Extracto
Antecedentes
Las células madre del cáncer (CSC) son un subconjunto de las células tumorales con capacidad de auto-renovación y generan las diversas células que componen el tumor. El objetivo de este estudio es evaluar el valor pronóstico de los CAC en una población muy homogénea de cáncer de colon en estadio II.
Métodos
Un centenar de pacientes en estadio II cáncer de colon tratados por el mismo equipo quirúrgico entre 1977 y 2005 se analizaron retrospectivamente. Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia adyuvante. Inmunohistoquímica expresión de CD133, NANOG y CK20 se anotó, utilizando cuatro niveles: & lt; 10%, 11-25%, 26-50% y & gt; 50% de positividad. De Kaplan-Meier y prueba de análisis de log rank se utilizó para comparar la supervivencia.
Resultados
La edad promedio de los pacientes fue de 68 años (pacientes tenían entre 45-92 años de edad) y mediana de seguimiento fue 5,8 años. No había enfermedad recurrente en 17 (17%); expresión CD133 (definido por & gt; 10% de positividad) se muestra en 60% de los tumores, en 95% de NANOG y 78% para CK20. No se encontró correlación entre los niveles de expresión de CD133, NANOG o CK20 y la supervivencia libre de recaída (RFS) o la supervivencia global (SG). Sin embargo, se encontró una correlación estadísticamente significativa entre los factores establecidos patológicos pronósticos y la SSR y la SG.
Conclusiones
Stem Cell cuantificación definida por CD133 y la expresión de NANOG no tiene correlación con RFS o el sistema operativo en esta cohorte de cáncer de colon en estadio II
Visto:. Vaz MA, Martínez JC, Devesa JM, Trill JD, Abraira V, Riquelme A, et al. (2014) Valor pronóstico de la cuantificación de células madre en la Etapa II del cáncer de colon. PLoS ONE 9 (2): e88480. doi: 10.1371 /journal.pone.0088480
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Septiembre, 2013; Aceptó 8 de enero de 2014; Publicado: 21 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Vaz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es una de las causas más comunes de. muerte por cáncer en todo el mundo y la supervivencia se ve afectada por la recurrencia local, así como el desarrollo de la enfermedad metastásica.
la teoría de las células madre del cáncer se basa en el supuesto de la existencia de una pequeña población de células iniciadoras del cáncer, que es exclusivamente responsables del crecimiento y el mantenimiento de todo el tumor. Estas células tienen una tasa proliferativa baja, alta capacidad de auto-renovación y propensión a diferenciarse en células tumorales en proliferación activa y que son resistentes a la quimioterapia y la radiación. Estas células han sido reportados en diferentes tipos de cáncer.
Los resultados recientes de la investigación sugieren que el modelo de cáncer de células madre también se aplica para el carcinoma de colon. Ricci-Vitiani y O'Brien informaron que las células CD133 positivas de cáncer colorrectal presentan las propiedades de las células cancerosas iniciar con auto-renovación y alto potencial tumorigénico. Estas células madre cancerosas expresan marcadores de pluripotencia CD133 y como NANOG y no expresan marcadores de diferenciación como cytokeratin20 (CK20) [1], [2], [3].
El valor pronóstico potencial de las células madre cancerosas en el cáncer colorrectal ha sido estudiado con resultados contradictorios. Sin embargo algunas de estas series se basan en situaciones heterogéneas, que implican el cáncer rectal y de colon y tumores diferentes etapas (I-IV). El objetivo de este estudio es evaluar el valor pronóstico de los CAC en una población muy homogénea de cáncer de colon en estadio II.
Materiales y Métodos
Un total de 100 muestras confirmadas patológicamente se obtuvieron a partir de colon los pacientes con cáncer en estadio TNM II, que fueron tratados quirúrgicamente entre 1977 y 2005 en el hospital Universitario Ramón y Cajal. Para reducir los efectos del tratamiento adyuvante en el pronóstico ninguno de los pacientes incluidos recibieron quimioterapia adyuvante. Todos los pacientes fueron seguidos por la supervivencia libre de recurrencia y la supervivencia global. El período de seguimiento se calculó a partir de la fecha de la cirugía hasta 2010. La recurrencia se definió como reaparición del tumor inicial; y ambos metástasis o recurrencia local se consideran signos de recidiva tumoral. La supervivencia global se definió como el tiempo desde la cirugía a la muerte o en el punto cuando el paciente fue la última registrada de vivir. En este estudio también se registraron factores clínicos pronósticos conocidos. Los pacientes de alto riesgo se consideraron aquellos con al menos una de las siguientes características: menos de 12 ganglios linfáticos presentes en la pieza quirúrgica, el tumor T4, la invasión linfovascular y tumores mal diferenciados. La clasificación TNM se utilizó para la estadificación patológica y se utilizó la clasificación de la Organización Mundial de la Salud para la clasificación patológica. La investigación cuenta con la aprobación del comité de ética (Hospital Ramón y Cajal de la Universidad). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para el uso de la muestra en la investigación.
