Extracto
Xanthatin, un sesquiterpenlactonas purificada a partir de Xanthium strumarium L., posee actividad anticancerígena prominente. Hemos encontrado que la interrupción de la actividad de GSK3 era esencial para xanthatin para ejercer sus propiedades contra el cáncer en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), concurrente con la supresión preferible de la activación constitutiva de STAT3. Curiosamente, la inactivación de las dos señales son dos eventos mutuamente exclusivos en la muerte celular inducida por xanthatin. Por otra parte, hemos encontrado sorprendentemente que la exposición de xanthatin no pudo desencadenar el efecto secundario de presumible canónica de Wnt /β-catenina seguido por GSK3 inactivación. Asimismo, observó que era necesaria la regulación a la baja de STAT3 para xanthatin ajustar con precisión el riesgo. Por lo tanto, el descubrimiento de xanthatin, que tiene capacidad para orquestar simultáneamente dos cascadas de señalización independientes, puede tener importantes implicaciones para el cribado de fármacos prometedores en terapias contra el cáncer
Visto:. Tao L, Fan M, Liu Y, Li W, Zhang L, Ruan J, et al. (2013) La supresión concertada de STAT3 y GSK3 está implicada en la inhibición del crecimiento de células no pequeñas de cáncer de pulmón por Xanthatin. PLoS ONE 8 (11): e81945. doi: 10.1371 /journal.pone.0081945
Editor: Kamyar Afarinkia, University of Bradford, Reino Unido
Recibido: 31 Agosto, 2013; Aceptado: 17 de octubre de 2013; Publicado: 28 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Tao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81173174 y 81202655); El Nacional Key Technology Research & amp; Programa de Desarrollo (núm 2008BAI51B02); Doctor en Filosofía. Fundación programas de Ministerio de Educación de China (Nº 20113237110008). proyectos de investigación e innovación graduado de Jiangsu College (Nº CXZZ13_0627). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
3β la glucógeno sintasa quinasa (GSK3) ha surgido como uno de los objetivos terapéuticos más atractivos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, y los inhibidores de GSK3 se han aplicado con éxito a la práctica clínica durante décadas [1,2]. A pesar de que ha sido ampliamente aceptado que los aberrantes funciones mediadas por GSK3 suelen estar relacionados con la carcinogénesis, la utilización de antagonistas de GSK3 en terapias contra el cáncer sigue siendo enigmático y controvertido [3]. Se espera que una preocupación importante en la terapia anti-GSK3 para activar la señalización de Wnt /β-catenina y estabilizar los oncogenes presumiblemente conducir a la tumorigénesis. En el citosol, GSK3 fosforila β-catenina y se dirige a él para la ubiquitinación y la degradación proteasomal. Por lo tanto, mediada de unión a ADN-inhibición de la GSK3 en la acumulación de β-catenina, posterior translocación en el núcleo y el reclutamiento de factor de factor de potenciador linfoide /de células T (LEF /TCF) oncogénico proteínas de transcripción [4].
el cáncer de pulmón es bien conocido por la primera causa de mortalidad en el mundo superior [5]. El conocimiento actual con respecto a GSK3 en la progresión del cáncer de pulmón se basa en la observación clínica de que fosforila GSK3 (Ser 9, muerto quinasa) podría ser un buen marcador pronóstico para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que sobreexpresan carcinoma de pulmón [6]. La evidencia reciente ha demostrado que la inhibición de GSK3 aumenta la capacidad de la droga celecoxib quimiopreventivo para regular a la baja anti-apoptóticos proteína c-FLIP [7] y sensibiliza factor de necrosis tumoral relacionada ligando inductor de apoptosis (TRAIL) inducida por apoptosis en células no pequeñas cáncer de pulmón (NSCLC) [8], lo que sugiere que la interrupción de la actividad de GSK3 puede servir como una forma opcional para bloquear el cáncer de pulmón.
