Extracto
β-lapachona, un componente importante de un extracto etanólico de la corteza
Tabebuia avellanedae
, es un fármaco terapéutico potencial prometedor para varios tumores, incluyendo el cáncer de pulmón, la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo. En la primera parte de este estudio, se encontró que la muerte celular apoptótica inducida en células de cáncer de pulmón por altas concentraciones de β-lapachona estaba mediada por aumento de la activación del factor de JNK pro-apoptótica y disminución de la activación de la supervivencia /proliferación celular Factores de PI3K, AKT y ERK. Además, la toxicidad β-lapachona se correlacionó positivamente con la expresión y la actividad de NAD (P) H quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) en las células tumorales. En la segunda parte, se encontró que el sulindac aprobado por la FDA no esteroide anti-inflamatorio de drogas y sus metabolitos, sulindac sulfuro y sulfona de sulindac, el aumento de la expresión y actividad de NQO1 en las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón y CL1-1 CL1-5, que tienen menores niveles de NQO1 y una menor sensibilidad a la ß-lapachona tratamiento de las líneas de células A549, y que la inhibición de NQO1 por cualquiera de los tratamientos dicumarol o desmontables NQO1 siRNA inhibe este aumento sulindac inducida en la citotoxicidad β-lapachona. En conclusión, sulindac y sus metabolitos sinérgicamente aumentar los efectos anticancerígenos de la β-lapachona principalmente por aumento de la actividad NQO1 y de expresión, y estos dos fármacos pueden proporcionar una nueva terapia de combinación para los cánceres de pulmón
Visto:. Kung HN, Weng TY, Liu YL, Lu KS, Chau YP (2014) Sulindac compuestos Facilitar la citotoxicidad de β-lapachona por la sobre regulación de NAD (P) H quinona oxidorreductasa en células de cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 9 (2): e88122. doi: 10.1371 /journal.pone.0088122
Editor: Gergely Szakacs, Academia de Ciencias de Hungría, Hungría
Recibido: April 2, 2013; Aceptado: January 5, 2014; Publicado: 5 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Kung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas (NSC 101 a 2320-B-002-020-MY3, NSC 98-2320-B-715-001-MY3 (YPC) y NSC 101 a 2320-B-002-008) por el Consejo Nacional de Ciencia , Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
β-lapachona, un o-naftoquinona natural obtenido originalmente de
lapacho
árboles en América del Sur, tiene una actividad antitumoral prometedora en diversas células tumorales [1] - [6] y ha sido probado como un fármaco candidato anti-tumor en fase I /II /III de ensayos clínicos en combinación con otros fármacos de quimioterapia [1], [7]. Su actividad anti-cáncer se piensa que es debido a la reducción de dos electrones de β-lapachona catalizada por NAD (P) H: quinona oxidoreductasa (NQO1, DT-diaforasa), usando NAD (P) H o NADH como fuente de electrones [ ,,,0],1], [8], [9]. En presencia de NQO1, β-lapachona somete a reducción a una hidroquinona inestable, que experimenta rápidamente una oxidación en dos etapas en el compuesto padre, perpetuando un ciclo redox inútil y que resulta en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que incluye superóxidos [ ,,,0],8], [10] - [12]. Estas especies reactivas pueden oxidar grupos tiol del potencial complejo del poro de transición mitocondrial, lo que lleva a un aumento de la permeabilidad mitocondrial interna de la membrana, la reducción de la despolarización de la membrana mitocondrial y liberación de citocromo c, lo que resulta en la muerte celular [13], [14]. Debido NQO1 es más altamente expresado en varios cánceres sólidos que en los tejidos normales [15], β-lapachona puede matar selectivamente estas células de cáncer. Además, el aumento de la expresión o actividad de NQO1 en las células cancerosas pueden hacerlos más sensibles a los ß-lapachona. Con el fin de aumentar la eficacia clínica de la β-lapachona, muchos métodos se han examinado para aumentar la expresión o actividad NQO1 en células de cáncer [3], [5], [16] - [19].