Examen histológico
Los especímenes fueron recuperados de los archivos de patología del Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid, España, y revisados histológicamente. Los bloques de parafina fueron recuperados para construir matrices de tejido que contienen cilindros de tejido diámetro de 1,5 mm de cáncer de colon y muestras de control. Cada bloque de parafina array tejido contenía al menos 2 muestras de cada caso con el fin de tener un control transversal de la expresión de la señal. Se seleccionaron las zonas más representativas de cada tumor para el estudio. tejido linfoide reactiva (amígdalas) se utilizaron como controles negativos de la expresión y la incorpora por triplicado en cada matriz de tejido. características histopatológicas fueron revisados de forma independiente. Esto fue seguido por la observación común en un microscopio multicabezal, donde se resolvieron las discrepancias.
La inmunohistoquímica (IHC)
anti-CD133 conejo anticuerpo monoclonal (Cell Signaling Technology) y NANOG humano de cabra policlonal hormiga ( Novus Productos Biológicos), se utilizaron para identificar marcadores de células madre. Anti-Cytokeratin20 (CK 20) anticuerpo monoclonal de ratón (Dako, Dinamarca), se utilizó para evaluar las células epiteliales diferenciadas. La tinción inmunohistoquímica se realizó siguiendo el método de conejo /ratón Dako real In Vision (Dako, Dinamarca). Como control positivo de la expresión del modelo y la especificidad de la señal, se utilizó secciones de tejido cerebral fetal humano incluyendo el epitelio neuro ventricular cerebral. Este fue el primer lugar donde se detectó la expresión de CD133 en el borde apical de las células neuroephitelial [4]. Más tarde, la liberación en forma de partículas de membrana CD133 positivas, se observó en los fluidos corporales humanos y de fluidos diferentes ventriculares, incluyendo intestino [5]. La incubación con un anticuerpo no relacionado fue empleado como control de la preservación y recuperación antigénica. La incubación omitiendo el primer anticuerpo se utilizó como control negativo de una tinción no específica del sistema de detección.
Examen inmunohistoquímico
examen La inmunohistoquímica se realizó a partir de secciones de tejidos embebidos en parafina que incluyeron las áreas tumorales más representativos . Se analizaron CD133, NANOG y CK20. Los tumores se les dio una puntuación semicuantitativa utilizando cuatro niveles: & lt; 10%, 11-25%, 26-50% y & gt; 50% de positividad. Se definió una muestra positiva si hubo & gt;. 10% de células positivas
Análisis estadístico
El análisis de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la supervivencia específica del cáncer y los grupos se compararon con la prueba de log-rank. Los procedimientos estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 15.0, y p & lt; 0,05 era estadísticamente significativa considerer. Todos los análisis se realizaron utilizando el paquete estadístico para Ciencias Sociales (SPSS) Software.
Resultados
Los resultados Clinicopathological
Los hallazgos clínico-patológicos se enumeran en la Tabla 1. La mediana de edad los pacientes fue de 68 años (pacientes van desde 45 a 92 años), el 53% eran varones y el 47% eran mujeres.
se registraron los hallazgos clínico-patológicos de alto riesgo conocidos para la recurrencia, definidos por menos de 12 ganglios linfáticos presentes en la pieza quirúrgica, tumores T4, la invasión linfovascular y los tumores pobremente diferenciados, y los pacientes se clasificaron en la categoría de alto riesgo si había uno o más de estos factores de riesgo o en la categoría de bajo riesgo si no hay factores de riesgo. Cincuenta y dos por ciento eran de alto riesgo y el 48% eran pacientes de bajo riesgo. El treinta y cinco por ciento de los pacientes tenían & lt; 12 ganglios linfáticos de la pieza quirúrgica. Sólo el 4% eran T4, el 9% de los pacientes tenían histología pobremente diferenciado y el 11% tienen invasión linfovascular. En el momento de la última visita de seguimiento el 17% de los pacientes tuvieron recurrencia de la enfermedad y el 61% estaban vivos; 36% estaban muertos, el 16% de cáncer colorrectal y el 20% por otras causas.