La identificación de nuevos fármacos a partir de productos naturales tiene una larga y exitosa historia. En el presente trabajo, se introduce un sesquiterpenlactonas naturales xanthatin [9], que está aislado de
Xanthium strumarium
L. y tiene actividad contra el cáncer prominente, podría interferir farmacológicamente con GSK3. Se ha informado de que el extracto de metanol de
Xanthium strumarium
L. que ofrece mayor xanthatin puede inhibir la actividad de GSK3 y regular a la baja microftalmia-factor de transcripción asociado (MITF) melanogénesis mediada, mientras MITF es un objetivo principal de la Wnt vía de señalización [10]. Estos hallazgos sugieren preliminarmente que no puede haber ninguna relación causal entre la inhibición de GSK3 y la activación de Wnt por la planta. Por otra parte, si la activación de la señalización de Wnt es un resultado inevitable acompañada por la inhibición GSK3, que postula que podría ser muy posiblemente algunos remedios preventivos para el riesgo por xanthatin. En este caso, la quinasa de múltiples talentos como diana terapéutica se llevará a cabo, y también se apreciará la utilidad de xanthatin.
Anteriormente, hemos demostrado que xanthatin induce significativamente la detención del ciclo celular y la apoptosis dependiente de caspasa en humanos de pulmón y cáncer gástrico, así como melanoma murino [9,11,12]. Sin embargo, sigue siendo en gran parte no está claro si la inhibición de GSK3 es esencial para el efecto contra el cáncer de xanthatin. Para detectar más posibles mecanismos para la coordinación adecuada de las múltiples vías que la inactivación de GSK3 por xanthatin dosis no mantener fácilmente β-catenina /Wnt, abordamos transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3), porque no hay una evidencia amplia de la literatura desciframiento que STAT3 regula un puñado de oncogenes aguas abajo compartidos por β-catenina. A lo mejor de nuestro conocimiento, 1250 superposición genes diana putativos han sido identificados que fueron co-regulada por β-catenina /TCF4 y STAT3 [13]. Estos objetivos comunes bien caracterizados incluyen aceleradores del ciclo celular (c-Myc, cyclinD1, etc.), proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, XIAP, etc.) y reguladores de la metástasis tumoral (COX-2, VEGF, etc.) [ ,,,0],14,15]. En realidad, la activación de STAT3 participó en la acumulación nuclear de β-catenina, resultando en una mala supervivencia de los pacientes en los cánceres de colon y de mama [16,17]. Por lo tanto, se infiere que STAT3 podría cooperar funcionalmente con β-catenina. Por lo tanto, la hipótesis de que la interrupción de STAT3 podría atenuar en parte la elevada Wnt /β-catenina tras la inactivación por GSK3 xanthatin.
En este estudio, hemos examinado el efecto de xanthatin sobre las actividades de STAT3 y GSK3 en NSCLC y se investigó el subyacente diafonía entre STAT3 y señalizaciones de Wnt /β-catenina. Los resultados serían secuestrar la duda de la aplicación clínica contra el cáncer de xanthatin en el futuro.
Materiales y Métodos
líneas
Cultivo de células y células
Las líneas de NSCLC humanos (A549, H1975 , H1650, HCC827) y las células epiteliales SV40-inmortalizado no tumorigénicas bronquiales humanas BEAS-2B utilizado como control se obtuvieron de la Academia de Ciencias de china Banco de células de Type Culture Collection (CBTCCCAS, Shanghai, china). Las líneas celulares de cáncer de pulmón fueron cultivadas como monocapas en medio RPMI 1640 medio de cultivo suplementado con 10% de suero bovino fetal (Wisent, Quebec, Canadá), 100 mg /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina y BEAS-2B se cultivó en suero libre LHC-8 medio (Invitrogen, Carlsbad, CA) mantenido en una incubadora con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C.
Productos químicos y regentes
Xanthatin se aisló y se purificó por nuestro grupo como se describe anteriormente [10] y la pureza supera el 95% tal como se determina por un método de HPLC. El mM de stock de solución xanthatin 100 se preparó en 100% de DMSO y células tratadas con la misma cantidad de DMSO sirvió como control. El cloruro de litio (LiCl), SB216763 y N-acetil cisteína (NAC) se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Se obtuvo la IL-6 humana recombinante a partir de I + amp;. D Systems (Minneapolis, MN, USA)
Una solución de ensayo de proliferación celular
La viabilidad celular se determinó por CellTiter 96
® acuosa una solución de ensayo de proliferación celular (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Brevemente, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos y se trataron con agentes indicados. Después de la incubación para el período de tiempo indicado, se añadieron 20 l de un reactivo solución a cada pocillo y la incubación se continuó durante 1-4 h adicional. La absorbancia se midió a 490 nm utilizando Synergy ™ HT Multi-Modo lector de microplacas (Bio-Tek, Winooski, VT, EE.UU.). El efecto de los agentes indicados en la viabilidad celular se evaluó como el porcentaje de viabilidad celular en comparación con células de control tratadas con vehículo, que fueron asignados arbitrariamente 100% de viabilidad. La concentración de xanthatin resulta en la inhibición 50% del crecimiento de control (IC
50) fue calculado por el software estadístico SPSS. Las imágenes de la morfología de las células fueron tomadas con un microscopio invertido (CarlZeiss, Hallbergnoos, Alemania) a campos al azar.
