierte en la única opción [2]. Aunque los investigadores están empezando a comprender los mecanismos de crecimiento del cáncer en los huesos, los pasos iniciales de las interacciones célula tumoral-a-hueso que promueven la expansión del depósito metastásico no se entiende todavía completamente. Por lo tanto, existe una clara necesidad de dilucidar los factores que subyacen a la propagación del cáncer de próstata en particular al esqueleto.
Se ha sugerido que la metástasis del cáncer en el hueso es el resultado de una compleja interacción entre las células del cáncer de próstata con el proteínas de la matriz ósea y con los tipos de células que residen en el tejido óseo, tales como osteoblastos y osteoclastos [3] - [5]. Nosotros y otros han demostrado que la línea celular PC3 de cáncer de próstata, aislada de la médula ósea, tiene una adherencia significativamente mayor para el principal tipo colágeno de la proteína de hueso I (Col-I) de la línea celular de adenocarcinoma de próstata LNCaP que se deriva de un no óseo metastásico sitio [6], [7]. Estos resultados sugieren que la afinidad de Col-yo podría ser uno de los factores moleculares que contribuyen a la progresión de algunas células de cáncer de próstata en el hueso.
En cuanto a los factores celulares, aparte de osteoblastos y osteoclastos, otro intrigante participante que se ha informado recientemente es la población de células que residen en la médula ósea, denominada células madre mesenquimales (MSC). MSCs son los primeros progenitores de osteoblastos y que se puede expandir y diferenciar en células mesenquimatosas especializadas, tales como adipocitos, condrocitos, osteoblastos o in vitro [8] más. Cross et al., 2007, han sugerido que las MSC puede jugar un papel importante en el apoyo del crecimiento del cáncer de próstata y la supervivencia en el hueso [9].
Desde el establecimiento inicial de la expansión posterior en el hueso, la próstata las células cancerosas requieren capacidad invasiva. Nabha et al., 2008 encontró que las MSC estimuló la capacidad invasiva de las células PC3 a través de Col-I mediante la inducción de la secreción de la proteasa MMP-12 a partir de células PC3 [10]. Además, un artículo reciente demostró que los fibroblastos mesenquimales pueden conducir la invasión del cáncer colectiva por la remodelación de su matriz circundante, y por lo tanto la creación de espacio físico a través del cual las células cancerosas pueden simplemente seguir [11].
Estos datos sugieren ya específica diafonía entre las células de cáncer de próstata y MSC, pero aún no está claro si, y lo fuerte que estos dos tipos de células pueden interactuar y cuáles podrían ser los mecanismos detrás de esta interacción. moléculas específicas en la superficie celular pueden mediar interacciones celulares. Tales interacciones moleculares se han medido mecánicamente mediante el trazado de la fuerza requerida para separar pares receptor-ligando o las células que interactúan con pinzas ópticas, la sonda de fuerza biomembrana o microscopía de fuerza atómica [12] - [14]. Tales experimentos no sólo son capaces de medir los eventos moleculares de desprendimiento, sino también para sondear la incrustación mecánica y anclaje de las moléculas medidos en las células [15] - [17]. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue obtener nuevos conocimientos sobre las interacciones celulares de cáncer de próstata con las MSC, con énfasis en las fuerzas mecánicas que se producen en el nivel molecular. En particular, la cuantificación de las fuerzas adhesivas entre las células de cáncer de próstata y la proteína de la matriz Col-I parece ser esencial, ya que los estudios anteriores que investigaron la afinidad de las células de cáncer de próstata a varias proteínas de la matriz no determinaron su fuerza de interacción.