El antígeno CD133 Ubicación del cáncer de colon en
El patrón de reactividad inmunohistoquímica positiva para CD133 observó en las células neuroepiteliales periventricular (control casos) (Fig. 1), está en mantener a la observada en estudios anteriores [5], y actúa como un control positivo de la especificidad de la señal. El antígeno CD133 ya ha sido demostrado que se ubicará en apicales protusiones membrana plasmática de la línea celular de cáncer culturas Caco-2 [5].
Se observó una tinción polar del CD133 confinada a la célula apical luminal superficie de las glándulas de cáncer colorrectal. Por lo general, varias células CD133 positivas fueron agrupados juntos. la expresión de CD133 tendía a ser pronunciado cerca del margen invasiva de los tumores.
No se observó expresión de la proteína CD133 en el borde apical de las células y glándulas cáncer de colon, con frecuencia vertimiento de escombros CD133 positivas en las glándulas luminales (Fig. 2 ). grupos ocasionales de células neoplásicas mostraron toda expresión citoplásmica positiva (Fig. 3).
No hay señal positiva CD133 se encontró en ninguna de las muestras de tejido de la amígdala, ni en la superficie de la mucosa de ellos, utilizado como control negativo. Esta regla la posibilidad de falsos positivos, o la unión no específica del anticuerpo CD133 utilizado, de las mucosas y /o espacios luminales.
Al mirar a las secciones de tejido consecutivos, se comparó la expresión de proteínas CD133 y CK20 (Fig. 4 ). Los campos que contienen las células CD133 positivas generalmente mostraron expresión de la proteína CK20 débil o no, mientras que las áreas con alta expresión de CK20 fueron por lo general CD133 negativo. Sin embargo grupos de células neoplásicas que expresan al mismo tiempo, se mostró CD133 y CK20 también (Fig. 5).
Expresión inmunohistoquímica de CD133
Se detectó la expresión de CD133 en el 100% de los pacientes . El cuarenta por ciento de los pacientes tenían & lt; 10% de positividad; 22% de los pacientes tenían 11-25% de positividad; 6% de los pacientes tenían 26-50% de positividad y el 22% de los pacientes tenían & gt;. 50% de positividad
Todos los 100 pacientes tuvieron un seguimiento de la supervivencia para analizar la expresión de CD133 como factor pronóstico. El período medio de seguimiento fue de 5,8 años. De los 100 pacientes, el 16,3% murió de su cáncer y el 20,4% por otras causas. Hubo 7 casos de recidiva local, 11 casos de metástasis a distancia.
libre de recurrencia curvas de supervivencia no fueron diferentes entre los diferentes niveles de expresión de CD133 positividad. Curva de Kaplan-Meier para la supervivencia global no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos (fig. 6).
Expresión NANOG
NANOG expresión nuclear y citoplásmica se detectó en el 99% de los pacientes . Cinco pacientes tenían & lt; 10% de positividad; 9 pacientes tenían 11 a 25% de positividad; 34 pacientes tenían 26-50% de positividad y 51 pacientes tenían & gt; 50% de positividad. La tinción positiva se observó principalmente en que las células epiteliales neoplásicas, muchos de ellos coincidentes con las células CD133 positivas. Sin embargo, se demostró que NANOG positivo /CD133 células neoplásicas negativos. Por otra parte, la expresión de NANOG también se observó en las células del estroma neoplásicas (datos no mostrados).
de Kaplan-Meier curva de recurrencia y la supervivencia global no mostró diferencias estadísticas entre los diferentes niveles de expresión (Fig. 7).
expresión CK20
se detectó la expresión de CK20 en el 78% de los pacientes. El veintidós por ciento de los pacientes tenían & lt; 10% de positividad; 29% de los pacientes tenían 11-25% de positividad; 26% de los pacientes tenían 26-50% de positividad y el 23% de los pacientes tenían & gt;. 50% de positividad
curva de Kaplan-Meier de recurrencia y la supervivencia no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos de expresión
.
