Extracto
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es una neoplasia agresiva con opciones de tratamiento limitadas. Hemos determinado anteriormente que PARP se sobreexpresa en SCLC y que la orientación PARP reduce línea celular y el crecimiento tumoral en modelos preclínicos. Sin embargo, las líneas celulares de SCLC con activación de la vía PI3K /mTOR eran relativamente menos sensible a la inhibición de PARP. En este estudio, hemos investigado los cambios proteómicos en PI3K /mTOR y otras vías que ocurran después de la inhibición PAPR y /o una caída
in vitro
y
in vivo
. El uso conjunto de proteínas de fase inversa, encontramos las proteínas upregulated significativamente mayor después del tratamiento con el olaparib inhibidores de PARP y rucaparib estaban en la vía PI3K /mTOR (p-mTOR, p-AKT y PS6) (p≤0.02). Por otra parte, entre las proteínas más significativamente baja regulado eran LKB1 y sus objetivos AMPK y TSC, que regulan negativamente la vía PI3K (p≤0.042). Después de PARP caída en líneas celulares, mTOR fosforilada, AKT y S6 se elevaron y se vio disminuida de señalización LKB1. las concentraciones globales de la ATP se incrementaron después de la inhibición de PARP (p≤0.02) que nos lleva a la hipótesis de que el aumento de la activación de la vía PI3K /mTOR observaron los siguientes resultados de inhibición de PARP de la disminución del uso de ATP y una posterior disminución de la tensión señalización a través de LKB1 respuesta. Sobre la base de estos resultados, a continuación, investigamos si la co-dirigido con un inhibidor de PI3K y PARP (BKM-120) funcionaría mejor que sea un único agente. La mayoría de las líneas celulares de SCLC fueron sensibles a BKM-120 a dosis clínicamente alcanzables, y la expresión cMYC fue el biomarcador más fuerte de la respuesta. A dosis clínicamente alcanzables de talazoparib (el inhibidor de PARP más potente en el CPCP ensayos clínicos) y BKM-120, se observó un efecto aditivo
in vitro
. Cuando se probó en dos modelos animales de SCLC, se observó una mayor que la interacción aditivo (p≤0.008). Los datos presentados aquí sugieren que la combinación de inhibidores de PARP y PI3K aumenta el efecto de cualquier agente solo en modelos preclínicos de SCLC, lo que justifica una mayor investigación de tales combinaciones en pacientes con CPCP
Visto:. Cardnell RJ, Feng Y, Mukherjee S , Diao L, Tong P, Stewart CA, et al. (2016) La activación de la vía PI3K /mTOR siguiente PARP inhibición en el cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 11 (4): e0152584. doi: 10.1371 /journal.pone.0152584
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 9 de noviembre de 2015; Aceptado: 15 Marzo de 2016; Publicado: 7 Abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Cardnell et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el MD Anderson Cancer Center de Grant Support (NIH P30 CA016672); Universidad de Texas Southwestern y SPORE-MD Anderson Cancer Center de pulmón (5 P50 CA070907); gracias a las generosas contribuciones filantrópicas a la Universidad de Texas MD Anderson Cáncer de pulmón Luna Shot Programa; NIH 1R01 CA168484-01 (JVH); David Bruton, Jr., Cátedra (JVH); Fundación de la Rexanna para combatir el cáncer de pulmón (http://www.rexannasfoundation.org/) (JVH); Scientist Award MD Anderson Cancer Center Médico (LAB); Lee Clark Beca de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, apoyado por el Fondo de Becas Jeane F. Shelby (LAB); un Investigador Clínico del Cáncer del NCI premio al equipo de liderazgo (P30 CA016672) (LAB); El Instituto Zayed Al Nahyan Sheikh Khalifa Bin Centro para el cáncer de Terapia Personalizada (de IPCT) para la Educación y Formación Profesional (LAB); la Asociación Nacional de Investigación de Cáncer de Pulmón, hecha posible por la Asociación de Carolina del Norte del cáncer de pulmón (http://www.freetobreathe.org/) (LAB); la Fundación de Investigación del Cáncer de pulmón (http://www.lungcancerresearchfoundation.org/) (LAB); Fundación LUNGevity (http://www.lungevity.org/) (LAB); y la Fundación Sidney Kimmel para la Investigación del Cáncer (http://kimmel.org/) (LAB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. YF y YS son empleados de BioMarin Pharmaceutical Inc. JVH es miembro de los consejos asesores de AstraZenica, Abbvie, Novartis y Genentech. Esto no altera nuestra adhesión a las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es la forma más agresiva de cáncer de pulmón, con un 5 años tasa de supervivencia de sólo el 6% [1]. Hay aproximadamente 30.000 muertes por SCLC anualmente en los Estados Unidos (que representa el 13% de los cánceres de pulmón), por lo que solo el SCLC 8
ª causa principal de muerte por cáncer en los EE.UU. en 2011 [2, 3]. La mayoría de los casos de SCLC responden a la quimioterapia y la radiación inicialmente. Sin embargo, la recaída es casi universal, y en la mayoría de los pacientes aún más la terapia sistémica produce ninguna respuesta. A diferencia no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), SCLC no incluye números de tratamientos dirigidos con beneficio demostrado para los pacientes. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos, activos, y potencialmente dirigidos medicamentos para el tratamiento del SCLC representa una importante necesidad médica no cubierta.