A medida que las células del cáncer de próstata, se utilizaron células PC3, que se han originado a partir de la metástasis ósea y el hueso como controles, las células LNCaP, que fueron aisladas de metástasis en los ganglios linfáticos. A medida que las células madre mesenquimales se utilizó una línea celular inmortalizada MSC llamado SCP1 [18], que posee las características típicas de MSC, como la auto-renovación y multipotencia y permite el análisis normalizado a largo plazo. En primer lugar, visualizamos la tasa de adhesión y la propagación de células de cáncer de próstata en monocapas de MSC por el tiempo transcurrido microscopía de fluorescencia en el nivel multicelular. Entonces, que caracteriza las fuerzas físicas reales que participan en contactos simples de célula a sustrato por microscopía de fuerza con un AFM: tanto las células cancerosas de próstata líneas se inmovilizaron sobre un voladizo de AFM y ponen en contacto con un sustrato revestido Col-I. Por último, se midió fuerzas de adhesión célula-célula entre las células de cáncer de próstata PC3 o LNCaP, unidos a un voladizo del AFM, y una célula madre mesenquimal monocapa (SCP1).
Materiales y Métodos
Cultivo de células para Time-lapse microscopía
PC3 (derivado de la metástasis ósea) y las células LNCaP (derivadas de la metástasis de los ganglios linfáticos) se obtuvieron a partir de ATCC (Wesel, Alemania). células PC3 se mantuvieron en medio de cultivo celular RPMI-1640 (PAA, Cölbe, Alemania) y 10% de FBS (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania). La línea celular SCP1 es una línea de células madre mesenquimales humanas inmortalizadas plenamente descrito en Böker et al. 2008 [18]. células LNCaP y SCP1 se cultivaron en MEM alfa GlutaMAX medios de cultivo (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) suplementado con 10% FBS. Durante el cultivo celular de rutina, todos los tipos de células se cultivaron hasta 80% de confluencia en T-25 o T-75 frascos de cultivo y se mantuvieron a 37 ° C en 5% CO humidificado
2. El medio de cultivo se cambió tres veces por semana y para los pases de células, las células fueron separadas por tratamiento con solución de tripsina /EDTA 1x (PAA). La preparación de las células antes de las mediciones de AFM se describe más abajo en el apartado de "captura de la célula".
Microscopía por lapsos de tiempo y cuantificación de Adhesión Celular
células Scp1 (10
6 células ) se cultivaron en placas de 6 pocillos a confluencia completa (como se muestra en la Fig. 1C). células PC3 y LNCaP fueron marcadas con el 10 M colorante fluorescente verde CFDA (diacetato de carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo, Invitrogen) y después se sembraron en las monocapas formadas Scp1 (5 × 10
5 células de cáncer /pocillo). Directamente después, imágenes de microscopía fueron recogidos con intervalos de 25 minutos durante al menos 12 horas. Durante este tiempo las células se mantuvieron en un bio-cámara, proporcionando estable 37 ° C y 5% CO2 humidificado atmósfera (Pecon, Erbach, Germnay), montados sobre un microscopio óptico invertido (Axiovert 100, Carl Zeiss Hallbergmoos, Alemania). Las imágenes fueron tomadas con una cámara CCD AxioCam MRm (Carl Zeiss) y mediante el uso de la herramienta manualmente contador de células del software Image J version1.40 (Instituto Nacional de Salud, EE.UU.) el número de células adherentes se calculó y se muestran como porcentaje de la entrada de la célula inicial a las 4 y 12 horas.