La relación entre los factores clínico-patológicos conocidos de alto riesgo para los pacientes, que se define por tener al menos uno de los siguientes: menos de 12 ganglios linfáticos presentes en la pieza quirúrgica, tumores T4, la invasión linfovascular y tumores poco diferenciados, y la recurrencia y la supervivencia eran analizado. Se encontró una correlación estadísticamente significativa entre los factores conocidos clínicos y SSR y la SG (p = 0,034) (Fig. 8).
Discusión
CD133 es el epítopo de una forma glicosilada de prominin-1 humana, que es un miembro de la glicoproteína transmembrana pentaspan [1], y la expresión de CD133 se ha informado de que se localizada en las células normales neonatal y adulto precursor, así como células de cáncer de iniciar [2], [3]. Sorprendentemente, prominin-1 se asocia específicamente con protusiones membrana plasmática [4]. De hecho, durante la neurogénesis, las partículas que expresan CD133 se han mostrado en la lumina tubo neural, donde la liberación de CD133 expresar partículas de membrana parece ser un evento generalizada [6]. Además, el CD133 humano vástago antígeno de células también se expresa por diferentes células epiteliales humanas, incluyendo intestino, y dirigido a protusiones membrana plasmática [5]
.
CD133 que se considera actualmente un marcador útil para identificar células madre cancerosas en el cáncer colorrectal. Es de interés en cuanto a si las células CD133 positivas pueden considerarse como un factor pronóstico. En este estudio se ha analizado la expresión inmunohistoquímica de CD133 y se evaluó la supervivencia en una serie amplia de cáncer de colon en estadio II y hemos encontrado que la expresión de CD133 no fue un factor de riesgo independiente asociado con la recurrencia o la supervivencia del paciente.
La relación entre la expresión de CD133 y el pronóstico de los carcinomas colorrectales se examinó anteriormente. Horst
et al
informó de que la expresión de CD133 es un marcador independiente de pronóstico [7], mientras que este tipo de correlación no fue observado por Kojima
et al
[8]. Sin embargo algunas de estas series se basan en situaciones heterogéneas, que implican el cáncer rectal y de colon y tumores diferentes etapas (I-IV). Li
et al
analizó un grupo IIIB homogénea (104 pacientes) y demostró que las células de cáncer positivo CD133 contribuyeron a la progresión del cáncer de colon [9]. Nian Hua-Zang
et al
analizó un grupo de cáncer de colon en estadio III II y la fundación de una correlación negativa la supervivencia en pacientes con co-expresión con CDXCR4 y CD133 [10].
La discrepancia entre los diferentes estudios podrían ser derivados de cantidad inadecuada paciente y el estadio del tumor mixto (etapa I a IV y cáncer de colon y rectal).
por otro lado, es improbable que el CSC se pueden caracterizar por sólo un marcador . propiedades de células madre han sido recientemente reportado en las células CD133 negativos, también. Por lo tanto, las células tumorales positivas CD133 no se pueden representar toda la población iniciadoras del cáncer. Una combinación de marcadores de superficie celular se necesita para la definición de las células madre de cáncer de colon. Sin embargo, la población de células madre del cáncer es heterogénea. Por lo tanto, los niveles de expresión de los diferentes marcadores de células madre de cáncer es variable, como resultado de la diversidad función biológica de cada uno de ellos.
NANOG, un factor de transcripción del homeodominio, es un regulador esencial para la promoción de la auto -Renovación de células madre embrionarias y la inhibición de su diferenciación. Estudios anteriores indicaron que NANOG se expresa en células de cáncer de colon, y sugirieron que su expresión contribuye a la proliferación de células de cáncer de colon [11]. Por otra parte, varios estudios han demostrado que NANOG regula diferentes funciones del desarrollo del cáncer, tales como la proliferación de células tumorales, fármaco-resistencia y la comunicación de células de cáncer con el estroma circundante, dando lugar a la motilidad celular, la transición epitelial-mesenquimal y la evasión inmune [12].
decidió analizar NANOG en esta cohorte de pacientes. expresión NANOG y CD133 se observó en el mismo subconjunto de células neoplásicas. Sin embargo, los niveles de expresión de NANOG eran más altos que los de CD133, tal como se determina por NANOG positivo /CD133 células neoplásicas negativos, que se mostraron también. Además, la expresión de NANOG también se observó en las células del estroma, probablemente relacionado con la función de comunicación microambiente.