citometría de flujo ensayo
Las células fueron sembradas en placas de cultivo celular de 6 pocillos y se trató con diversos agentes para el período de tiempo indicado. Para el análisis del ciclo celular, las células se separaron con tripsina y se lavaron con PBS frío. células precipitadas se fijaron en 500 l de etanol frío al 70% durante la noche a -20 ° C. Después de ser lavado en PBS, las células fijadas fueron incubadas con RNasa a 37 ° C durante 30 min y se tiñeron con yoduro de propidio (PI) durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA). Para el análisis de apoptosis de las células, las células se separaron con tripsina y se lavaron con PBS frío. Las células resuspendidas en 500 l de tampón de unión se doble teñidas con anexina V y PI conjugado con FITC. Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, las muestras se analizaron inmediatamente por citometría de flujo.
análisis de transferencia de Western
lisados de células enteras se prepararon con tampón RIPA que contiene inhibidores de la proteasa y fosfatasa. extractos de células nucleares y citoplasmáticas se prepararon usando el kit de NE-PER nuclear y citoplasmática de extracción (Thermo, Rockford, EE.UU.). Cantidades iguales de lisados celulares (25 g) se cargaron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después las membranas se bloquearon, se incubaron con anticuerpo monoclonal contra la GSK-3 (1:500, Signalway anticuerpo) y de fósforo-GSK3 Ser-9 (1:10000, Epitomics), β-catenina (1:5000, Epitomics) y fósforo -β-catenina Ser-33/37 /Thr41 (1:1000, Señalización celular Tecnología), STAT3 y fósforo-STAT3 Tyr705 (1:1000, Señalización celular Tecnología), Akt y Akt-Ser473 de fósforo (1:1000, Señalización celular Technology), GPADH (1:5000, Bioworld Tecnología) y Lamin A /C (1:5000, Epitomics) seguido de incubación con IgG conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:10000, Bioworld Biotechnology). Las proteínas diana fueron detectados por el sistema ECL (Millipore, Braunschweig, Alemania) y se visualizaron con el sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Plásmidos y transfección de genes
las células fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos (0,1 mg /pocillo de placas de cultivo de 96 pocillos y placas de cultivo /pocillo durante 6 así 2 g) que contiene la hemaglutinina (HA)-etiquetados constitutivamente activa (S9A) GSK3 (plásmidos 14754, Addgene, Cambridge, MA , depositada por el Dr. Jim Woodgett) y pcDNA3.0 vector vacío (Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.) como control usando el medio Opti-MEM (Gibco-BRL /Invitrogen, Carlsbad, CA) más reactivo de transfección de ADN HP X-tremeGENE ( Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de 48 h después de la transfección, las células fueron tratadas con agentes indicados para los análisis Western blot y análisis de proliferación.
ARN de interferencia
Los oligonucleótidos para el kit de STAT3 humana siRNA fueron adquiridos de OriGene (Rockville, MD , ESTADOS UNIDOS). El kit contiene tres dúplex prediseñados dirigidas a un gen específico de interés, y que utiliza un conjunto de tres siRNAs objetivo de garantizar la eficiencia del trabajo. Las células fueron transfectadas con STAT3 siRNA o siRNA no específica (0,15 g /pocillo durante 96 bien placas de cultivo y 2 g placas de cultivo /pocillo de 6 pocillo) usando el Opti-MEM más reactivo de transfección X-tremeGENE siRNA (Roche, Mannheim, Alemania ) de acuerdo con el manual de instrucciones. Después de 24 h después de la transfección, las células se trataron adicionalmente con xanthatin para los análisis Western blot y análisis de proliferación.
