Extracto
TIG3 es una proteína supresora tumoral que limita la supervivencia de queratinocitos durante la diferenciación normal. También es importante en el cáncer, como el nivel de TIG3 se reduce en los tumores y en líneas celulares de cáncer de piel, lo que sugiere que la pérdida de expresión puede ser necesaria para la supervivencia de células de cáncer. Un objetivo importante es identificar cómo TIG3 limita la supervivencia celular. En el presente estudio muestran que la expresión TIG3 en el carcinoma de células escamosas SCC-13 células epidérmicas reduce la proliferación celular y promueve la apoptosis morfológica y bioquímica. Para identificar el mecanismo que impulsa estos cambios, se demuestra que TIG3 localiza cerca del centrosoma y que la acumulación de pericentrosomal TIG3 altera la organización de microtúbulos y microfilamentos y distribución orgánulo. acumulación orgánulo en el centrosoma es un sello distintivo de la apoptosis y que demuestran que promueve la acumulación TIG3 orgánulo pericentrosomal. Estos cambios están asociados con una reducción de la ciclina D1, ciclina E y la ciclina A, y el aumento de nivel de p21. Además, el nivel de Bax se aumenta y el nivel de Bcl-XL se reduce, y la escisión de la procaspasa 3, procaspasa 9 y PARP se ve reforzada. Proponemos que la localización de pericentrosomal TIG3 es un evento clave que da lugar a los microtúbulos y microfilamentos la redistribución y la agrupación orgánulo pericentrosomal y que conduce a la apoptosis de las células cancerosas
Visto:. Scharadin TM, Jiang H, R Jans, Rorke EA, Eckert RL (2011) TIG3 supresor tumoral dependiente Orgánulos redistribución y apoptosis en células de cáncer de piel. PLoS ONE 6 (8): e23230. doi: 10.1371 /journal.pone.0023230
Editor: Janine Santos, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Marzo, 2011; Aceptado: 12 de julio de 2011; Publicado: 17 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Scharadin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones a RE (NIH R01 AR094713 y NIH R01 AR04694). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
TIG3 (gen inducido por tazaroteno 3), que también se llama retinoico respondedor receptor de ácido 3 (RARRES3) y el gen 1 (rig1) retinoide-inducible [1] - [5], es un cien sesenta cuatro aminoácidos de proteínas [6]. TIG3 se identificó originalmente como una mayor después del tratamiento de queratinocitos epidérmicos cultivados o epidermis psoriásica con el retinoide sintético, tazaroteno [6]. Se expresa en niveles bajos en epidermis hiperproliferativos (por ejemplo, carcinoma de células escamosas y psoriasis) y la expresión se restaura mediante tratamiento con retinoides [7] - [9]. En la epidermis psoriásica retinoides tratados, incremento en la expresión TIG3 se asocia con la restauración de la diferenciación normal [6], [10]. La asociación de aumento de la expresión TIG3 con fenotipo epidérmica normal sugiere que TIG3 puede actuar como un regulador de pro-diferenciación. Para examinar el mecanismo de acción, se estudió la función TIG3 en los queratinocitos humanos normales [10] - [12]. Estos estudios muestran que TIG3 está presente en niveles infinitamente bajos en los queratinocitos en cultivo monocapa, pero está aumentada en cultivos suspendidos diferenciadas [12]. El vector de expresión mediada por TIG3 en queratinocitos resultados en reducción de la proliferación y la formación de aumento de la envoltura córnea, lo que sugiere que TIG3 regula queratinocitos diferenciación [10] - [12]. Los estudios en curso muestran que TIG3 opera a través de varios mecanismos, sino un mecanismo de acción es importante regulación de la actividad transglutaminasa [10], [11]. Tipo I transglutaminasa (TG1) es una enzima clave en los queratinocitos y otros epitelios de la superficie que se expresa en células suprabasales diferenciado [13] - [20]. Transglutaminasa cataliza la formación de ∈- (γ-glutamil) lisina entrecruzamientos entre proteínas para montar la envoltura córnea, un componente esencial de la barrera epidérmica [21], [22]. Nuestros estudios sugieren que TIG3 co-localiza con TG1 que conduce a aumento de la actividad transglutaminasa [10], [11]. Estudios adicionales demuestran que TIG3 reduce la proliferación de queratinocitos, pero no causa la apoptosis [10], [11]. TIG3 consiste en un segmento hidrófilo amino terminal y un dominio C-terminal de anclaje de membrana [6], [23]. Estudios de mutagénesis indican que los mutantes que carecen de la membrana de dominio de anclaje C-terminal no están activos [10], [11], [23]. En contraste, el truncamiento N-terminal convierte TIG3 en una proteína que causa apoptosis en queratinocitos [12].