(a) de contraste de fases y microscopía de fluorescencia de PC3 marcado con CFDA y las células LNCaP chapada en monocapas Scp1 en placas de 6 pocillos. Las imágenes se toman después de 4 h. (B) Cuantificación de las células PC3 y LNCaP adherentes después del cultivo 4 y 12 h en monocapas SCP1. El porcentaje de células adherentes se cuantificó primero, por recuento manual de las células marcadas con CFDA con la herramienta de contador de células en el software Image J y segundo, mediante la comparación con el número inicial de células sembradas (5 × 10
5 células /pocillo ). En las imágenes también un ligero fondo de partículas de colorante CFDA es visible (más evidente en la imagen LNCaP). Los análisis revelaron que ya a las 4 h células PC3 totalmente adherida sobre SPC1 células mientras que las células LNCaP tuvieron una tasa significativamente más baja adherencia a las 4 h y 12 h. Las barras del gráfico muestran la media ± SD de cuatro experimentos independientes (p & lt; 0,0001, prueba t no pareada). células (C) de PC y LNCaP (2 × 10
5 células /pocillo) se cultivaron en monocapas Scp1 en placas de 6 pocillos durante un máximo de 8 días. imágenes de contraste de fases demostraron la formación y propagación de colonias PC3 (resumido) en la parte superior de las células SCP1 entre el día 1 y 8. En contraste, las células LNCaP formaron pequeños grupos de células (flechas) que no se expanden sino retrocedido por día 8. (D) La cuantificación de números de PC y de células LNCaP después de 1, 5 y 8 días de cultivo en monocapas SCP1. La proliferación de células PC3 y LNCaP se calculó restando las monocapas de control SCP1 a partir del recuento total de células de la co-cultivo. De manera similar a los datos de microscopía, el análisis cuantitativo confirmó que las células PC3 pero no LNCaP fueron capaces de dividirse y expandir en las células SCP1 más. El gráfico muestra media ± DE de tres experimentos independientes para cada punto de tiempo (p & lt; 0,0001, prueba t no pareada).
se formaron proliferación de células de análisis
monocapas Scp1 como se describió anteriormente y se añadieron células 2 x 10
5 PC3 y LNCaP y de izquierda a ampliar en SPC1 células durante un periodo de 8 días. Además, varios pocillos de cultivo se conservaron solamente con células Scp1 (
SCP1
mono
) con el fin de ser utilizados como controles para el análisis de cuantificación. Los co-cultivos (
PC3
+ SCP1, LNCaP
+ SCP1
) se monitorizaron al microscopio y fotografiadas con la cámara AxioCam MRm (Zeiss). En el día se trataron con tripsina 1, 5 y 8 los co-cultivos y mediante el uso de células Neubauer cámara de recuento, se estimó el número total de células. La proliferación de las células PC3 y LNCaP en SCP1 monocapa (
PC3
en mono
,
LNCaP
en mono
) se calculó de la siguiente manera:
inmunocitoquímica
Antes de la capa de proteína, portaobjetos de vidrio se limpiaron con etanol al 70% y luego en autoclave. Con el fin de verificar el tipo de colágeno I (Col-I) -coating de los portaobjetos de vidrio y la expresión de colágeno I en SCP1, toboganes y monocapas SCP1 se prepararon como sigue. células SCP1 se cultivaron en portaobjetos de vidrio durante dos días con el fin de formar monocapas de células confluentes, mientras Col-I - portaobjetos de vidrio recubiertos se prepararon mediante la adición de solución de 1 mg /ml Col-I a 4 ° C durante la noche. A continuación, las monocapas SCP1 y los portaobjetos recubiertos con Col-I se fijaron con acetona pura durante 20 min a -20 ° C, se enjuagaron con PBS. Image-iT FX señal Enhancer (un producto de Invitrogen para la reducción de fondo y la intensificación de la señal de Alexa Flour anticuerpos secundarios) se aplicó durante 30 min y se bloqueó con 10% de BSA durante 1 hora. Se aplicó el anti-colágeno-I anticuerpo monoclonal primario de ratón (Sigma) durante la noche a 4 ° C. Este paso fue seguido de la incubación con el anticuerpo anti-ratón secundario conjugado con Alexa Flour 488 durante 1 hora y la DAPI mancha nuclear durante 5 minutos. En paralelo, los controles negativos se llevaron a cabo omitiendo el anticuerpo primario. Las microfotografías fueron tomadas con una cámara Axiocam MRm en una Axioskope 2 microscopio (Carl Zeiss) con objetivo 40X.