Sulindac es una Administración de Alimentos y medicamentos (FDA): aprobado no esteroide antiinflamatorio (NSAID) para el tratamiento de la osteoartritis, la espondilitis anquilosante, la gota o la artritis reumatoide [20] - [23]. Su actividad anti-inflamatoria se debe a su inhibición de la síntesis de prostaglandinas [24], que causan la inflamación y el dolor en el cuerpo. Sulindac también se ha encontrado para bloquear guanosina monofosfato cíclico-fosfodiesterasa, una enzima que inhibe la vía normal de la señalización de apoptosis, y este efecto inhibidor permite la vía de señalización de apoptosis de proceder sin oposición, lo que resulta en la muerte celular apoptótica y reducir la incidencia de diversos tumores, incluyendo mama, esófago, estómago, próstata, vejiga, ovario y cáncer de pulmón [25], [26]. En los seres humanos, sulindac se reduce al metabolito anti-inflamatorio activo, el sulfuro de sulindac sufre una reoxidación 2-paso para sulindac sulfona [27], [28]. Los tres compuestos se han demostrado tener efectos quimioprotectores. En el cáncer de colon, sulindac se ha utilizado para aumentar los efectos anticancerígenos de algunos reactivos o tensiones, incluyendo bortezomib [4], peróxido de hidrógeno [29], y el estrés oxidativo [30]. Es importante destacar que, sulindac y sus metabolitos modulan la expresión de enzimas multioxidative, incluyendo glutatión S-transferasas y NQO1, siendo este último el regulador clave de la muerte de las células β-lapachona inducida en células de cáncer [28], [31], [32], y sulindac lo tanto, podría tener un efecto antitumoral sinérgico con β-lapachona
el cáncer de pulmón, el principal cáncer en el mundo, se ha convertido en la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer [33] -. [35]. De acuerdo con un informe del Departamento de Salud, Yuan Ejecutivo, la República de China (Taiwán), publicado en 2010, la tasa de mortalidad por cáncer de pulmón es del 20%, encabezan la lista de todas las muertes relacionadas con el cáncer. El costo del cuidado de la salud para el tratamiento de la enfermedad pulmonar está aumentando enormemente cada año y amenaza con abrumar a los servicios de salud pública [36]. Con el fin de obtener una mejor terapia de destino, los investigadores han tratado de identificar las principales diferencias entre las células de cáncer de pulmón y células pulmonares normales, tales como la mutación o sobreexpresión de los genes, incluyendo
EGFR, ras
, y
VEGF
[37] - [39]. Por desgracia, las quimioterapias actuales para el cáncer de pulmón carecen de especificidad adecuada, la eficacia, el tratamiento y la heterogeneidad es también un gran problema [40]. Por tanto, existe una necesidad urgente de nuevos fármacos terapéuticos o nuevas combinaciones de fármacos para proporcionar una terapia más eficiente cáncer de pulmón. Desde la sobreexpresión NQO1 se ha observado tanto en línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [41], [42], β-lapachona podría ser un fármaco terapéutico potencial para los cánceres de pulmón. Sin embargo, algunas células de cáncer de pulmón muestran expresión o menor actividad NQO1 y por lo tanto podrían ser resistentes a la ß-lapachona toxicidad. En este estudio, lo primero que investigó la relación entre la toxicidad β-lapachona y los niveles de NQO1 en líneas de células de NSCLC, a continuación, se determinó la vía de señalización implicados en la muerte celular causada por altas concentraciones de β-lapachona. También se utilizaron concentraciones más bajas de β-lapachona explorar si sulindac y sus metabolitos podría facilitar el efecto anticancerígeno de β-lapachona mediante el aumento de la expresión o actividad de NQO1 en líneas celulares de cáncer de pulmón con bajos niveles de NQO1 y comprobó la importancia de NQO1 en esta terapia de combinación . Se encontró que la toxicidad de la β-lapachona estaba relacionada con el nivel de expresión de NQO1 o actividad en las células de cáncer de pulmón y que altas concentraciones de células muertas β-lapachona por la disminución de la fosforilación de PI3K, AKT y ERK y la activación de JNK. Además, la citotoxicidad de bajas concentraciones de β-lapachona se incrementó en combinación con sulindac y sus metabolitos, un proceso que implica la regulación positiva de la expresión o actividad de NQO1.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
Las líneas celulares de cáncer de pulmón humano CL1-1, CL1-5 y A549, se cultivaron en 5% de CO
2 a 37 ° C en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%, 100 Unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (todos de Gibco). Las líneas celulares fueron regalos de PC Dr. Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán [43], en cuyo laboratorio CL1-5 células fueron seleccionados a partir de células CL1-1 parentales para un mayor potencial metastásico usando un sistema transwell.