TIG3 se expresa en niveles reducidos en tumores de la piel [7]. Por lo tanto, un objetivo principal de este estudio es caracterizar el impacto de expresión TIG3 en células de cáncer de piel. Se demuestra que la restauración de la expresión TIG3 reduce la supervivencia de las células de carcinoma de células escamosas de la epidermis a través de un mecanismo que implica la localización TIG3 pericentrosomal que conduce a la organización de los microtúbulos alterado y distribución orgánulo. Esto se asocia con cambios en el nivel del ciclo y la apoptosis reguladores celulares.
Resultados
expresión TIG3 disminuye el número de células
Comenzamos examinando el impacto de TIG3 en SCC- 13 la supervivencia celular. TIG3 fue entregado por la infección por adenovirus. Higo. 1A muestra que las células infectadas por vectores vacíos aumentan en número en 72 h, pero que el número de células se reduce significativamente a las 48 y 72 h en las células TIG3 expresan. Higo. 1B muestra que el nivel TIG3 es máxima en las células infectadas por 24 y 48 h post-infección y se reduce por 72 h. Además del monómero TIG3, se observa la acumulación de formas de alto peso molecular que se cree que pueden reticular covalentemente TIG3 [10] - [12]. Como se informó anteriormente, TIG3 se expresa en niveles bajos en la mayoría de las células transformadas [10], [11] y por lo tanto no se detecta a tiempo cero
.
Subconfluent cultivos de células SCC-13, que crecen en 3,8 cm
2 pozos, se infectaron con 10 MOI tAd5-EV o tAd5-TIG3. A 0, 24, 48, y 72 h post-infección, se contaron las células y los lisados preparados. Una expresión TIG3 disminuye el número de células. Los valores son medias ± SEM, n = 3. Esas comparaciones marcados con un asterisco son significativamente diferentes según lo determinado por la prueba t de Student (p & lt; 0,001). B TIG3 es detectado por inmunoblot en tAd5-TIG3 infectaron células SCC-13. El monómero es visible en 18 kDa y el soporte indica un mayor peso molecular TIG3 reticulado [10], [11]. Los pesos moleculares se indican a la izquierda de la mancha en kDa.
TIG3 disminuye la proliferación celular mediante la inhibición de la progresión del ciclo celular
A continuación supervisó la progresión del ciclo celular. Comenzamos evaluando el porcentaje de células en fase S mediante marcaje con BrdU. células SCC-13 se infectaron con virus que expresan TIG3 y después de 24 h marcadas con BrdU durante 2 h antes de la detección de BrdU y TIG3. Como se muestra en la Fig. 2A, 54 ± 2,8% (media ± SEM) de las células infectadas por el EV fueron positivas para BrdU en comparación con el 23% ± 4% de las células que expresan TIG3. Como se muestra en la Fig. 2B, los cambios más destacados del ciclo celular son una reducción en G1 y aumenta en casos subG1. Para investigar el mecanismo responsable de estos cambios, que mide el nivel de las proteínas reguladoras del ciclo celular clave. Higo. 2C muestra que quinasa (CDK1, CDK2, CDK4, CDK6) niveles dependientes de ciclina no se alteran por TIG3, pero los niveles de ciclina D1 y ciclina E se disminuye y aumenta el nivel de p21. Estos cambios son consistentes con la progresión reducida a través de la fase G1 y la transición G1 /S. Higo. 2D muestra que el nivel de ARNm de p21 aumenta en paralelo con el aumento de la proteína p21.