Configuración AFM
Fuerza experimentos se llevaron a cabo utilizando espectroscopia de un NanoWizard II, junto con un módulo CellHesion ( JPK Aparatos, Berlín, Alemania), montado en un Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Göttingen, Alemania) con una unidad de temperatura por encargo de 37 ° C. Para reducir la influencia del ruido ambiental, el Axiovert se colocó en una mesa de aislamiento activo (Micro 60, Halcyonics, Göttingen, Alemania) contra las vibraciones y toda la configuración se colocó en una m
caja insonorizada 1 3 también estabilizar la temperatura de la todo el experimento.
Los sensores de fuerza utilizados para la espectroscopia de fuerza eran sin punta voladizos de nitruro de silicio con una constante elástica nominal de 0,01 N /m (sin punta, MLCT-O10, Veeco, EE.UU.). Estos sensores de fuerza con una baja constante del resorte resultaron ser los más adecuados para las mediciones de adhesión celular. En particular, la superficie plana sin punta proporciona un área de adhesión para una sola célula. Mediante el recubrimiento de esta superficie con adhesivos de células, tales como lectinas (e. G. Concavalina A) o polímeros cargados positivamente (por ejemplo polilisina) diversos tipos de células pueden ser firmemente y rápido unidos al sensor [16], [19], [20]. células de cáncer de próstata resultaron de adherirse de forma estable a la lisina electrostáticamente y, además, mantener su forma esférica a través de todo el proceso de medición en vez de la difusión como en superficies Col-I recubiertos. Antes de la celda experimentos de espectroscopia de adhesión, los sensores de fuerza, por tanto, fueron recubiertos con poli D-lisina (PDL, Millipore, EE.UU.) en una solución de 100 mg /ml PDL durante la noche. PDL se utilizó en lugar de PLL porque es menos degradable y las células no tienden a propagarse. Las constantes de resorte de los sensores de fuerza se determinaron individualmente por el método del ruido térmico [21].
curvas de fuerza-distancia se registraron mientras que el piezo recorrida en un circuito cerrado de hasta 20 micras, con una velocidad de aproximación de 7 micras /s hasta que se alcanzó una fuerza de disparo de 100pN, y una velocidad de retracción de 3 micras /s.
Preparativos sustrato
Hemos utilizado el colágeno de tipo I (Col-I) de vidrio recubierta cubrir los resbalones y las monocapas Scp1 como sustratos para los experimentos de espectroscopia de fuerza AFM dentro de la misma tapa de la placa de cultivo. Para formar monocapas SCP1, las células fueron cultivadas en SCP1 tapas de los recipientes de cultivo sin tratar (placa de Petri 35 × 10 mm, Nunc A /S, Roskilde, Dinamarca) durante dos días a 37 ° C, 5% de CO
2. Antes de su uso, se lavaron con y cubiertos por 1,5 ml fresco medio MEM-alfa libre de suero (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) suplementado con Hepes 15 mM (Sigma-Aldrich, Alemania) lo que resulta en un CO
2 mediciones independientes medio. Para células de Col-I cubreobjetos mediciones de vidrio (Ø 15 mm se lavaron en 70% de etanol y agua destilada) se recubrieron con Col-I (100 mg /ml) a 4 ° C durante la noche. Antes de las mediciones de adhesión celular, los cubreobjetos recubiertos con Col-I se colocaron en la parte superior de la monocapa SCP1 en las tapas de los recipientes de cultivo (como se representa en la Fig. 2B). Una cubierta de vidrio deslizante adicional recubierto con BSA (0,5% w /v) a 4 ° C durante la noche se colocó en la parte superior de la otra sección de la monocapa SCP1 y se utiliza para la captura de células (véase la sección siguiente). La tapa placa de cultivo, que contiene los tres tipos de sustratos (BSA, Col-I y SCP-1 monocapa) fue luego montada en una etapa de temperatura controlada en el AFM y se dejó equilibrar durante 10 min en el aire ambiente a 37 ° C.