Cell Los ensayos de viabilidad
CL1-1, CL1-5, o células A549 (1x10
4) se sembraron durante 24 horas a 37 ° C en una placa de cultivo de 96 pocillos, a continuación, se sometieron a la inanición de 14 h en RPMI 1640 que contenía 2% de suero bovino fetal, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Después de 6 h de tratamiento previo con el medio o la concentración indicada de sulindac o sus metabolitos (todos de Sigma), se incubaron las células durante 12 h con o sin la concentración indicada de β-lapachona en la presencia continua de sulindac o de sus metabolitos, y luego se evaluó la viabilidad celular.
se utilizaron dos ensayos de viabilidad celular. En el ensayo de tinción con violeta cristal, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15 min, se tiñeron con 0,4% de cristal violeta durante 15 minutos, y se lavaron con H
2O, a continuación, 50% de alcohol de ácido se utiliza para disolver el cristal unido violeta y la DO a 550 nm se mide en un lector de ELISA. En el ensayo de MTT, se añadieron 10 l de MTT (0,5 mg /ml) (Sigma) a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 ° C durante 4 h, entonces el producto formazan se disolvió en 100 l de DMSO a 37 ° C durante 30 minutos y la DO a 570 nm se mide en un lector de microplacas.
naranja de acridina (AO) la tinción
las células (5x10
4) cultivadas en cubrir-diapositivas de 24 pocillos las placas se incubaron durante 14 h en medio RPMI que contenía suero de ternera fetal 1640 2%, se preincubaron con sulfuro de sulindac durante 6 h, y después se trata con o sin β-lapachona durante 24 h, a continuación se fijaron inmediatamente en 4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 min a temperatura ambiente (RT), y se tiñeron durante 10 minutos con 0,5 ml de AO (10 mg /ml en PBS) (Sigma). Después de varios lavados con PBS, las células fueron examinados en una Olympus BH-2 microscopio invertido equipado con un accesorio de fluorescencia.
Detección de Apoptosis y Medición de los niveles de calcio intracelular
Para detectar la apoptosis, las células ( 1x10
6) se trataron durante 3, 6, o 9 h con 5 mM β-lapachona, a continuación, se lavaron con PBS enfriado con hielo, se tripsinizaron con 0,05% de tripsina-EDTA al 0,02%, se tiñeron durante 15 minutos a 37 ° C con Anexina V-FITC (10 mg /ml) (Strong Biotech Corporation, AVK050, Taipei, Taiwán), y se analizaron mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).
Para medir los niveles de calcio intracelular, se incubaron las células durante 10 min a 37 ° C con mM Fluo-4 2 /AM (Molecular Probes), se lavó con PBS, se tripsinizaron, y se analizaron por citometría de flujo FACSan utilizando el parámetro FL1H.
los análisis Western Blot
las células tratadas se lisaron con tampón RIPA que contiene 10 mg /ml de inhibidor de proteasa (Sigma), y a continuación, el lisado se centrifugó a 10.000 × g durante 15 min a 4 ° C y se recogió el sobrenadante para inmunotransferencia. La concentración de proteínas se midió por el ensayo de Bradford, y las muestras que contiene 20 g de proteína fueron separadas por 10 o 12% de SDS-PAGE, y luego se transfirieron a membranas Immobilon-P durante 2 horas a 200 V (Millipore) en un Trans-Blot célula de transferencia electroforética. Las membranas se bloquearon durante 1 h a TA con leche desnatada 5% en PBS-0,2% de Tween 20 (PBS-T), después se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpos contra NQO1 (Señalización Celular), PI3 quinasa o p-PI3 quinasa (Millipore), AKT o p-AKT (Epitomics), ERK, p-ERK, JNK, o p-JNK (señalización celular), GAPDH (Genetex) o β-actina (Abcam) diluido 1:1000 en 1% de BSA. Después de lavar durante 30 minutos a RT con PBST, las membranas se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Perkin-Elmer, Boston, MA; 1:5000 dilución en PBST), el anticuerpo unido se detectó a continuación, utilizando el ECL Western Blot reactivo (Amersham), quimioluminiscencia su detección usando una película de rayos X Fuji médico (Tokio, Japón) y se cuantificó imagen gel por análisis con software Image Pro. La intensidad de la banda de interés se dividió por que para β-actina o GAPDH (control de carga) y este valor normalizado a la observada con ningún tratamiento.