A SCC-13 células cultivadas en cubreobjetos se infectaron con 10 MOI de EV o virus TIG3-codificación y después de 24 h tratados con 10 mM BrdU durante 2 h y luego fijaron y tiñeron con anti-BrdU (rojo) y anti-TIG3 (verde). incorporación BrdU es un marcador de la fase de síntesis del ciclo celular. El número de células positivas de BrdU como porcentaje del número total de células se presenta debajo de cada panel. Los valores son la media ± SEM (n = 3) y los valores son significativamente diferentes según lo determinado por la prueba t de Student (p & lt; 0,001). Bares = 10 micras. Se recogieron las células B SCC-13 para citometría de flujo a las 24 h después de la infección con el virus de la EV o TIG3-codificación. Las células se tiñeron con 50 mg de yoduro /ml de propidio antes del análisis. TIG3 reduce los eventos en G1 y aumenta eventos subG1. C A las 24 h post-infección, se recogieron las células y los extractos preparados para la detección de las proteínas reguladoras del ciclo celular. Los pesos moleculares se indican a la izquierda de la mancha en kDa. Las células D fueron tratados como anteriormente y después se recogieron para la detección de mRNA p21 codificación mediante PCR en tiempo real. Un resultado similar se observó en cada uno de tres experimentos.
TIG3 induce apoptosis
La presencia de contenido de ADN subG1 puede estar asociada con la apoptosis celular. Por lo tanto, se evaluó el impacto de TIG3 sobre la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 3A, la expresión TIG3 activa la escisión de la procaspasa 9 y procaspasa 3 y genera PARP escindido. Además, el regulador de pro-apoptóticos, Bax, se incrementa y el regulador prosurvival, Bcl-XL, se reduce. Aumento de la apoptosis también se puede observar
In situ
. Higo. 3B muestra que se observan muy pocas células PARP-positivo escindidos en los cultivos control (1 ± 1%, media ± DE), pero que el número se incrementa notablemente en las culturas TIG3-positivo (23 ± 8%). Estos hallazgos, junto con el aumento en el contenido de ADN subG1 (Fig. 2B), sugieren que TIG3 induce la muerte celular apoptótica.
A SCC-13 células se infectaron con 10 MOI de EV o virus TIG3-codificación y después de 24 h lisados se prepararon para la detección de marcadores de apoptosis. El paréntesis indica alto peso molecular reticulado TIG3 [10], [11]. Los pesos moleculares se indican a la izquierda de la mancha en kDa. B En las células 24 h después de la infección SCC-13 fueron fijadas y teñidas con anti-PARP escindida (rojo). aumenta TIG3 troceados tinción PARP. El porcentaje de células positivas de PARP escindida se presenta en cada panel (media ± DE). Las flechas indican escinden células PARP-positivo. Se observaron resultados similares en cada uno de tres experimentos.
TIG3 localiza en un lugar pericentrosomal y provoca la redistribución de orgánulos
Para obtener información sobre el mecanismo de acción TIG3 monitorizamos TIG3 localización subcelular de células tAd5-TIG3 infectados por virus. Como se muestra en la Fig. 4A, TIG3 (verde) se acumula a lo largo de la periferia de la célula cerca de la membrana plasmática (puntas de flecha) y en una ubicación perinuclear (flechas), y los núcleos de las células que expresan TIG3-se reducen de tamaño. A fin de evaluar la ubicación TIG3, se tiñeron las células para detectar pericentrina, un marcador centrosoma. Las imágenes de la Fig. 4B revelan tinción TIG3 yuxtapuesta con la tinción pericentrina (flecha blanca) adyacente al núcleo (n). TIG3 (verde) se localiza en la vecindad general de pericentrina (rojo) lo que sugiere la acumulación en el entorno de la centrosoma.