Hemos informado anteriormente de que la poli-ADP ribosa polimerasa 1 (PARP1) se sobreexpresa en SCLC, identificando PARP como una diana terapéutica potencial en este tipo de cáncer [4]. Seguir trabajando por nuestro grupo ha demostrado que los inhibidores de la PARP1 /2 talazoparib (BMN 673), olaparib (AZD2281), y rucaparib (CO-338, AG 014699) tienen actividad como agente único en modelos preclínicos [4, 5]. Mientras que los inhibidores de PARP están en fase avanzada de desarrollo para el tratamiento de los cánceres de ovario (olaparib aprobado, rucaparib Fase 3), sobre la base de estos datos preclínicos, se llevan a cabo varios estudios clínicos de los inhibidores de PARP en SCLC para investigar el efecto de estos fármacos como agentes únicos o en combinación con quimioterapia (Fase I-talazoparib, la Fase II y olaparib veliparib) [6]. En el estudio de fase I de un solo agente talazoparib, se observó una respuesta parcial en un subgrupo de pacientes con CPCP refractario [7]. Sin embargo, al igual que con otros fármacos dirigidos, la identificación de los mecanismos asociados a la resistencia a los medicamentos innata y adquirida y combinaciones racionales para aumentar las tasas de respuesta y /o la duración es crítico para la optimización de la aplicación clínica de estos fármacos [7, 8].
en el trabajo de pre-clínico previo, utilizando un panel de líneas celulares de SCLC 8 correlacionamos sensibilidad línea celular a la inhibición de PARP con el perfil proteómico de cada línea celular [5]. Las líneas celulares con la mayor activación de la vía PI3K /mTOR fueron los menos sensibles a talazoparib; con -AKT fosforilada (p) (T308) y p-AKT (S473) como los mejores marcadores de resistencia a [5]. alteraciones genéticas en la vía PI3K /mTOR no son infrecuentes en SCLC [9, 10], con modificaciones normalmente se excluyen mutuamente en
PIK3CA
,
PTEN
,
AKT2
,
Akt3
,
Rictor
, o
mTOR
ha encontrado en el 36% de los pacientes [10]. informes preclínicos han demostrado inhibidores de PI3K como PIK75 y PF-4989216 que tiene actividad en modelos de SCLC con
PIK3CA
mutaciones, pero no
PTEN
deficiencia, lo que indica un posible papel de PI3K /mTOR-dirigidos La terapia en el CPCP [11, 12]. Relacionado con este hallazgo, los informes anteriores en el cáncer de mama han demostrado que el tratamiento con un retraso en el crecimiento del tumor inhibidor de PI3K, pero los indicadores de daño en el ADN, como la ribosa poli-ADP (PAR) [13, 14] aumentado. Mientras que la inhibición de PARP por sí sola en estos modelos de cáncer de mama sólo el crecimiento moderadamente atenuado, la combinación de PARP y la inhibición de PI3K era particularmente potente en la supresión de crecimiento [13, 14].
Como análisis proteómico reveló una correlación inversa entre la actividad de la PI3K /mTOR y la respuesta a talazoparib
in vitro
[5], la hipótesis de que la adición de inhibición /mTOR PI3K podría sensibilizar aún más a los inhibidores de PARP SCLC. Lo primero que investigó en líneas celulares de SCLC la respuesta intracelular a la inhibición de PARP, observando el aumento de la señalización PI3K /mTOR consecuencia de la inhibición de PARP
.