No se encontró correlación entre CD133 o expresión de NANOG y supervivencia (supervivencia libre de recidiva y la supervivencia global).
por lo tanto, CD133 propias células positivas puede no tener la capacidad biológica asociada con potencial maligno en el cáncer colorrectal.
estudios anteriores utilizando suspensiones de células de muestras de cáncer de colon demostraron que las células CD133 positivas fueron CK20 negativo [3]. En nuestra cohorte de 78% de las muestras fueron positivas CK20 (definido por & gt; 10% de positividad), y también no se encontró correlación con la supervivencia
Hay varios factores que podrían explicar las discrepancias con los informes anteriores: a.) Etapas tumor mixto donde analizamos una muy homogénea, b) diferentes anticuerpos utilizados para la detección de la molécula CD 133. De hecho, diferentes resultados se pueden obtener mediante el uso de diferentes anticuerpos [13], [14] c) diferentes criterios utilizados para identificar tinción positiva y diferente de corte utilizado para discriminar tumores positivos y negativos. En nuestro estudio hemos establecido cuatro niveles de positividad: & lt; 10%, 11-25%, 26-50% y & gt; 50%. Otros consideraron positivos si & gt; 50% de positividad, (Horst
et al
), & gt; 10% (Kojima
et al
) o & gt; 5% (Li
et al
), d) insuficiente paciente cohorte, esto podría explicar los resultados negativos para la correlación en una cohorte de este tipo con una baja esperanza de recurrencia, dando como resultado sólo en un 17% de los casos. Sin embargo, hemos podido demostrar una correlación con factores clinicopatológicos conocidos y supervivencia.
Además, se observó un alto nivel de CD133 y positividad NANOG en este grupo de pacientes en una fase más inicial, 60% de positividad CD133. Por otra parte, en el 22% era mayor que 50%. También encontramos 94% NANOG positividad y el 51% de ellos fueron superiores a 50%. Estos resultados van en contra con los encontrados por Li
et al, España en la que hasta el 40% de los casos en estadio IIIB tenían & lt; 5% de positividad
Este comportamiento inesperado de la expresión de CD133 encuentra en. nuestro estudio, mayor en los tumores en etapas menores que en las lesiones más avanzadas, se ha observado en otros informes [15]. Esta distribución es coherente con los resultados anteriores en un modelo de ratón de la carcinogénesis de colon [16] y en los cánceres primarios de colon humanos [16]. En el ratón de colon carcinogénesis se ha observado un aumento significativo de la expresión de CD133, evaluada por inmunohistoquímica, en las lesiones neoplásicas tempranas que tendían a disminuir con el desarrollo de tumores [17] y un aumento de la expresión de CD133 se informó en Dukes A comparado con Dukes B y C cánceres de colon [dieciséis]. Estudios anteriores indicaron que la intensidad de CD133 es dependiente del ciclo celular y el aumento de CD133 células positivas se correlacionan con un mayor contenido de ADN, y todas estas resultados están de acuerdo con la capacidad propuesto de la proteína para identificar específicamente las células iniciadoras de tumores que se relaciona con el el crecimiento tanto de enfermedad primario y metastásico [18] y por lo tanto participa principalmente en las fases más activas de desarrollo del tumor.
Esta expresión CD133 diferente a través de diferentes etapas también ha sido sugerido por Shmelkov
et al
, que propuso que durante la metástasis, las células tumorales positivas CD133 generan células negativas CD133, que son más agresivos y también capaz de iniciar los tumores en ratones desnudos. Los autores informaron que el 40% de los tumores metastásicos en su estudio fueron CD133 negativo [19].
En conclusión, en este estudio de 100 pacientes en estadio II del cáncer de colon, Stem Cell cuantificación definida por CD133 y la expresión de NANOG no tiene correlación con RFS o el sistema operativo. Sin embargo, se encontró una correlación con factores patológicos de pronóstico establecidos. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que las células madre cancerosas no puede jugar un papel importante en las fases tempranas de cáncer de colon.
Reconocimientos
Y gracias a los doctores Castro y ME Fernández-Santos PhD, por leer el manuscrito y proporcionar consejos e ideas útiles. MA González-Nicolás BSc & amp; Un Acosta Licenciatura contribuido con su excelente asistencia técnica en la realización de los experimentos de tinción de muestras cerebrales fetales para el estudio de la expresión de CD133, así como por sus útiles comentarios y una interpretación precisa.