Cuantitativo PCR en tiempo real
El ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad , CA, EE.UU.). La primera cadena de ADNc se sintetizó con ARN total 1 g usando un kit de reactivos PrimeScript RT (TakaraBio, Tokio, Japón). QRT-PCR se realizó con CI
TM SYBR Supermix verde y el sistema de detección en tiempo real iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se aplicó el método comparativo ciclo umbral (Ct) para cuantificar los niveles de expresión a través del cálculo de 2
- Método (ΔΔCt). Los cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes (sentido y antisentido, respectivamente): GAPDH: cgagatccctccaaaatcaa y ttcacacccatgacgaacat; Ciclina D1: gtgctgcgaagtggaaacc y atccaggtggcgacgatct; c-Myc: taccctctcaacgacagcag y tcttgacattctcctcggtg; Bcl-2: gtggagagcgtcaaccgggaga y gggccgtacagttccacaaaggc; XIAP: cgagcagggtttcttttatactgg y tgtagactgcgcgtggcact. valores de amplificación de ADNc y de expresión relativa se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes.
inmunocitoquímica
Después de las células A549 sobre cubreobjetos de vidrio fueron tratados por los agentes indicados, se fijaron con acetona pre-frío, después se aclararon tres veces con PBS. Las células se permeabilizaron en 0,1% de Triton X-100 y se incubaron con 1% de BSA /PBS para bloquear la unión no específica. Posteriormente, las células se inmunotiñeron por incubación con anticuerpo monoclonal de conejo contra β-catenina (diluida 1:500, Epitomics) durante la noche a 4 ° C. Después de ser lavado con PBS, las células se incubaron con anticuerpo de cabra conjugado con FITC anti-anticuerpo secundario de conejo (diluido 1:60, Boster Biotechnology, Wuhan, China). Los núcleos se counterstained con Hoechst 33258 (BioTime Biotech, Haimen, China). Las imágenes fueron tomadas y analizadas usando el software de imagen ZEN de 2011, sobre un microscopio Zeiss invertido (CarlZeiss, Hallbergnoos, Alemania) con 400 aumentos.
reportero de luciferasa Dual ensayo de gen
Las células de 96 pocillos placas de cultivo fueron transfectadas transitoriamente con 0,1 mg /pocillo reportero plásmidos p-STAT3-TA-Luc (BioTime Biotech, Haimen, china) o TCF luciferasa /LEF-sensible (Luc2P /TCF-LEF /Hygro, Promega, Madison, WI, EE.UU. ). La eficacia de transfección se normalizó con plásmidos informadores de luciferasa de Renilla. Después de 18 h después de la transfección, las células se trataron con los agentes indicados. la actividad promotora relativa se mide por el sistema reportero (DLR) de ensayo de doble luciferasa usando el Glomax 96 de microplacas luminómetro (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Para los experimentos de co-transfección, las células en placas de cultivo de 96 pocillos se co-transfectaron con STAT3 siRNA (0,08 g /pocillo), objetivo y de control reportero de plásmidos (0,15 g /pocillo en total) durante 24 h y después se trata con agentes indicados, a continuación, DLR ensayo se sometieron.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las diferencias en los resultados de los dos grupos fueron evaluados utilizando cualquiera de dos colas prueba de la t de Student o ANOVA de una vía seguido por
test post hoc de Dunnett
. Las diferencias con
P
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Xanthatin inhibe la proliferación de NSCLC
Para tener acceso a las actividades contra el cáncer de xanthatin , se utilizaron cuatro humano NSCLC líneas celulares A549, H1975, H1650 y HCC827, así como normales (no neoplásicas) humanos células epiteliales bronquiales BEAS-2B. Como se muestra en la Figura 1A, encontramos xanthatin proliferación NSCLC inhibida de una manera sensible la dosis y el tiempo. IC
50 valores de cada línea celular del cáncer y el tiempo de incubación se calcula, lo que demuestra que xanthatin ejerció una inhibición del 50% por debajo de 20 mM después de un tratamiento de 48 h. Hemos observado también el efecto inhibidor sobre las células epiteliales bronquiales normales guardados en altas concentraciones micromolares que el efecto de las dosis equivalentes y tiempo de incubación de xanthatin en NSCLC. Imágenes representativas de la morfología celular mostraron que xanthatin mató selectivamente las células tumorales en lugar de las células normales (Figura 1B). En conjunto, estos datos demuestran que xanthatin tiene actividad contra el cáncer universal en NSCLC sin toxicidad física aparente.