En este estudio se muestra por primera vez que los aumentos de señalización PI3K /mTOR consecuencia de la inhibición de PARP en SCLC y que esto puede ser conducido a través de una reducción de la quinasa de hígado B1 (LKB1) de señalización de los cambios validados por caída PARP1. En consecuencia, se investigaron los efectos antitumorales de la combinación de un inhibidor de PARP con un inhibidor de PI3K-específico en modelos preclínicos de SCLC. estudios de combinación de segmentación PARP y PI3K
in vitro
revelaron una interacción aditiva entre estos dos inhibidores en los ensayos de proliferación. Los estudios en animales revelaron que esta combinación tiene un efecto mayor que cualquiera de los fármacos en monoterapia para reducir el volumen del tumor, proporcionando una sólida justificación para el avance de esta combinación en los estudios clínicos en pacientes con CPCP.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
CEP líneas celulares humano COR-L88, DMS1114, DMS 153, DMS 53, DMS 79, H1048, H1092, H1105, H128, H1341, H1417, H1436, H146, H1672, H1836, H187, H1876 , h1930, H196, H1963, H2081, H209, H211, H2141, H2171, H2195, H2227, H2330, H250, H345, H378, H446, H510, H524, H526, H69, H719, H748, H774, H82, H841, H847 , H865, H889, y SHP-77 se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA) o Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); GEMM líneas celulares derivadas de KP1, KP3, KP11 y variantes KP12 [15] y xenoinjerto derivado del paciente (PDX) línea celular derivada de humanos NJH29 fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Julien Sage (Universidad de Stanford, Stanford, CA). Todas las células se cultivaron en medio sugerido suplementado con suero bovino fetal y penicilina /estreptomicina. Las células se pasaron de menos de 6 meses siguientes a la recepción.
El análisis de proteínas
Para RPPA y Western blot, las células se trataron por duplicado con 1μM olaparib (Selleck Chemicals, Houston TX), rucaparib ( Selleck Chemicals, Houston TX), o talazoparib (BioMarin Pharmaceutical Inc, Novato CA). Western blots se probaron para PARP1 (cs9542), mTOR pS2448 (cs2971), mTOR (cs2983), AKT pT308 (cs9271), AKT (cs9272) S6 pS240,244 (cs2215), S6 (cs2217), LKB1 (cs3050), AMPKα pT172 (cs2532), AMPKα (cs2532) (Cell Signaling Technlogy, Danvers MA), y actina (sc1616, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX).
array de proteínas de fase inversa
proteína lisados fueron se recoge en un tampón que contiene 1% de Triton X-100, 50 mmol /L de HEPES (pH 7,4), 150 mmol /L de NaCl, 1,5 mmol /L MgCl
2, 1 mmol /L EGTA, 100 mmol /L NaF, 10 mmol /L Nappi, 10% de glicerol, 1 mmol /L PMSF, 1 mmol /L Na
3Vo
4, y 10 mg /ml de aprotinina. Las muestras se cuantificaron y arrays de proteínas fueron impresos a partir de lisados y se tiñeron como se ha descrito previamente [4, 16]. En pocas palabras, las imágenes de las diapositivas se cuantificaron mediante el uso de MicroVigene 4.0 (VigeneTech, Carlisle, MA). Los datos en bruto a nivel de terreno fueron procesados mediante el paquete de R SuperCurve [17-19], que devuelve la concentración estimada de proteína (concentración en bruto) y una puntuación de control de calidad (QC) para cada diapositiva. Sólo se desliza con una puntuación de CC & gt; 0,8 se utilizaron para el análisis de aguas abajo. Los datos de concentración en bruto se normalizaron por medio de centrado de cada muestra a través de todas las proteínas para corregir el sesgo de carga.