ARN de interferencia
fueron transfectadas Las células con la segmentación no control de siRNA (SINEG) o siRNA dirigidos NQO1 (siNQO1) (Applied Biosystems) usando el reactivo de transfección XtremeGene siRNA (Roche), a continuación, los niveles de los transcritos y las proteínas indicadas se examinaron por PCR en tiempo real (usando los cebadores enumerados en la Tabla S1 ), RT-PCR, y transferencia Western, y las células se utilizaron en los experimentos.
transcripción inversa-PCR
el ARN total se extrajo con Trizol (Invitrogen) y Reverse-transcritos a cDNA utilizando un kit de transcripción inversa Superscript II (Invitrogen), a continuación, se realizó PCR utilizando los siguientes cebadores:. NQO1 (F, TCCTCAGAGTGGCATTCTGC; R, TCTCCTCATCCTGTACCTCT) o GAPDH (F, CAACTACATGGTTTACATGTTC; R, GCCAGTGGACTCCACGAC)
Actividad NQO1 Ensayo
Para medir la actividad NQO1 endógena en extractos de células, las células se lavaron con PBS y se sonicaron en tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 0,1 mM). La mezcla de reacción de ensayo (volumen final de 200 l) contenía Tris 25 mM pH 7,5, 0,01% de Tween 20, 0,7 mg /ml de BSA, 40 mM de 2,6-dicloroindofenol (DCPIP; Sigma), 5 M FAD, 200 mM NADH, 50 g de extracto de células, y, o bien 10 dicumarol M o medio. La disminución de la DCPIP absorbancia a 600 nm en ausencia o presencia de dicumarol se midió a intervalos de 5 segundos durante 60 segundos y la actividad expresada como actividad relativa, con la actividad de control dado un valor de 1.
Análisis estadístico
Todos los datos cuantitativos se presentan como la media ± SEM de al menos tres experimentos separados. Las diferencias entre los grupos fueron examinadas usando un modelo lineal con la prueba de Scheffe, con p & lt; 0,05 (* o #), p & lt; 0,005 (**) o p & lt; 0,001 (***) se consideraron estadísticamente significativas
resultados
Expresión y NQO1 actividad en las células del cáncer de pulmón se correlacionan con β-lapachona Toxicidad
para comparar la citotoxicidad de β-lapachona de varias células de cáncer de pulmón, tres líneas celulares, CL1-1 , CL1-5, y A549, se incubaron durante 12 h con β-lapachona (0 a 10 mM), a continuación, la supervivencia celular se midió mediante tinción con violeta cristal. Como se muestra en la Figura 1A, usando 1-5 mM β-lapachona, las células A549 mostraron un porcentaje significativamente menor supervivencia que las células CL1-1 y CL1-5, pero no había ninguna diferencia significativa entre las diferentes células usando 10 mM β- lapachona. Dado que la actividad NQO1 se ha correlacionado positivamente con la citotoxicidad de β-lapachona en líneas celulares de cáncer de mama [8], [9], [44], se examinó si la sensibilidad de las diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón de ß-lapachona toxicidad se asoció con intracelular NQO1 expresión. Las figuras 1B-D mostró actividad NQO1 (Fig. 1B), los niveles de ARN NQO1 (Fig. 1C), y los niveles de proteína NQO1 células (Fig. 1D) en CL1-1, CL1-5, y A549 y mostró que, en virtud de cultivo normal condiciones, los tres valores fueron más altos en las células A549 y la más baja en las células CL1-5. Por último, comparamos la sensibilidad de A549, células CL1-1, y CL1-5 al tratamiento con 0-10 mM β-lapachona de 3, 6, 12, o 24 h usando tinción con cristal violeta y se encontró que el porcentaje de supervivencia de CL1- 5 células fue mayor que la de CL1-1 células en los 4 puntos de tiempo, y que las células A549 mostraron el menor porcentaje de supervivencia (Figura 1E). Estos resultados se corresponden bien con los niveles de NQO1 intracelulares en las tres líneas celulares, como la sensibilidad a la ß-lapachona fue mayor en células con niveles de NQO1 más altas. Estos datos mostraron que el nivel o la actividad NQO1 juega un papel clave en la citotoxicidad β-lapachona de líneas celulares de cáncer de pulmón
.