(a) imágenes de contraste de fase de una célula de cáncer de próstata unido a la ménsula (flechas) por encima de un monocapa SCP1 (izquierda) y un portaobjetos recubierto de Col-I (derecha). Las barras de escala indican 10 micras. En las esquinas inferior izquierda imágenes de inmunofluorescencia se insertan. Col-I, marcado con colorante fluorescente AlexaFluor488 aparece en los núcleos celulares, verde y teñidas con DAPI en azul. (B) las células individuales a partir de dos líneas celulares de cáncer de próstata diferentes (PC3 y LNCaP) se inmoviliza a un sin punta AFM voladizo (sensor de fuerza) con el fin de estudiar sus fuerzas de interacción con la superficie apical de una monocapa SCP-1 (que representa células madre mesenquimales ) o con Col-I (que representa la matriz ósea). (C) vista desde arriba esquemática de la tapa de la placa de cultivo con una hoja de cubierta de vidrio recubierta con BSA (como sustrato para la pesca un inyecta suavemente las células del cáncer de próstata) y una cubierta de vidrio Col-I revestido se deslizan tanto en la parte superior de una monocapa de células madre mesenquimales . Para la calibración y la pesca una célula, el sensor de fuerza visita la diapositiva BSA, para el experimento sobre el colágeno Col-I deslice y para el experimento en las células mesenquimales de la monocapa SCP1.
Cultivo Celular y Celular de captura para Fuerza espectroscopia
las células LNCaP (o PC3) obtenidas a 80% de confluencia, se incubaron en solución de tripsina /EDTA (0,02%) durante 5 min a 10 min hasta que se libera del sustrato después de un lavado con PBS carente de calcio y magnesio . Este procedimiento debe quitar cualquier proteínas de la matriz, posiblemente, que cubren las superficies de las células sin afectar a los receptores de la integrina [22], [23]. A continuación, las células se transfirieron con medio adicional MEM-alfa en un tubo de centrífuga. Después las células se centrifugaron (1000 rpm, 3 min) antes de resuspender el sedimento con medio fresco MEM-alfa. Las células se dejaron en una incubadora a 37 ° C durante 15 min., Con el fin de adaptarlos a la temperatura de medición de 37 ° C en el AFM.
Cualquiera de las células LNCaP (PC3 o aprox. 2 μ
l
que contiene 100 a 300 células) se inyecta con suavidad en la hoja de la cubierta recubierto con BSA no adhesivo con el fin de capturar posteriormente uno de ellos con el adhesivo en voladizo PDL recubierto-: el voladizo adhesivo se coloca sobre una de las células sanas, obviamente, (de tamaño mediano, forma redonda en contraste normal, sin ampollas, no hay otras indicaciones irregulares en la forma) en la hoja de la cubierta recubierta con BSA, y redujo de manera gradual hasta que estaba cerca de la superficie de esta célula. A continuación, el voladizo fue suavemente en contacto con la célula retenida durante unos segundos antes de que la célula voladizo unido se levanta verticalmente en aproximadamente 100 micras [24]. Se dejó que la célula para establecer la adhesión firme en el voladizo por un par de minutos. Algunas células (aprox. 10%) se negaron a adherirse firmemente a la palanca en lugar colgando como se determina agitando suavemente el microscopio y observar el movimiento celular con la agitación inducida. En este caso la celda se lavó fuera de la voladizo levantándolo fuera del líquido y de nuevo con el fin de capturar una nueva célula. En el caso de la adhesión firme, se utilizó la celda para los experimentos de adhesión y supervisado por el experimentador la imagen a través de microscopio de luz durante todo el período de las mediciones.