A SCC-13 células se infectaron con 10 MOI tAd5-EV o tAd5-TIG3 y en 24 h después de la infección fueron fijadas y teñidas con anti-TIG3 (verde). Las flechas indican pericentrosomal y puntas de flecha indican la localización de membrana. No TIG3 se detecta en las células infectadas por vectores vacíos. Células B, infectadas como anteriormente, se fijaron y se tiñeron con TIG3 (verde) y pericentrina (rojo). Las flechas indican pericentrina tinción del centrosoma y n indica los núcleos. Bares = 10 micras.
El centrosoma es un punto de control para una amplia gama de funciones celulares. Funciona como el centro de organización de microtúbulos (MTOC), que es el sitio de ensamblaje de los microtúbulos [24], [25]. Además, se replica durante la división celular y los centrosomas hija sirven para organizar los husos mitóticos que guían la separación de cromosomas [24], [26]. Es importante destacar que la MTOC sirve como un punto de control para el movimiento de la carga del motor-llevado molecular, incluyendo orgánulos, a lo largo de los microtúbulos [27]. Por otra parte, la disfunción centrosoma está asociado con la apoptosis de células [28]. Por lo tanto, hemos examinado si la acumulación pericentrosomal TIG3 altera la distribución de los microtúbulos. Como se muestra en la Fig. 5A, los microtúbulos en las células TIG3-negativas se extienden por toda la célula en una red de tipo celosía típico que se irradia desde el centrosoma (flecha blanca). Por el contrario, en las células que expresan TIG3 (flecha negro indica TIG3 pericentrosomal), los microtúbulos se localizan como una banda (flechas rojas) en la periferia de la célula y no irradian hacia fuera del centrosoma, lo que sugiere que la ubicación impactos TIG3 microtúbulos y anclaje. Esto se observa mejor en la Fig. 5A (panel inferior), que muestra sólo la tinción β-tubulina. Los microtúbulos en la célula TIG3-positivo (izquierda) carecen basado en la agrupación centrosoma, mientras que la célula TIG3-negativo (derecha) tiene microtúbulos centrosoma anclado (flecha blanca). Para evaluar el impacto de TIG3 en la red de microtúbulos, se contó el número de células que muestran los microtúbulos que irradian desde el centrosoma. Como se muestra en la trama, el porcentaje de células que presentan las redes de centrosoma dirigida se reduce notablemente en las células que expresan TIG3.
Un SCC-13 células fueron infectadas con 10 MOI tAd5-EV o tAd5-TIG3 y al 24 h las células después de la infección se fijaron y se tiñeron con anti-TIG3 (mancha verde) y anti-β-tubulina (tinción roja). TIG3 se acumula en el lugar esperado perinuclear (flecha negro). β-tubulina se acumula en un anillo atípicos en la periferia de células (flechas rojas). La normal de la red β-tubulina en la célula TIG3-negativa se indica por una flecha blanca que apunta hacia el centrosoma. Los núcleos fueron manchadas Hoechst (azul). El panel inferior es idéntica a la parte superior, con la excepción de que se mencione señal de sólo el β-tubulina (rojo). Bares = 10 mM. El gráfico muestra el número de células infectadas tad-EV y tAd5-TIG3 con arreglos de microtúbulos originados centrosoma. Las células se contaron en veinte campos microscópicos independientes y un mínimo de uno-cientos de células se contaron por grupo de tratamiento. Los valores son la media ± SEM. análisis de la prueba de la t de Student pareada revela que las medias son significativamente diferentes (p & lt; 0,001). Para evaluar el impacto de TIG3 sobre la solubilidad de la tubulina, las células fueron infectadas con tAd5-EV o tAd5-TIG3 y después de 24 h de extracto fracciones, soluble e pellets totales se prepararon y se sometieron a electroforesis seguidas por inmunotinción para detectar β-tubulina y β-actina. La presencia de la mayoría de los β-actina en la fracción soluble indica que el fraccionamiento se realizó correctamente. B expresión TIG3 provoca el colapso de filamentos de actina alrededor del núcleo. células SCC-13 se infectaron con adenovirus como anteriormente y después de 24 h se tiñeron con anti-β-actina (tinción de rojo) y anti-TIG3 (mancha verde). Los núcleos fueron manchadas Hoechst (azul). Para las células TIG3-positivo, el panel izquierdo muestra las señales de beta-actina y TIG3 (rojo y verde), mientras que el panel de la derecha muestra sólo el canal de β-actina (rojo). La flecha indica la acumulación negro TIG3 en el centrosoma y la flecha roja indica el anillo de microfilamentos nuclear β-actina. Bares = 10 micras. El gráfico muestra el número de células infectadas tad-EV y tAd5-TIG3 que muestra los anillos de actina microfilamentos que rodean el núcleo. Las células se contaron en dieciocho campos microscópicos independientes y un mínimo de uno-cientos de células se contaron por grupo de tratamiento. Los valores son la media ± SEM. análisis de la prueba t de Student pareada revela que los medios son significativamente diferentes (p & lt; 0,001).