Ensayos de proliferación
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 2.000 células por pocillo por triplicado para cada línea celular. Después de 24 horas, las células en cada pocillo se trataron durante 24 horas con un inhibidor de PARP (talazoparib) y /o inhibidores de PI3K (BKM-120, Selleck Chemicals, Houston TX) o con el control del vehículo. Cuatro días más tarde, la proliferación fue ensayada por Cell Titer Glo (Promega, Fitchburg, WI). Para los tratamientos de un solo fármaco, la concentración inhibitoria media (IC
50) Los valores se calcula por el software drexplorer [20]. Específicamente, para cada combinación de fármacos (en cada nivel de dosis), el efecto observado (o experimental) de la combinación se comparó con el efecto aditivo predicho. Los datos se presentaron posteriormente como un porcentaje del efecto experimental en relación con el efecto aditivo predicho (1,1 = + 10%; 1 = 0%; 0,9 = -10%). Por ejemplo, si el medicamento A reduce la proliferación en relación con 0.8 y el medicamento B a 0.7, entonces el efecto aditivo predicho sería 1 - ((1-0,8) + (1 a 0,7)) = 0,5. Si el (experimental) efecto observado de la combinación sobre la proliferación relativa es entonces 0,3, a continuación, el efecto observado es mayor que el efecto predicho de la combinación [(1-0,3) /(1 a 0,5) = 1,4]. El uso de un 10% por encima o por debajo del efecto aditivo predicho como una línea de corte, que luego se asigna a los siguientes grupos: Observado /predijimos & gt; = 1,1 mayor que la aditiva; Observada /predicho & lt; 0,9 = menos de aditivo; Observado /predicho ≤1.1 y ≥0.9 = aditivo. Para combinaciones de fármacos, el enfoque MacSynergy II [21] basado en el modelo de la dicha independencia [22] se aplicó para calcular diversos parámetros, como el volumen sinérgica, antagónica volumen, volumen general, y porcentaje de muerte adicional [23].
gene caída
Para desmontables proteína estable, las partículas lentivirales que codifican dos ARN de corta horquilla diferentes (shRNAs) de orientación y control de mezcla aleatoria PARP1 shRNA (pGIPZ vector lentiviral, Open Biosystems una división de Dharmacon /GE Healthcare, Lafayette CO) fueron seleccionados y designados como PARP1-shRNA-1, PARP1-shRNA2 y SCR-shRNA, respectivamente. Las secuencias PARP1 shRNA fueron los siguientes:
PARP1
-shRNA1: 5'-TAGTTGAACACACTTTCTT-3 '; PARP1-shRNA2: 5'-TGATGTTCCAGATCAGGTC-3 '. Los
STK11
secuencias (LKB1) shRNA fueron los siguientes LKB1-shRNA1: 5'-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 '; LKB1-shRNA2: 5 'ATTTATTGCCAAATTTGGG-3'. Las partículas de lentivirus shRNA se incubaron con las células diana durante 24 horas, y las células se seleccionaron a continuación en medio de cultivo apropiado que contiene puromicina (2 mg /ml) durante 3 semanas. Las colonias resistentes se expandieron, y la eficiencia caída fue validado por QRT-PCR y Western Blot.
ATP cuantificación
Para evaluar la disponibilidad de ATP, las concentraciones globales de la ATP se midieron en células tratadas o no tratados con un inhibidor de la PARP. las concentraciones de ATP se analizaron mediante el Sistema ATPlite luminiscencia según las instrucciones del fabricante (PerkinElmer, Inc., Waltham MA).
poli ADP-ribosa (PAR) de ensayo
Para evaluar el efecto de la PARP /la inhibición de PI3K en la actividad PARP1
in vivo
, lisados se prepararon a partir xenoinjertos de 2 horas después de la administración de fármacos en el día 3 del tratamiento. Los xenoinjertos fueron producidos por el método descrito en la siguiente subsección. los niveles de PAR se analizaron por ELISA según las instrucciones del fabricante (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD).
Los modelos animales
hembra Balb /c ratones desnudos fueron obtenidos de Shanghai Lingchang biotecnología Co. LTD (Shanghai, china) o Harlan Laboratories (Houston, TX). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los procedimientos relacionados con el manejo de los animales, el cuidado y el tratamiento en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de Shanghai Chempartner (número de protocolo A998HL0001) o por la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center IACUC (número de protocolo RM00001191-RN01). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales. células NCI-H209 SCLC humanas (5 × 10
6 células) o NCI-H1048 células tumorales (3 × 10
6 células) en 0,2 ml de una mezcla 1: se inyectaron mezcla 1 de medio y Matrigel por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón (36 animales por línea celular). Cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm
3 volumen medio, animales (6 por grupo) se trataron oralmente con vehículo, talazoparib (0,25 mg /kg), o BKM-120 (25 mg /kg) al día durante 28 días. El volumen del tumor y el peso del animal se midieron cada 2 a 3 días. Otros 3 animales por cada grupo fueron tratados durante 3 días; xenoinjertos de tumores fueron cosechadas a partir y se congelaron rápidamente 2-3 horas post-tratamiento en el día 3 para su posterior análisis. La eficacia del tratamiento se determinó comparando el volumen del tumor de los ratones tratados con el fármaco (? T) con la de los ratones tratados con vehículo (? C) utilizando la relación (? T /? C) en el día 19 de NCI-H1048 y día 25 para NCI-H209 [ ,,,0],24] (última medición de los tumores tratados con vehículo).