Teléfonos Mediciones fuerza de adherencia
La célula inmovilizados en el sensor de fuerza fue empujado contra cualquiera de la monocapa SCP1 o la diapositiva con recubrimiento de Col-I con una fuerza de contacto de 100 pN. El tiempo de contacto entre la célula de la sonda y su sustrato se fijó a 0s que resulta en un contacto forzado de manera efectiva 0,3 s con el fin de limitar las tasas de adhesión (porcentaje de curvas con eventos adhesivas) a una gama lo más bajo posible. las tasas de adhesión por debajo de 30% proporcionan una alta probabilidad de la detección de interacciones moleculares individuales [24]. A tasas de adhesión superiores pasos no vinculante individuales tienden a resultar de múltiples enlaces moleculares que actúan en paralelo. Para cuantificar las diferencias entre las líneas celulares y superficies, se aplicó este corto tiempo de contacto y baja fuerza de contacto de 100pN lo largo de todo el experimentos. La velocidad de retracción se fijó a 3 micras /s como un compromiso entre resistencia hidrodinámica, lo que aumenta con la velocidad (en este caso a aproximadamente 5 pN) y los efectos deriva térmica que disminuyen con la velocidad. La distancia de retracción se fijó a 20 micras para dar cuenta de correas de sujeción largos (Fig. 2A) y para asegurar la célula se había separado del sustrato por completo después de cada ciclo. las medidas de fuerza en la monocapa SCP1 y Col-I se llevaron a cabo dentro de la misma placa de cultivo, mientras que para cada célula inmovilizada sobre un voladizo se preparó un nuevo plato. Esto resultó en dos experimentos por placa de cultivo: Cualquiera de una célula LNCaP en el voladizo contra el vidrio recubierta con Col-I y, posteriormente, frente a la superficie apical de la monocapa SCP1 o una célula PC3 en el voladizo vs. Col-I y entonces vs. SCP1 monocapa (Fig. 2B). El orden de los sustratos también se invirtió dentro de los experimentos PC3, que muestra resultados idénticos. En cada experimento (sondeo un tipo de célula a un tipo de sustrato) por lo menos se tomaron 80 curvas de fuerza entre una célula en el voladizo y un tipo de sustrato. En total, al menos 10 experimentos independientes para cada combinación de las interacciones célula-sustrato (LNCaP vs. Col-I; LNCaP vs. SCP1; PC3 vs. Col-I; PC3 vs. SCP1) se llevaron a cabo, produciendo al menos 800 curvas de fuerza por clase de interacción. Durante todo el experimento, se utilizó el microscopio óptico para controlar la forma esférica y la firme adhesión de la célula inmovilizado para el sensor de fuerza con recubrimiento de PDL (Fig. 2A). Además, hemos demostrado por los contactos celulares prolongados de 1 min a 500 pN de Col-I que la célula inmovilizado para el sensor de fuerza puede sostener las fuerzas de adhesión de al menos 8,5 nN sin separar del sensor.
Cell Adhesion Fuerza evaluación
Para el análisis de datos sólo las partes de retracción de los ciclos de aproximación-retracción se evaluaron. Con el fin de obtener información cuantitativa típico a partir de las curvas de fuerza-distancia, una evaluación y detección de paso de datos de software de diseño personalizado [25] se utilizó para eliminar el ruido de la señal (líneas negras en la Fig. 3), encontrar la línea de base (líneas de trazos en la Fig . 3), para la correcta resistencia hidrodinámica y la posible deriva y para extraer los siguientes parámetros:
el punto de datos más bajo a la izquierda marca la fuerza de contacto de 100 pN; la línea de puntos blanca representa la línea de base que corte la curva de retorno en el círculo negro que define la superficie celular; la línea de negro es la señal de-noised y las cruces rojas indican detecta pasos de-adhesión, donde la evaluación se lleva a cabo la fuerza de adhesión. curva (A) de la Fuerza de una de las células PC3 interactuar con Col-I para ilustrar la evaluación fuerza de adhesión: flecha Red#1: altura de los escalones de la primera evento de-adhesión en la curva de retracción. La fuerza de separación es la medida absoluta de la cruz roja hasta la línea de base;#2: altura de los escalones del segundo evento de-adherencia después de una meseta de la fuerza de 0,9 m de longitud;#3: posición del paso del primer evento de-adhesión;#4: posición del paso de la segunda prueba de adherencia. (Para ver las definiciones de adhesión celular de evaluación de esfuerzos en la sección Materiales y Métodos). Curvas características de cada uno de los cuatro tipos diferentes de experimentos están representados: (B) PC3 en Col-I, (C) PC3 en SCP1 monocapa, (D) LNCaP en (E) LNCaP en SCP1 monocapa Col-I y
altura de los escalones [pN] que describe la diferencia en la fuerza medida antes y después de un evento desprendimiento individual, visible como un paso fuerza. El algoritmo identifica un paso tal por máximos en la derivada de la señal de denoised que superar un cierto umbral y la marca por una pequeña cruz roja (véase también la Fig. 3). El último paso en una curva de la fuerza es el más fiable ya que en contraste con todos los demás (intermedio) pasos ninguna otra conexión entre la célula y el sustrato persiste. Por lo tanto el último paso no es potencialmente disminuida por otros enlaces existentes en paralelo.