La redistribución de tubulina a la membrana celular en las células TIG3-positivas sugiere que puede ser insoluble. Para evaluar esto, hemos preparado extracto celular total a partir de células TIG3-negativos y positivos y preparados fracciones solubles y particulares (pellets). A continuación, se ensayaron para β-tubulina en cada fracción mediante inmunotransferencia. Como se muestra en la Fig. 5A, el β-tubulina localizado en la membrana no aparece en la fracción de sedimento, lo que sugiere que a pesar de que se localiza en la periferia celular en o cerca de la membrana, sigue siendo soluble.
Las redes de tubulina y actina interactúan ampliamente y así que supervisó el impacto de TIG3 sobre la distribución de filamentos de actina (Fig. 5B). En las células TIG3-negativos (EV), β-actina (rojo) distribuye por todo el citoplasma. Por el contrario, en las células TIG3-positivos (tinción verde) a distintas formas de anillo de filamentos de actina en la periferia nuclear (flecha roja). Esto se muestra en tanto una imagen resultante de la concentración y la tinción β-actina solo (Fig. 5B). Se contó el número de células que presentan un anillo de actina nuclear. El gráfico muestra que el porcentaje de células que presentan un anillo de actina nuclear se incrementa notablemente en las células que expresan TIG3.
Debido a que el movimiento de orgánulos y anclaje dependen de las redes de tubulina y actina [29], que prevé que puede influir en TIG3 distribución orgánulo. Para evaluar el impacto de TIG3 de la ubicación orgánulo, se tiñeron las células para detectar GM130 (cis-Golgi), receptor de manosa-6-fosfato (M6PR, trans-Golgi y el endosoma tardío) [30], Rab11 (endosomas de reciclaje), calnexina ( retículo endoplasmático), y clatrina cadena pesada (CHC, vesículas de transporte intracelular). Higo. 6A muestra que GM130 (rojo) se localiza en una localización perinuclear de las células TIG3-negativos y positivos; sin embargo, parece más compactado en células TIG3-positivos (mancha verde). M6PR, Rab11 y calnexina también aparecen compactados en el lugar pericentrosomal en TIG3-positivo células (flechas blancas). Esto se visualiza fácilmente para calnexina, mediante la comparación de la distribución que se muestra la imagen de un solo color rojo (inserto) en con la observada en células EV-infectadas (Fig. 6A), como una concentración pericentrosomal intensa de calnexina se observa en las células TIG3-positivos . Además, la cadena pesada de clatrina es un ejemplo particularmente dramático en que la tinción aparece distribuye por todo el citoplasma de las células infectadas con EV, pero esencialmente todo el CHC se acumula en las proximidades del centrosoma en células TIG3-positivos. Así, parece que TIG3 altera la distribución orgánulo intracelular en una forma que se concentra y comprime muchos orgánulos en el entorno de la centrosoma. Esta compactación se cuantificó midiendo el área de dos dimensiones cubierto por orgánulos individuales en micras cuadradas usando ImageJ Software (Fig. 6B). Este análisis revela una reducción sustancial y estadísticamente significativo en el área de GM130, M6PR y rab11. Calnexina y distribución CHC no se analizó de esta manera, ya que la condensación era evidente. También se examinó el impacto de TIG3 el nivel de proteína orgánulo. Higo. 7 muestra que la expresión TIG3 causa una modesta reducción en el nivel de algunas proteínas de orgánulos, incluyendo calnexina, Rab11, GM130 y EEA1; Sin embargo, el nivel de otras proteínas marcadoras no se altera.