NSCLCs (A) (A549, H1975, HCC827, las células H1650) y las células epiteliales bronquiales humanas (BEAS-2B) fueron expuestos a concentraciones indicadas de xanthatin (1, 5, 10, 20, 40 M) durante 24 h y 48 h, respectivamente. La viabilidad celular se determinó por ensayo de proliferación celular Una solución. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Los valores se expresan como porcentaje de células viables normalizado a porcentaje de células viables en 0,5% de células tratadas con DMSO. La concentración de xanthatin resulta en la inhibición 50% del crecimiento de control (IC
50) fue calculado por el software estadístico SPSS usando el modelo Probit. (B) se tomaron imágenes representativas de la morfología celular en células BEAS-2B y H1975 después de 48 h de tratamiento con o sin 20 xanthatin M (100 ×, barra de escala representa 200 micras).
Xanthatin inhibe preferencialmente la activación de STAT3 en lugar de GSK3 en el CPNM
a continuación evaluó si la regulación a la baja de GSK3 y STAT3 actividad fue concurrente con los efectos anticancerígenos de xanthatin. Se han tratado NSCLC con varias concentraciones de xanthatin (1, 5, 10, 20 y 40 mM) durante 6 h, o 20 xanthatin micras dentro de 12 h. El análisis de transferencia Western mostró que xanthatin dependiente de la dosis aumentar el fósforo-GSK3 (Ser9) y disminuir el fósforo-STAT3 (Tyr705) sin nivel de proteína total cambiado en A549, H1975, H1650 y HCC827 células (Figura 2A). Además, se observó que la actividad STAT3 xanthatin potentemente abrogada en 30 minutos, pero fosforilados GSK3 comenzó a aumentar después de 2 horas de tratamiento en células A549 y H1975 (Figura 2B), lo que sugiere que xanthatin STAT3 suprimido principalmente en lugar de GSK3. En conjunto, estos resultados sugieren que la inactivación de ambos GSK3 y STAT3 está involucrado en los eventos celulares desencadenados por xanthatin.
(A) NSCLCs (A549, H1975, HCC827, las células H1650) se trataron con las concentraciones indicadas de xanthatin ( 1, 5, 10, 20, 40 mM) durante 6 h y después se sometieron a transferencia de Western para medir los niveles de proteína de fósforo-GSK3 (Ser9), t-GSK3, fósforo-STAT3 (Tyr705) y STAT3, respectivamente. células A549 y H1975 (B) fueron tratados con xanthatin 20 M durante diversos tiempo (0 a 12 h) y después se sometieron a transferencia de Western para medir los niveles de proteína de fósforo-GSK3 (Ser9), GSK-3, fósforo-STAT3 (Tyr705 ) y STAT3, respectivamente.
la inactivación de GSK3 y STAT3 son dos eventos mutuamente exclusivos en xanthatin muerte celular inducida por
Para confirmar la relación entre los dos eventos moleculares causadas por xanthatin y el potencial mecanismos que subyacen a la susceptibilidad de la muerte celular xanthatin inducida, se examinó si los inhibidores de la quinasa GSK3-específicas conocidas, LiCl (inhibidor no competitivos con ATP) y SB216763 (inhibidor de la ATP-competitiva) [18] podrían generar actividad anticancerígena similar y mejorar la respuesta contra el cáncer de xanthatin. Como se muestra en la Figura 3A, encontramos tanto de LiCl 20 mM y 20 mM SB 216763 aumentamos GSK3 inactivación y el efecto reforzarse de manera significativa por xanthatin. Curiosamente, a diferencia de LiCl, SB216763 podría no sólo aumentar la fosforilación de GSK3 basal, sino también la degradación del total de GSK-3 en A549 y H1975 NSCLC, que estaba fuera de nuestras expectativas. Sin embargo, los inhibidores de GSK3 farmacológicos no pudieron influir en el nivel de fósforo-STAT3. Para investigar más si GSK3 inactivación puede tener impacto sobre la supervivencia de células, se encontró que la proliferación de las células A549 y H1975 se marcadamente inhibida por los inhibidores de GSK3 solos o en combinación con xanthatin de 24 h de tratamiento, y las células epiteliales bronquiales humanas normales fueron débilmente afectados por inhibidores de GSK3 con o sin xanthatin (Figura 3B).