tasa de adherencia [%] que describe la fracción de curvas con al menos un paso detecta la fuerza.
número de pasos que describe la número medio de pasos detectados por la curva (sólo contando las curvas con al menos un paso detecta la fuerza).
posición del paso [m] que describe la distancia entre el punto de contacto (círculo negro en la intersección de la línea de base y la curva de retorno) y una etapa de la fuerza.
obra de desprendimiento [aJ] que describe la energía disipada durante ese experimento de la fuerza por la integración de la zona comprendida entre la línea de base (fuerza cero) y retraer curva. (Nota:. Esto no tiene ninguna relación trivial para la energía de adhesión De hecho, dependiente de la velocidad de deformación viscosa y plástica de la célula y la propia membrana celular contribuyen fuertemente a la obra de desprendimiento lejos del equilibrio termodinámico).
fuerza de separación [pN] que describe la adherencia medida más alta (máximo global) por curva.
posición del pico [nm] que describe la distancia entre el punto de contacto y donde se detectó la fuerza de adhesión desprendimiento.
Todas las fuerzas mide son las fuerzas relativas y por lo tanto independiente de la constante de fuerza de desplazamiento (de 5PN) debido a la resistencia hidrodinámica del sensor de fuerza que viajan a la velocidad constante de 3 m /s.
meseta pasos, para este conjunto de datos aparece después de una meseta fuerza de al menos 500 nm de longitud en las tasas de carga de menos de 2.7pN /s (véase el paso 2 en la Fig. 3A).
en las tasas de carga entre 2,7 y 4,0 pN /s el criterio no era lo suficientemente claro para evitar falsa discriminación positiva o negativa paso.
escalones en consecuencia se producen después de un aumento de la fuerza de al menos 4,0 pN /s.
semi-cuantitativa Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR semi-cuantitativa se realizó tal como se describe en Popov et al, 2011 [26]. Brevemente, el ARN total fue extraído de PC3 y LNCaP células con RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y el ARN 1 mg se utilizó para la síntesis de ADNc con AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). PCR para la integrina α1, α2, β1 y GAPDH (usado para la normalización de la entrada de cDNA) se realizó con Taq ADN polimerasa (Invitrogen) en un instrumento MGResearch (BioRad, Munich, Alemania). Primer secuencias y condiciones de PCR se describen en Popov et al, 2011. Todos los resultados de la PCR se han reproducido tres veces de forma independiente.