Un SCC-13 células fueron infectadas en un 10 MOI tAd5-EV o tAd5-TIG3 y después de 24 h fijadas y teñidas para detectar TIG3 (verde) y varios marcadores de orgánulos (rojo). Los marcadores incluyen GM130 (cis-Golgi), M6PR (receptor de manosa-6-fosfato, trans-Golgi y endosoma tardío), rab11 (endosoma reciclaje), calnexina (ER), y CHC (cadena pesada clatrina, intracelular de vesículas de transporte). Las flechas blancas indican la localización de pericentrosomal TIG3. Los núcleos se tiñen de color azul. Para GM130, M6PR y rab11, todos los paneles son rojas /las imágenes fusionadas verde /azul. Los EV y TIG3 imágenes de tinción calnexina son rojos imágenes /verde /azul fusionadas. Las inserciones en la TIG3 imagen /calnexina son imágenes de un solo color. Para la tinción de CHC, sólo se muestra la imagen de color rojo (CHC). Bares = 10 micras. B TIG3 impacto sobre la distribución del orgánulo subcelular. Para medir la propagación orgánulo, el microscopio se centró en el plano z mostrando la propagación orgánulo máxima y el área cubierta por el orgánulo se controló mediante el software ImageJ y presentado como área orgánulo en m
2. Los valores son la media ± SEM (n = 30 campos) incluyendo la medición de un mínimo de treinta células por grupo de tratamiento. Emparejado análisis de la prueba t de Student se identifican los medios como significativamente diferentes (p & lt; 0,001).
células SCC-13 se infectaron por 10 MOI tAd5-EV o tAd5-TIG3 y después de 24 h lisados celulares se preparado para la detección de inmunotransferencia de las proteínas indicadas. expresión TIG3 reduce el nivel de rab11, GM130 y EEA1, pero no altera el nivel LÁMPARA1. Los pesos moleculares se indican a la izquierda de la mancha en kDa.
Discusión
TIG3 (tazaroteno inducida gen 3) fue originalmente identificado como una mayor tras el tratamiento de los queratinocitos epidérmicos cultivados o psoriásica epidermis con el retinoide sintético, tazaroteno [6], y se identificó más tarde en células de cáncer gástrico y llamaron rig1 [5]. Estudios posteriores revelan TIG3 mRNA en una gama de tejidos y células en cultivo [1], [5], [31] - [33]. nivel TIG3 se aumenta por tratamiento con retinoides [4], [34] y en algunos tipos de células TIG3 la expresión del gen es suprimida por MAPK señalización [35].
TIG3 es un miembro de la superfamilia de NIPC /P60 de proteínas [ ,,,0],36]. El dominio N-terminal (aa1-134) codifica las regiones que se conservan entre los miembros de la aciltransferasa lecithin:retinol (LRAT) y H-REV familias supresores de tumores [37] - [39]. Análisis funcional de la estructura TIG3 indica que el dominio hidrófobo (aa135-164) funciones de C-terminal como un anclaje a la membrana [6], [23] y que el N-terminal de la región codifica fosfolipasa independiente del calcio A1 /2 la actividad [31] , [32], [40]. Por otra parte, la fosfolipasa A1 de actividad /2 no requiere que el dominio hidrófobo C-terminal [40]. TIG3 se ha demostrado para reducir la supervivencia celular en una serie de tipos de células [6], [10], [11], [34], [41], [42], pero el mecanismo responsable de la supresión no se entiende bien. En algunos tipos de células, TIG3 puede actuar a través de la regulación de la MAPK y PI3K /Akt señalización [1], [3], [41].