resultados
inhibición de PARP
in vitro
aumenta la señalización de PI3K en SCLC
Para identificar las vías moduladas por la inhibición de PARP, se realizó array de proteínas de fase inversa (RPPA), que mide cambios en 137 proteínas totales y fosforilados en las vías oncogénicas clave como PI3K, MEK y la reparación del ADN en un panel de líneas celulares de SCLC tratados con vehículo o uno de los olaparib inhibidores de PARP ( AZD2281), rucaparib (CO-338, AG 014 699), o talazoparib (BMN 673) durante 24 horas. Análisis de lisados de células recogidas-tratamiento previo y posterior mostró que la fosforilación (activación) de las proteínas en la vía PI3K /mTOR se aumentó en las líneas celulares tratadas. análisis RPPA reveló que, de 137 proteínas totales y fosforilados medidos, seis de los ocho proteínas que se upregulated más significativamente en respuesta a la inhibición de PARP (FDR ≤0.1) estaban en la vía PI3K /mTOR (incluyendo p-mTOR, p-AKT, y p-S6 [p≤0.02] (Fig 1A y 1B) niveles de proteína total se mantuvieron sin cambios por RPPA (p≥0.27)). Talazoparib, que tiene una 10 veces menor IC
50 aproximadamente en SCLC que olaparib o rucaparib, indujo una respuesta similar en las células H69, según lo exhibido por el aumento de p-AKT T673 y p-S6 S240,244 después del tratamiento (Fig S1 ).
(a) la agrupación jerárquica de las proteínas identificadas en lisados de líneas celulares de SCLC (H69, H82, H841) tratados con vehículo o olaparib durante 24 horas reveladas aumento de la actividad de la vía PI3K /mTOR siguientes inhibición de PARP ( FDR≤0.1, equivalente p-value≤0.037). (B) las proteínas fosforiladas individuales en la vía PI3K /mTOR (P-mTOR p-AKT y p-S6 quinasa) se incrementan después del tratamiento, ya sea con o olaparib rucaparib (p≤0.02). (C) Los lisados de líneas celulares tratadas con olaparib o rucaparib frente al vehículo durante 24 horas muestra la inactivación de la vía LKB1 (LKB1, pAMPKα, y pTSC2; p≤0.042).
impulsa la inhibición de PARP PI3K /la activación de mTOR a través del ATP /LKB1
Nuestros estudios anteriores mostraron que, además de PARP, las líneas celulares de SCLC también sobreexpresan la quinasa de hígado B1 (LKB1) [4]. La vía LBK1 es un mecanismo de respuesta al estrés que se activa en respuesta a las tensiones metabólicas tales como el agotamiento de ATP para proteger a la célula [25]. Una consecuencia de la actividad de LKB1 es la supresión de la vía de mTOR [25]. análisis de las células de SCLC RPPA tratados con olaparib reveló una disminución de la actividad de la vía de LKB1 (Fig 1A). Un análisis más detallado (Fig 1C) mostró que el tratamiento con cualquiera de olaparib o rucaparib redujo significativamente la expresión de LKB1 (p & lt; 0,001). La fosforilación de abajo objetivos de LKB1, pAMPKα y pTSC2, también se redujo significativamente después del tratamiento con inhibidores de PARP (p = 0,022 y p = 0,042 con olaparib; p = 0,013 y p = 0,034 con rucaparib para pAMPKα y pTSC2, respectivamente; AMPK total y TSC los niveles de proteína se mantuvieron sin cambios según lo medido por RPPA, p≥0.81).