(A) Porcentaje de supervivencia de las líneas celulares de cáncer de pulmón CL1-1, CL1-5 y A549 . Las células se trataron con 0 a 10 mM β-lapachona durante 12 h, a continuación, la viabilidad celular se determinó por el ensayo de tinción con cristal violeta y se expresó como un porcentaje del valor para los cultivos sin β-lapachona. (B-D) los niveles de actividad NQO1 (B), NQO1 los niveles de expresión de ARN (C), y los niveles de expresión de proteína NQO1 (D) en las líneas celulares de cáncer de pulmón tres cultivan en condiciones de cultivo normales. (E) porcentaje de supervivencia de las células A549 (panel izquierdo), células CL1-1 (panel central), y células CL1-5 (panel derecho) se incubaron con la concentración indicada de β-lapachona de 3, 6, 12, o 24 h examinado por tinción con cristal violeta y se expresa como porcentaje de supervivencia en comparación con las células no tratadas. Los resultados son la media ± SD de 3 experimentos independientes, cada uno por triplicado.
En experimentos posteriores, ya β-lapachona sola era muy eficaz en matar las células A549 y que deseaba examinar si sulindac o su metabolitos tuvieron un efecto sinérgico con β-lapachona, nos hemos concentrado en las células CL1-1 y CL1-5. Además, dado que la mayor diferencia en la supervivencia de las células CL1-1 y CL1-5 se observó a concentraciones de β-lapachona de 2 a 5 M, se utilizó 5 mM β-lapachona para estudiar el efecto de la β-lapachona solo y 2 micras β-lapachona para estudiar los efectos sinérgicos de sulindac y β-lapachona.
identificación de la vía de señalización apoptótica desencadenada por β-lapachona
para investigar los mecanismos subyacentes implicados en la toxicidad β-lapachona, 5 M β-lapachona fue utilizado para explorar la vía de señalización de apoptosis activada por β-lapachona en células CL1-1 y CL1-5. Uso de la tinción con anexina V, la muerte celular en CL1-1 tratado con β-lapachona y CL1-5 se demostró que se produzca por apoptosis (Figura 2A). Análisis del ciclo celular también mostró que la relación de sub G0 /G1 (células apoptóticas) aumentó de una manera dependiente del tiempo (Figura S1A). En los estudios que miden los niveles de calcio intracelular, un aumento fue visto después de 1 o 2 h de tratamiento β-lapachona tanto en las células CL1-1 y CL1-5 (Figura 2B, flecha), como se ve durante la activación de la ruta apoptótica por β-lapachona [6], [45]. El porcentaje de supervivencia celular, medida utilizando el ensayo MTT, fue sólo parcialmente restaurada por adición de 0 a 10 mM BAPTA (Molecular Probes), un quelante de calcio intracelular, durante la incubación durante 24 h con 5 mM β-lapachona (Figura 2C), mostrando que el aumento de los niveles intracelulares de calcio no fue el único factor implicado en la muerte de las células β-lapachona inducida de estas células. Aunque la calpaína y la caspasa 3, los componentes de la vía de señalización de apoptosis, se activaron mediante tratamiento con 5 mM β-lapachona de 0-9 h (Figura S1B), como se muestra en la Figura 2, complementaria caspasas y calpaína no estaban involucrados en el cáncer de pulmón la muerte celular inducida por β-lapachona, como 1 h de tratamiento previo con el inhibidor de caspasa zVAD pan o el inhibidor de la calpaína ALLM o ALLN (todos de Sigma) no inhibió el efecto (Figura S2). En ambas líneas celulares, el potencial de membrana mitocondrial (MMP) se disminuyó por tratamiento durante 3, 6, o 9 h con β-lapachona (Figura S1C), pero intracelular H
2O
2 niveles se no cambió por β -lapachone tratamiento durante 3 o 6 horas (Figura S1D). Estos resultados muestran que β-lapachona provoca la apoptosis de las células tanto CL1-1 y CL1-5 por la disminución de la MMP.