(a) A549 y H1975 células fueron tratadas con 0,5% de DMSO o 20 mM xanthatin co-incubaron con o sin LiCl 20 mM o 20 mM SB216763 para 6 h . Las muestras de proteína se sometieron a transferencia de Western para medir el fósforo-GSK3 (Ser9), GSK-3, fósforo-STAT3 (Tyr705) y STAT3. (B) NSCLC (A549, H1975 células) y BEAS-2B se expusieron a 0,5% de DMSO o 20 mM xanthatin co-incubaron con o sin LiCl 20 mM o 20 mM SB216763 para 24 h. Se determinó la viabilidad celular. Se presentan los datos como media ± desviación estándar (Para las comparaciones indicadas, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01). (C) Control de siRNA o siRNA contra STAT3 fueron transfectadas en células A549 (2 g siRNA por pocillo). Después de 24 h después de las transfecciones, las células se trataron con con o sin xanthatin 20 M durante 6 h después con Western blot para la medición de fósforo-GSK3 (Ser9), GSK-3, fósforo-STAT3 (Tyr705) y STAT3. (D) Control siRNA o siRNA contra STAT3 fueron transfectadas en células A549 (0,15 g siRNA por pocillo). Después de 24 h después de las transfecciones, las células se trataron con 10 o con 20 xanthatin mu M durante otras 24 h y se sometieron a ensayo de proliferación celular. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Para las comparaciones indicadas, *
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P
. & Lt; 0,01
También utilizamos siRNA para frenar la función de STAT3 en células A549 como una extensa validación. análisis de transferencia Western confirmó la supresión significativa de fósforo-STAT3 y la expresión total de STAT3 por objetivo siRNA, que generó aditivo inhibición de la actividad STAT3 en presencia de xanthatin. Sin embargo, STAT3 siRNA también falló para alterar la actividad GSK3 comparación con las células transfectadas con ARNsi de control (Figura 3C). Además, el silenciamiento de STAT3 mejorado la capacidad de xanthatin para reducir el crecimiento de las células A549 después de 24 h de tratamiento (Figura 3D). En total, es plausible a la conclusión de que el bloqueo de las actividades de GSK3 y STAT3 está implicado en los efectos antiproliferativos de xanthatin, pero los dos eventos no están conectados causalmente.
La inhibición farmacológica de GSK3 potencia detener parcialmente celular inducida xanthatin-y apoptosis
para confirmar los efectos anticancerígenos mejorados por anti-GSK-3 en las células expuestas al xanthatin era debido a la proliferación celular o apoptosis desequilibrada, que se controlará la detención del ciclo celular y la apoptosis respuestas mediante análisis de citometría de flujo en células A549. Como se muestra en la Figura 4A y 4C, xanthatin 20 mM y 20 mM de LiCl podría inducir a las células firmemente a someterse G2 /M detención después de 24 h de tratamiento (de 10.56-31.42% y 10,56 a 30,27%, respectivamente), que fue acompañado por una disminución en la fase G1 (69,26 a 41,21% y 69,26 a 50,33%, respectivamente). A diferencia de LiCl, G2 20 M SB216763 menos claramente afectada distribución /M en células A549 (10,56 a 15,07%), que era paralelo con el informe anterior [8]. Cuando nosotros co-incubaron xanthatin con inhibidores de las dos GSK3, aumento significativo de células en la fase G2 /M apareció por LiCl pero no SB216763. Las células también se tiñeron con Anexina V /PI para el análisis de la apoptosis. células A549 mostraron una apoptosis claro después de una exposición prolongada (48 h) por xanthatin (58,8%), LiCl (54,6%), y SB216763 (48,1%), respectivamente. Por otra parte, xanthatin combinado con SB216763 aumentada más células apoptóticas que LiCl (96,2% frente a 71,9%) (Figura 4B y 4D). En su conjunto, la inhibición de GSK3 es probablemente responsable de la detención del ciclo celular inducida por xanthatin y apoptosis.