Análisis estadístico
Para dar cuenta de los conjuntos de datos heterogéneos de dos análisis estadísticos se aplicadas: Read
en primer lugar, se utilizó la prueba T de Student suponiendo varianzas desiguales para analizar la tasa de adherencia, el número medio de pasos o la fracción de sujeción similar a los pasos filopodios que comparan los medios de recogida de células individuales entre PC3 y las células LNCaP. Cada media de una célula se marca como una cruz roja; la media de estos medios se indica como barra con el error de la media en la Fig. 4 A B y Fig. 5. En segundo lugar, se aplicó una prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov y sin supuestos para comparar la altura de los escalones, la posición de paso, fuerza de desprendimiento y el trabajo de desapego de todas las curvas de fuerza entre PC3 y LNCaP células. Las medianas se indican como bares con cuartiles. Cada medio de una celda está representado por una cruz roja en la Fig. 4 C y D. Los resultados con un valor de p menor que 0,05 se marcan como significativa por un asterisco.
(A) Porcentajes de curvas de fuerza con al menos un evento de-adherencia. (B) Número de eventos de-adhesión dentro de una curva de adhesivo. Las barras de error corresponden a error estándar de la media. Un valor de p significativo de una prueba t no pareada de los datos PC3 con respecto a los datos LNCaP está marcada por * (p & lt; 0,05). La media de cada célula individual está dada por una cruz roja. (C) Las medianas de la altura de los escalones de-adhesión individuales. (D) Las medianas de la posición de estos eventos de adhesión DE. (E) Las medianas de la fuerza de desprendimiento. (F) Las medianas de los trabajos de desprendimiento. Los cuartiles se indican con banderas dobles y la mediana de cada célula individual está dada por una cruz roja. datos de la fuerza de adhesión celular se adquirieron de 16 PC3 o 10 células LNCaP que interactúan con Col-I (1485 y 760 curvas de fuerza, respectivamente), y 17 PC3 o 11 células LNCaP interactuar con monocapas Scp1 (1526 y 878 curvas de fuerza, respectivamente).
Medios de el porcentaje de pasos de-adhesión individuales que representan el patrón de la fuerza típica de los pasos filopodios (sólido) y medidas de sujeción similar (a rayas) para el PC3 dos líneas celulares y LNCaP. Cada medio de una celda está representado por una cruz roja. Las barras de error corresponden a error estándar de la media. Un valor de p significativo de un t-test entre los diferentes pasos dentro de una línea celular de carcinoma de próstata se indica mediante * (p & lt; 0,05).
Resultados
PC3 y LNCaP Adhesión y la proliferación de co-cultivo con SCP1
en primer lugar la adhesión celular se analizó mediante el uso de imágenes de lapso de tiempo de hasta 12 h. PC3 CFDA pre-etiquetados y las células LNCaP fueron monitoreados en una monocapa SCP1 y después de 4 horas, la mayoría de las células PC3 parecían extienden sobre la monocapa SCP1 mientras que las células LNCaP aparecieron pequeños y redondos (Fig. 1A). Como se muestra en la Fig. S1, células PC3 cultivadas en vidrio o de vidrio recubierta con Col-I tiene un factor de forma planitud inferior en comparación con las células LNCaP, lo que indica una mayor capacidad para extenderse. Sin embargo, el análisis de forma de ambos tipos de células cultivadas en monocapas SCP1 no se llevaron a cabo debido al riesgo de mediciones inexactas de área, diámetro y volumen debido a los cuerpos celulares subyacentes de las células SCP1. Además, mediante la realización de análisis cuantitativo a las 4 y 12 h, podríamos demostrar que aprox. 90% de las células PC3 eran capaces de adherirse a la monocapa SCP1 ya después de 4 h y que su adhesión también se mantuvo cerca de 90% después de 12 h (Fig. 1B). En contraste, las células LNCaP tenían menor adhesión a SCP1 (aprox. 25%), que no aumentó significativamente después del tiempo de cultivo más largo.
Con el fin de investigar la proliferación celular PC3 y LNCaP en monocapas SCP1, hemos realizado co experimentos de cultivo para un máximo de 8 días. microscopía de contraste de fases en el día 1 y 8 demostró la formación y propagación de colonias PC3 en la parte superior de los SCP1cells, mientras que las células LNCaP formaron pequeños racimos de células, que no se expanden sino regresión durante este período (Fig. 1C).
Higo. Higo.