los inhibidores de PARP trabajan a través de tanto la inhibición de PARP y catalítica de un fenómeno llamado atrapamiento PARP-ADN PARP, donde queda atrapado en el sitio de una rotura de cadena doble (OSD) OSD prevenir que sea reparado y causar citotoxicidad directa [26]. Por lo tanto, para examinar el efecto de la inhibición de PARP catalítica específicamente, derribaron el
PARP1
génica mediante transducción lentiviral shRNA en un panel de líneas celulares de SCLC, incluyendo una línea celular representativa del análisis farmacocinético in vitro y líneas celulares utilizado en los estudios con animales (descrito a continuación). desmontables PARP nos permitió no sólo miramos directamente a la inhibición catalítica de PARP1, pero también para evitar potenciales fuera de objetivo efectos de los inhibidores farmacológicos. Como se muestra en la figura 2A, esta caída redujo significativamente la expresión de PARP1 en comparación con shRNA scramble (control). Un análisis más detallado de transferencia de western de
PARP1
líneas celulares desmontables shRNA mostraron un aumento de mTOR, AKT y S6 actividad relativa a desordenar el control shRNA en todas las líneas celulares sometidas a prueba, a pesar de H69 H1048 y que tiene la activación de mutaciones en
PIK3CA
. Confirmamos nuestras observaciones en H69 desmontables células mediante el uso de un panel de proteínas limitada analizar RPPA seleccionados (S2) Fig. En este análisis, el segundo y tercer diferencias más significativas entre scramble- y
PARP1
células transducidas-shRNA se redujeron PARP1 y el aumento de p-S6 (de 35 hits en
PARP1
KD1 y 52 en KD2 en FDR≤0.05). El observado aumento en PI3K /señalización con farmacológico a corto plazo y la pérdida genética a largo plazo de la función PARP1 mTOR refuerza la noción de que la activación /mTOR PI3K es un efecto que se relaciona con la inhibición de PARP catalítica en lugar de captura de PARP-ADN. La nueva observación de que la inhibición de PARP o desmontables activa la vía PI3K /mTOR en SCLC (Figura 1) es consistente con nuestro informe publicado previamente que esta vía es el marcador más fuerte de la resistencia de línea de base a la inhibición de PARP [5].
(a) los lisados de PARP1 desmontables por shRNA en líneas celulares de SCLC (H69, H1048, H209) se traduce en aumento de la actividad de la vía PI3K /mTOR en relación con Scramble (SCR) shRNA como se determinó por Western blot. (B)
PARP1
células shRNA desmontables (KD1 y Kd2) tenían menor LKB1 y expresión pAMPKα que las células shRNA revueltos. células H69 y H1048 (C) tratados con olaparib mostraron un aumento de [ATP], medido por el ensayo ATPlite. Los datos se presentan como media ± SEM; ** P & lt; 0,02, *** p & lt; 0,01. (D) Un modelo propuesto de la activación de la vía PI3K consecuencia de la inhibición de PARP.
Un análisis más detallado de la actividad PARP1 sobre la vía de LKB1 en líneas celulares de SCLC mostró que la expresión y la fosforilación de LKB1 AMPKα eran más bajos en
PARP1
desmontables células que en las células tratadas con scramble shRNA (figura 2B).
PARP cataliza la polimerización de ADP-ribosa a partir de NAD + para unir poli ADP-ribosa (PAR) a las proteínas de los donantes en un proceso llamado PARylation [27]. Como PARylation por PARP es un evento ATP-intensiva, la hipótesis de que los resultados de inhibición de PARP en aumento de ATP disponible, que a su vez resulta en la disminución de la actividad de la vía LKB1 y por lo tanto una pérdida de la supresión /mTOR PI3K. El uso de un ensayo basado en luminiscencia, que mide los niveles globales de ATP en las células de SCLC antes y después del tratamiento con un inhibidor de PARP. Como se muestra en la figura 2C, las concentraciones de ATP se aumentaron después del tratamiento con olaparib (1μM, p & lt; 0,001 a 1 hora). El mecanismo propuesto para la forma en la inhibición de PARP puede estimular la vía PI3K /mTOR a través de una mayor disponibilidad de ATP y la supresión de la vía de LKB1 se muestra como la figura 2D. Estas observaciones están de acuerdo con un informe reciente que PARP1 mediada ionizante autofagia inducida por la radiación se produce a través de la activación de la LKB1 /AMPK /mTOR [28], así como los informes que muestran que la activación de PARP1 siguiente alquilantes daño en el ADN activa la vía de LKB1 para suprimir PI3K a través de la depleción de ATP, un efecto que se pierde después de la inhibición PARP1 [29, 30].