(A) células A549 se expusieron a 0,1% de DMSO o 20 mM xanthatin co-incubaron con o sin 20 mM LiCl o 20 M SB216763 durante 24 h y después se tiñeron con iodidle de propidio para detectar el ciclo celular por citometría de flujo. (B) células A549 se expusieron a 0,1% de DMSO o 20 mM xanthatin co-incubaron con o sin LiCl 20 mM o 20 mM SB216763 para 48 h y luego se tiñó con iodidle de propidio y AnnexinV-FITC para detectar la apoptosis mediante citometría de flujo. (C) Los datos cuantitativos de ciclo celular (G0-G1, S y G2 /M fases) se han extraído de la media de determinaciones por triplicado y se muestran como media ± desviación estándar. Para las comparaciones indicadas, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01. (D) los porcentajes totales de células apoptóticas fueron resumidos por el cuadrante inferior derecho de la fluorescencia de células activadas por la clasificación histogramas (porcentaje de células apoptóticas tempranas) y el cuadrante superior derecho (porcentaje de células apoptóticas tardías). Los datos se muestran como media ± desviación estándar. Para las comparaciones indicadas, *
P Hotel & lt; 0,05, **
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. & Lt; 0,01
inhibición de GSK3 es esencial para la actividad anticancerígena de xanthatin
Para estudiar directamente si la inactivación de GSK3 correlaciona con la muerte celular inducida por xanthatin, transfectadas transitoriamente células A549 con un constitutivamente activa (S9A) construcción de GSK3. A medida que nos encontramos, la expresión ectópica de GSK3 constitutivamente activa atenuó la fosforilación de GSK3 por xanthatin, pero aún así no logró alterar los niveles de STAT3 señalización en las células A549 (Figura 5A), lo que indica, además, que la inhibición de GSK3 por xanthatin no se contaba con la inhibición de STAT3. Como era de esperar, la sobreexpresión de GSK3 constitutivamente activa confirió una resistencia a las actividades contra el cáncer de xanthatin en forma dependiente del tiempo (Figura 5B). Además, GSK3 es profundamente implicado en el escape de la apoptosis y su inactivación es un evento aguas arriba de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) [19,20]. Con este fin, se observó que la muerte celular inducida por xanthatin se impidió completamente en presencia de un poderoso antioxidante y captador de ROS N-acetil cisteína (NAC) (Figura 5C). Por otra parte, NAC atenuó completamente la fosforilación de GSK3 por xanthatin (Figura 5D), que demostró el papel de la inhibición de GSK3 por xanthatin en la muerte celular mediada por ROS. En conjunto, nuestros datos sugieren que la inhibición de GSK3 es esencial para la actividad contra el cáncer de xanthatin a través de ROS.
células A549 (A) sembradas en 6 placa de pocillos fueron transfectadas con HA-etiquetados constitutivamente activa (S9A) -GSK3β o vacía vector (2 mg de ADN plasmídico por pocillo). Después de 48 h después de las transfecciones, las células se trataron con o sin 20 xanthatin mu M durante 6 h, a continuación se sometieron a transferencia de Western para medir los niveles de proteína de la etiqueta HA, fósforo-STAT3 (Tyr705) y STAT3, respectivamente. células (B) A549 sembradas en placa de 96 pocillos se transfectaron con HA-etiquetados constitutivamente activa (S9A) -GSK3β o vector vacío (0,1 g de plásmido de ADN por pocillo). Después de 48 h después de las transfecciones, las células se trataron con xanthatin 10 o 20 mu M durante 24 h y 48 h, respectivamente, a continuación, se sometieron a ensayo de proliferación celular. Para las comparaciones indicadas, *
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P Hotel & lt; 0,01. células A549 (C) se trataron con 10 o 20 xanthatin mu M en presencia o ausencia de NAC 1 mM durante 48 h, a continuación, se sometieron a ensayo de proliferación celular. (D) células A549 se trataron con 10 o 20 xanthatin mu M en presencia o ausencia de NAC 1 mM durante 6 h, a continuación, se sometieron a transferencia de Western para medir los niveles de proteína de fósforo-GSK3 (Ser9) y GSK-3, respectivamente. Los datos mostrados son representados como la media ± desviación estándar. Para las comparaciones indicadas, *
P Hotel & lt; 0,05, **
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. & Lt; 0,01
Xanthatin falla para desencadenar la actividad global post-transcripcional de β- catenina en respuesta a GSK3 inactivación