(A) células CL1-1 (panel izquierdo) o células CL1-5 (panel derecho) se incubaron con 5 mM β-lapachona de 0, 3, 6, o 9 h, a continuación se examinaron para la apoptosis usando Anexina V. (B) CL1-1 células (panel izquierdo) o células CL1-5 (panel derecho) se incubaron con 5 mM β-lapachona durante el tiempo indicado, a continuación, los niveles de calcio intracelular se midieron usando Fluo-4 tinción y citometría de flujo. La intensidad de Fluo-4 tinción se aumentó mediante tratamiento β-lapachona, especialmente en 1 h (flechas). (C) células CL1-1 (panel izquierdo) o células CL1-5 (panel derecho) se dejaron sin tratar o se incubaron durante 24 h con la concentración indicada de BAPTA-AM, un quelante de calcio intracelular, y /o 5 mM β- lapachona supervivencia, entonces celular se midió mediante el ensayo de MTT y se expresaron como porcentaje de supervivencia en comparación con las células no tratadas. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0.01 en comparación con ß-lapachona solo
Para determinar las vías de señalización activadas en la muerte celular de cáncer de pulmón β-lapachona inducida, los niveles de las formas fosforiladas de PI3K, AKT y MAPK la ERK y JNK en células CL1-1 y CL1-5 fueron examinados. tratamiento β-lapachona de 10 a 180 min aumentó la fosforilación de JNK, pero disminuyó la fosforilación de ERK (Figura 3A) y de PI3K y AKT (Figura 3B). Además, a concentraciones de 1, 2, o 5 M, el inhibidor de JNK SP600125 células de la toxicidad inducida por 24 h de incubación con β-lapachona (Figura 3C) rescató parcialmente, mostrando que JNK desempeña un papel importante en la muerte de células de cáncer de pulmón inducida por β-lapachona.
(a) células CL1-1 (izquierda) o células CL1-5 (derecha) se incubaron con 5 mM β-lapachona durante el tiempo indicado, a continuación, los niveles de p-ERK, ERK , p-JNK, y JNK se midieron mediante transferencia Western. células CL1-1 (izquierda) o células CL1-5 (B) (derecha) se incubaron con 5 mM β-lapachona de 0, 3, 6, 9 o H, entonces los niveles de p-PI3K y p-AKT fueron examinados por Western Blot. células CL1-1 (izquierda) o células CL1-5 (C) (a la derecha) fueron pretratados con las concentraciones indicadas de la SP600125 inhibidor de JNK durante 6 h, y después se trató con o sin 5 mM β-lapachona de 24 supervivencia h.Cell se midió por el ensayo de MTT y se expresaron como porcentaje de supervivencia en comparación con las células no tratadas * p & lt;. 0.05 (D) células CL1-1 (izquierda) o células CL1-5 (derecha) se dejaron sin tratar o se preincubaron durante 1 h con 10 M dicumarol, a continuación, se añadió medio o 5 mM β-lapachona y las células se incubaron durante 9 horas y los niveles de p-PI3K y AKT-p se midieron mediante transferencia Western.
con el fin de determinar si NQO1 fue un regulador clave en la muerte de células de cáncer de pulmón β-lapachona mediada, se incubaron las células durante 6 h con 10 dicumarol mu M, un inhibidor de NQO1 específica, y esto dio como resultado aproximadamente un 67% y 77% de reducción en la actividad de NQO1 en CL1- 1 y CL1-5 células, respectivamente (Figura S3A). Dicoumarol tratamiento inhibió significativamente la disminución de la fosforilación de p-PI3K y p-AKT causada por 9 h de tratamiento β-lapachona (Figura 3D) bloquea el aumento de los niveles de calcio intracelular inducida por 1 h de tratamiento β-lapachona (Figura S3B) , y marcadamente inhibida la muerte celular por apoptosis causada por 6 h de incubación con β-lapachona, como se muestra por tinción con Anexina V (Figura 4A) y naranja de acridina (AO) tinción (Figura 4B).
(A) CL1 -1 células (parte superior) o células CL1-5 (abajo) se dejaron sin tratar o se incubaron durante 6 h con 5 mM β-lapachona y /o dicumarol 10 mM, teñidas con anexina V-FITC y la fluorescencia Anexina V medido por citometría de flujo. (B) Cambios morfológicos después del tratamiento de drogas. CL1-1 o células CL1-5 se dejaron sin tratar (CTL) o se incubaron durante 24 h con 5 mM β-lapachona con o sin dicumarol 10 mM, después se tiñeron con naranja de acridina para observar la morfología del núcleo celular. La barra de escala representa 50 micras.