Talazoparib y un inhibidor de PI3K se combinan de forma aditiva en el CPCP
Ampliando nuestras observaciones anteriores de que 1 ) sensibilidad a la inhibición de PARP se relaciona inversamente con la actividad vía PI3K /mTOR [5] y 2) la inhibición de PARP aumento de señalización PI3K /mTOR, que puso a prueba la eficacia anti-proliferación de un inhibidor de PI3Kα (BKM-120) en nuestro panel de 50 SCLC líneas celulares. BKM-120 (una clase de pan-1 P110α /β /γ /δ inhibidor) fue elegido porque se utilizó en un estudio de una combinación de inhibidores de PARP /PI3K en el cáncer de mama /ovario (ClinicalTrial.gov Identificador: NCT01623349) y porque otro inhibidor-P110 específica (PIK75) se ha demostrado que tiene actividad como agente único en algunas líneas celulares de SCLC [12]. Como se muestra en la figura 3A, IC
50 fue alcanzado en la mayoría de las líneas celulares ensayadas (44/50), 35 de los que están en una dosis clínicamente alcanzables menor que el día informado 1 C
max de 2.3μM [31 ].
(a) ensayos de proliferación mostraron una gama de sensibilidades a BKM-120 a través del panel línea de células SCLC. líneas celulares con
PTEN
mutaciones /deleciones son de color rojo y aquellos con
PIK3CA mutaciones
verdes; clínica C
max se indica con una línea de trazos horizontal.#Indica IC
50 no alcanzó a dosis ensayadas. (B) Resumen de los
PI3K /mTOR
mutación y
MYC
amplificación estado de las líneas celulares (véase la figura S3 para los nombres de líneas celulares). (C) Las líneas celulares, ya sea con una mutación en la vía PI3K /mTOR (MT) o un
MYC
de amplificación (AMP) eran más sensibles a BKM-120 de las células sin una mutación o amplificación (WT y NO AMP; ** p & lt;. 0.02). descubrimiento (D) utilizando los perfiles de biomarcadores RPPA de 47 líneas celulares de SCLC correlacionada con la expresión de la proteína BKM-120 IC
50 para identificar los marcadores predictivos de la respuesta. los datos de proliferación se presentan como media ± SEM.
Para determinar el papel que las mutaciones de la vía PI3K /mTOR pueden desempeñar en la sensibilidad a la BKM-120, se identificaron líneas celulares con tales mutaciones. Las células con
PIK3CA
mutaciones (n = 3, se indica en verde en la figura 3A) se asociaron con menores IC
50 valores, lo que indica, como era de esperar, que las células que son más dependientes de PI3K /mTOR señalización de supervivencia son más sensibles a un inhibidor de PI3K. También se identificaron
AKT2
,
Rictor
, y
mTOR
mutaciones en líneas celulares que eran sensibles a BKM-120. Las células con
PTEN
alteraciones (n = 7, se indica en rojo en la figura 3A) se distribuyeron en toda la gama de sensibilidades, lo que implica que
PTEN
alteraciones no se correlacionan con la sensibilidad. Las frecuencias de las mutaciones en estos cinco genes (que se resumen en la figura 3B y la figura S3) son similares a los publicados en un reciente estudio de muestras de biopsia de SCLC [10]. Cuando se agrupan, las líneas celulares con mutaciones de la vía PI3K /mTOR tenían significativamente menor IC
50 valores a BKM-120 que las células no mutadas (Figura 3C, p = 0,01).
Para identificar posibles marcadores proteómicos de respuesta a BKM-120, se analizó la correlación entre el CI
50 a BKM-120 y los niveles de expresión basales de 146 proteínas totales o fosforilada por RPPA. Como se muestra en la figura 3D, la correlación Spearman identificó la expresión de proteínas cMyc como el marcador superior de sensibilidad a la BKM-120 (p & lt; 0,001); otros significativa (p & lt; 0,05) los marcadores de sensibilidad incluyen p-cMyc, p-AMPKα, y p-ACC1. Un análisis más detallado de los datos de sensibilidad BKM-120 reveló que las líneas celulares con un conocido
MYC
amplificación tenían un CI significativamente menor
50 (p = 0,01, Figura 3C), validando el marcador proteómico. Entre los marcadores más fuertes de la resistencia a BKM-120 eran proteínas que implican a la /ERK vía MAPK (pERK1 /2 (T202, Y204) Rho = 0,358, p = 0,014; pGSK3α /β (S21,9) Rho = 0,318, p = 0,032 ; pMAPK (T202, Y204) Rho = 0,317, p = 0,032). La activación de la vía MAPK /ERK después de la inhibición de PI3K se ha observado en varios tipos de cáncer [32], incluyendo NSCLC [33] y el cáncer de mama [32, 34]; este efecto puede ser mediado a través de la pérdida de efecto inhibidor de AKT en Raf [35]. Más allá de la vía MAPK /ERK, los marcadores más fuertes de resistencia a BKM-120 eran AKT y p-BAD (p & lt; 0,001) Curiosamente, BKM-120 IC
50 valores no mostró una fuerte correlación con nuestra puntuación PI3K previamente publicado [5] (Rho = 0,101, p = 0,51), que es coherente con las observaciones publicadas de que la sensibilidad a pictilisib (GDC0941, un inhibidor /δ PI3Kα) no mostró correlación con la puntuación de PI3K en un panel de 60 carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas líneas celulares [36]. Estas observaciones sugieren que la activación de MEK (u otras vías de compensación /escape) puede ser más importante que la actividad de la vía PI3K basal en la determinación de la sensibilidad a la inhibición de PI3K.