para evaluar a fondo la posibilidad de que xanthatin podría causar consecuencias perjudiciales debido a la inhibición de GSK3 a través de la regulación positiva de la actividad de transcripción mediada por β catenina y expresión oncogenes, nos dispusimos a examinar la cascada de señalización intracelular en respuesta a la estimulación de xanthatin y el inhibidor de GSK3. Como se ilustra en la Figura 6A, el tratamiento con xanthatin 20 mM durante 12 h apenas inducidas amplia translocación nuclear de β-catenina, mientras LiCl solo rindió estabilidad β-catenina y distribución nuclear general. Co-incubación de los dos agentes causada incidente más grave, pero el número de células se redujo en gran medida. Entonces, se estudió la alteración de la actividad promotora por activado β-catenina usando luciferasa construir con elemento de respuesta LEF /TCF, que estaba implicado en la unión de β-catenina para el estudio de la activación de Wnt ADN transcripción. Se encontró que dosis-dependiente aumentó xanthatin (0-10 mM), pero disminuyó (20-40 M) la actividad pre-transcripcional de Wnt /β-catenina con o sin LiCl 20 mM después de 6 h de incubación (Figura 6B). Además, investigó la cinética de tiempo del curso caracterización de 20 xanthatin M sobre la actividad de la luciferasa β-catenina-LEF /TCF. Xanthatin indujo una activación dependiente del tiempo del gen indicador dentro de 2 h pero después de eso, el efecto máximo comenzó a disminuir dentro de 6 h. Estos datos confirman que xanthatin tiene la posibilidad de activar β-catenina /Wnt, pero este incidente no se mantiene.
células A549 (A) se trataron con vehículo, 20 xanthatin mu M, LiCl 20 mM o LiCl 20 mM más 20 xanthatin mu M durante 12 h, a continuación se fijaron las células y se incubaron con anticuerpos primarios contra β-catenina. Las células A549 se immunostained con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con FITC y luego teñidas con Hoechst 33258. Las muestras se visualizaron y fotografiaron usando un microscopio de fluorescencia (400 ×, barra de escala representa 50 micras). Azul representa el núcleo y el verde representa la localización de β-catenina. (B) células A549 cultivadas a 70-90% de confluencia fueron co-transfectadas con Luc2P /TCF-LEF /Hygro y luciferasa de Renilla (0,1 mg de ADN plasmídico por pocillo en total) durante 18 h, luego se sitimulated con vehículo, LiCl 20 mM o LiCl 20 mM más 1, 5, 10, 20 y 40 xanthatin mu M durante 6 h. Los lisados de células se realizaron mediante el ensayo DLR, y la relación de luciferasa de luciérnaga a Renilla se determinó (luciferasa relativa) de actividad. Para las comparaciones indicadas, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01. N.S, no significativa. (C) células A549 cultivadas a 70-90% de confluencia fueron co-transfectadas con Luc2P /TCF-LEF /Hygro y luciferasa de Renilla (0,1 mg de ADN plasmídico por pocillo en total) durante 18 h, a continuación se estimularon con xanthatin 20 M durante 0 -6 h. Los lisados de células se realizaron mediante el ensayo DLR, **
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& lt; 0,01 comparado con el grupo control. (D) células A549 se trataron con o sin 20 xanthatin mu M durante 12 h y luego se extrajeron los ARN totales. CyclinD1, c-Myc, Bcl-2, los niveles de ARNm de XIAP se determinaron por medio de cuantitativa en tiempo real PCR y normalizado al nivel de ARNm de GAPDH. Los cambios veces de la expresión de ARNm de genes indicados se compararon como una relación al control del vehículo. Los datos se muestran como media ± DE de triplicados experimentos. **
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& lt; 0,01 comparado con el grupo control. células A549 (E) se trataron con o sin 20 xanthatin mu M durante 6 h. Citoplasmáticas (cito.) Y nuclear (Nu.) Extractos se prepararon y se sometieron entonces a transferencia Western para medir los niveles de proteína de β-catenina, fósforo-GSK3 (Ser9), GSK-3, fósforo-STAT3 (Tyr705) y STAT3, respectivamente.
A continuación, se determinó los niveles de mRNA de cuatro genes diana representativas Wnt por el ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real. Como se muestra en la figura 6D, la ciclina D1, c-Myc, Bcl-2 y XIAP no se vieron afectadas o incluso reprimidos por xanthatin después de 12 h de incubación.