El sulindac y sus metabolitos aumentar el efecto citotóxico de la β-lapachona través de la activación de NQO1
El AINE sulindac y sus metabolitos, sulfuro de sulindac (al reducirse formulario) y sulfona de sulindac (la forma oxidada), son conocidos para modular la expresión de algunas enzimas multioxidative, incluyendo NQO1 [31], [32]. Dado que los niveles de actividad NQO1 y se asociaron negativamente con la citotoxicidad de β-lapachona, el próximo investigó si sulindac y sus metabolitos podríamos aumentar la citotoxicidad de β-lapachona de células con expresión NQO1 baja y menor sensibilidad β-lapachona, como CL1-1 y las células CL1-5.
para determinar si sulindac y sus metabolitos podrían modular la expresión de NQO1 en líneas celulares de cáncer de pulmón, que se utilizaron en concentraciones de 100 y 250 mM para tratar las células CL1-1 y para CL1-5 6, 12, o 24 h. Como se muestra en la Figura 5A, en células CL1-1, ambas concentraciones de sulindac o metabolitos upregulated los niveles de proteína NQO1 en los 3 puntos de tiempo, mientras que, en las células CL1-5, los resultados fueron más complejos, con un aumento que se observa después de la incubación durante 12 o 24 h con 100 m, pero no 250 mM, sulindac, en los tres puntos de tiempo con ambas concentraciones de sulindac sulfona o 100 sulfuro M sulindac, y con 250 mM de sulfuro de sulindac durante 6 h (12 y 24 h no probadas) (figura 5A). actividad de la enzima NQO1 también se incrementó en todos los tres productos químicos (Figura 5B). Como se muestra en la figura S4, en 100 y 250 M, los tres fármacos no tuvieron ningún efecto significativo en el porcentaje de supervivencia de las células CL1-1 y CL1-5 después de la incubación con sulindac o sulfona de sulindac durante 54 h o con sulfuro de sulindac para 12 h. Con el fin de examinar el efecto sinérgico de sulindac o sus metabolitos y β-lapachona en células de cáncer de pulmón, células CL1-1 y CL1-5 se incubaron con 0, 50, 100, o 250 mM sulindac o los metabolitos de 6 h, a continuación, con 2 mM β-lapachona en la presencia continua de sulindac o metabolito durante 12 h, y el porcentaje de supervivencia se midió usando tinción con cristal violeta. En comparación con las células tratadas con β-lapachona solo, la supervivencia de las dos líneas celulares se redujo en un 10 a 40% cuando cotreated con β-lapachona más sulindac, 20-40% con β-lapachona más sulindac sulfona, y 30 a 60% con ß-lapachona más sulfuro de sulindac (Figura 6A). La disminución cotratamiento inducida fue mayor con células CL1-5 que con células CL1-1, es decir, que fue mayor con las células que expresan niveles más bajos de NQO1 (Figura 6A); Además, no hay efecto adicional de tratamiento combinado en comparación con ß-lapachona solo se observó con las células A549 (Figura S5) que expresan los niveles más altos NQC1. Estos datos muestran que sulindac puede aumentar la sensibilidad de las células con bajos niveles de NQO1 a ß-lapachona citotoxicidad. Usando tinción AO y microscopía de fluorescencia, 6 h de tratamiento previo con sulfuro de sulindac 100 o 250 mM, seguido de la adición de 2 mM β-lapachona durante 12 h dio lugar a una disminución de la densidad celular y CL1-1 CL1-5 comparación con ß-lapachona solo (Figura 6B), y se obtuvieron resultados similares con la combinación de β-lapachona y, o bien sulindac sulfona o sulindac (datos no mostrados).
(A) las células CL1-1 (izquierda) o células CL1-5 (derecha) se dejaron sin tratar o se incubaron con 100 o 250 sulindac mu M, sulfona de sulindac, o sulfuro de sulindac durante 6, 12, o 24 h, a continuación, los niveles de proteína se midieron por transferencia Western. (B-D) CL1-1 células (izquierda) o células CL1-5 (derecha) se dejaron sin tratar (CTL) o se incubaron con la concentración indicada de sulindac (B), sulfona de sulindac (C), o el sulfuro de sulindac (D ) durante el tiempo indicado, se midió a continuación la actividad NQO1. *: P & lt; 0,05, **: p & lt; 0,01, ***: p & lt; 0,001 en comparación con el control
(a) células CL1-1 células (izquierda) o (CL1-5. derecha) se dejaron sin tratar o se pretrataron durante 6 h con la concentración indicada de sulindac, sulfona de sulindac, y el sulfuro de sulindac, a continuación, se añadió 2 mM β-lapachona durante 12 h, a continuación, la supervivencia celular se midió usando tinción con cristal violeta y se expresó como porcentaje supervivencia en comparación con las células no tratadas. *: P & lt; 0,05 en comparación con ß-lapachona solo. (B) Dos conjuntos de cada tipo de células se dejaron sin tratar o se incubaron durante 6 h con sulfuro de sulindac 100 o 250 mM, a continuación, 2 M B-lapachona se añadió a un conjunto y la incubación continuó durante 12 h, a continuación, la morfología fue examinado por tinción con naranja de acridina. La barra de escala representa 100 micras.