La combinación de inhibidores de PARP y PI3K se ha informado de que se de gran actividad en modelos preclínicos (xenoinjertos derivados del paciente y un modelo de ratón genéticamente modificado espontánea
BRCA1 /Trp53
recorte) de cáncer de mama [13, 14]. Basándose en estos resultados, un ensayo clínico que prueba la combinación del inhibidor de la PARP olaparib y un inhibidor de PI3K (pan-P110 BKM-120 o BYL719 específica P110α) se inició de mama y cáncer de ovario (NCT01623349). Los datos preliminares demuestran la tolerabilidad de la combinación [37] y el beneficio clínico en todos los niveles de dosis en al menos el olaparib + BKM-120 cohorte [38]. Por lo tanto, probado los efectos de una combinación de talazoparib (inhibidor de PARP) y BKM-120 (inhibidor de PI3K) a dosis clínicamente alcanzables en un panel de líneas celulares de SCLC con una gama de sensibilidades (sensible, intermedio y resistente) a ambos BKM-120 y talazoparib (sensibilidad a la talazoparib se muestra en la figura S4). Seis dosis de talazoparib (rango de 0,1 a 30 nM) y tres dosis de BKM-120 (rango de 0,1 a 1 M) se ensayaron en cada línea celular. En cada nivel de dosis, se comparó el efecto sobre la proliferación con el efecto aditivo predicho. las tasas de proliferación que estaban dentro del 10% del efecto aditivo predicho cuando se consideró "aditivo", mientras que con las tasas de proliferación más de un 10% por encima o por debajo del efecto aditivo predicho fueron considerados "menos de aditivo" o "mayor que la aditiva" (figura 4A ). Como ejemplo, la figura 4A muestra las líneas celulares representativas con una respuesta "aditivo" (H211, DMS-79) o una respuesta (h1930) "mayor que aditivo". Con este enfoque, hemos demostrado una interacción aditiva en 49 de las 50 líneas celulares de SCLC probadas.
(A) Los ensayos de proliferación utilizando dosis clínicamente alcanzables de talazoparib (6 dosis, intervalo 0,1-30 nm) y BKM-120 (3 dosis, rango de 0,1 a 1 M) mostraron una interacción aditivo en la mayoría de las 50 líneas celulares de SCLC probadas. Los ejemplos muestran las respuestas de aditivos (H211, DMS-79), y una respuesta mayor a la aditivo (h1930). (B) Grado (porcentaje) de inhibición de arriba (verde) o por debajo (rosa) el efecto aditivo predicho (púrpura) para cada línea celular en todas las dosis clínicamente alcanzables. (C) Observado proliferación relativa al efecto aditivo predicho en dosis individuales de BKM-120.
Para tener una visión global de la interacción entre los dos fármacos para cada línea celular en todas las dosis, se realizó una más análisis que combina el grado (porcentaje) de inhibición por encima o por debajo del efecto aditivo predicho a partir de todas las combinaciones posibles. Uso del área bajo la curva (volumen), se comparó la observada y prevista de valores aditivos (como porcentaje relativo al valor de referencia) a para cada combinación (con una unidad de M
2%) los valores positivos y negativos se suman entonces por separado para cada línea celular (figura 4B). Para todos, pero tres líneas celulares, el efecto global de la talazoparib + combinación BKM120 estaba dentro de un volumen de ± 10%, que cayó dentro del efecto aditivo predicho, más el apoyo a la conclusión de que estos fármacos eran principalmente aditivo
in vitro
Drs.