NQO1 juega un papel clave en el aumento inducido por sulindac en la citotoxicidad β-lapachona presencia de células cancerosas de pulmón
Aunque la expresión y la actividad NQO1 se incrementaron en sulindac y sus metabolitos, ya sea NQO1 fue un importante contribuyente al aumento sulindac inducida en la citotoxicidad β-lapachona investigación todavía es necesario. Se utilizaron dos métodos para inhibir la actividad enzimática o expresión de la proteína de NQO1, un inhibidor de NQO1 y desmontables NQO1 siRNA.
Dicoumarol se ha utilizado anteriormente para inhibir específicamente la expresión y la actividad de NQO1 [44]. Como se muestra en la Figura 7, el pretratamiento de las células con 100 o 250 sulindac mu M (Figura 7A), sulfona de sulindac (Figura 7B), o sulfuro de sulindac (Figura 7C), seguido de la adición de 2 mM β-lapachona durante 12 h aumentó la citotoxicidad de β-lapachona para ambas células CL1-1 y CL1-5 y estos efectos se reducen significativamente mediante la adición de 10 mM dicumarol.
células CL1-1 (izquierda) o células CL1-5 (derecha) se dejaron sin tratar o se pretrataron durante 6 h con 100 o 250 M sulindac (a), sulfona de sulindac (B), o el sulfuro de sulindac (C) con o sin 10 mM dicumarol, a continuación, se incubaron durante otras 12 h con o sin adición de 2 M β-lapachona, a continuación, la supervivencia celular se midió mediante tinción con cristal violeta y se expresó como porcentaje de supervivencia en comparación con las células no tratadas. *:. P & lt; 0,05
El uso de siRNA desmontables de NQO1, en los días 1 a 3 después de NQO1 siRNA transfección de células CL1-1 y CL1-5, no se observó ningún cambio en el crecimiento celular o la morfología celular (Figura S6). Eficiencia de la caída en las células CL1-1 y CL1-5 se demostró para la expresión del ARN por RT-PCR (Figura 8A) y en tiempo real-PCR (Figura S7) y para la expresión de proteínas por transferencia de western (Figura 8B y C), lo que demuestra que NQO1 siRNA downregulated significativamente la expresión de NQO1. Como se muestra en la Figura 8D, NQO1 siRNA transfección, inhibió el aumento de la actividad de la enzima NQO1 inducida en células CL1-1 por incubación durante 6 o 24 h con 100 o 250 M sulindac (panel izquierdo), sulfona de sulindac (panel central), o sulindac sulfuro (panel derecho). Cuando las células transfectadas durante 24 h con siNQO1 o de control de siRNA fueron pretratados durante 6 h con sulindac o de sus metabolitos, a continuación, cotreated durante 12 h con fármaco más 2 mM β-lapachona, los resultados de supervivencia celular porcentaje mostraron resultados que la transfección con NQO1 siRNA causó una disminución significativa de la citotoxicidad de las combinaciones de β-lapachona con sulindac (Figura 9A), sulfona de sulindac (Figura 9B), o sulfuro de sulindac (Figura 9C). Estos resultados mostraron que NQO1 juega un papel importante en el aumento de la muerte celular inducida por β-lapachona causada por sulindac o de sus metabolitos.
(C-A) CL1-1 células (izquierda) o células CL1-5 (a la derecha) fueron transfectadas durante 1 a 3 días con el control de siRNA (CTL) o siRNA dirigidos NQO1, a continuación, la expresión de ARN se midió por PCR (a) y la expresión de proteínas por transferencia Western (B y C). (D) las células transfectadas CL1-1 durante 2 días con el control de siRNA o NQO1 siRNA se incubaron solo o con 100 o 250 M sulindac, el sulfuro de sulindac, sulfona o sulindac durante 6 o 24 h, se midió a continuación la actividad NQO1. *: P & lt; 0,05, ***: p & lt; 0,001 en comparación con las células tratadas idénticamente transfectadas con siRNA control
células CL1-1 (izquierda) o células CL1-5 (derecha) se transfectaron. con control de siRNA (-) o NQO1 siRNA (+) durante 24 h, a continuación, se dejaron sin tratar o se incubaron durante 6 h con 100 o 250 M sulindac (a), sulfona de sulindac (B), o el sulfuro de sulindac (C), entonces