TIG3 en la epidermis
TIG3 se expresa en la suprabasal capas diferenciadas de los cultivos de queratinocitos balsa [12] y en la epidermis suprabasal [7], [8], y la expresión TIG3 se reduce en la enfermedad hiperproliferativa de la piel y en las células de cáncer de piel [6] - [9]. tratamiento con retinoides aumenta el nivel de TIG3 y esto se asocia con la proliferación celular reducida [6] - [9]. TIG3 no se expresa en queratinocitos normales mantenidas en cultivo monocapa y expresión TIG3 mediada por vector se asocia con el número de células reducido [8], [10] - [12]. Estudios mecanicistas en queratinocitos muestran que se requiere la membrana C-terminal de dominio de anclaje para la actividad [10], [11], [23], y eventos relacionados con la diferenciación que la expresión de TIG3 en queratinocitos cultivados humanos normales se activa selecciona [10] - [ ,,,0],12]. En particular, TIG3 interactúa con transglutaminasa de tipo I (TG1) para aumentar TG1 actividad catalítica [10], [11]. TG1 es una enzima clave en los queratinocitos diferenciales que cataliza la formación de reticulaciones proteína-proteína que conducen a el montaje de la envoltura córnea, un componente importante de la barrera de permeabilidad de la piel [43]. TIG3 proteína de longitud completa estimula la actividad transglutaminasa diferenciación asociada en los queratinocitos. Por el contrario, las formas truncadas amino-terminal causan apoptosis y el nivel de apoptosis es más pronunciado a medida que el extremo N-terminal se acorta [12]. Otros estudios apuntan a efectos únicos de varios subdominios TIG3 [40], [42], [44]. El patrón de expresión suprabasal TIG3 en epidermis es consistente con un papel de TIG3 como un controlador de eventos relacionados con la diferenciación de queratinocitos.
expresión TIG3 en células de cáncer de la piel reduce la proliferación y aumenta la apoptosis
Estudios anteriores indican que TIG3 mRNA está presente a niveles reducidos en el cáncer de piel y en líneas celulares de cáncer de piel [8]. Sin embargo, poco se sabe acerca de si TIG3 regula la supervivencia celular de cáncer de piel y la progresión del tumor. Se demuestra que la expresión de TIG3 causa una marcada reducción en SCC-13 número de células que se asocia con una reducción de G1 y eventos fase S y el aumento de contenido de ADN sub-G1. Estos cambios del ciclo celular se asocian con cambios TIG3 dependiente en el nivel de la proteína reguladora del ciclo celular. TIG3 expresión de ciclina D1 y reduce los niveles de ciclina E y aumenta el nivel del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p21. Estos resultados son consistentes con una reducción en la progresión de la célula a través de la transición G1 /S. Además, se demuestra que aumenta TIG3 SCC-13 apoptosis de las células como se evidencia por el aumento de la producción de caspasa activado 9 y 3 y el aumento de PARP escindida. Además, los estudios de inmunotinción revelan PARP escindido acumula en las células TIG3-positivos. Estos resultados son particularmente interesantes como TIG3 no causa apoptosis en queratinocitos humanos normales. En su lugar, TIG3 hace que las células de someterse a la diferenciación [10] - [12]. Por el contrario, las formas mutantes de TIG3 causan apoptosis en queratinocitos humanos normales [12]. El hecho de que TIG3 provoca apoptosis en células de cáncer sugiere un mecanismo de acción diferente en las células normales frente a transformadas. Además, algunos de estos cambios están asociados con los cambios en el nivel de ARNm del gen diana. Por ejemplo, el aumento TIG3 dependiente de la proteína p21 se asocia con un aumento paralelo de mRNA p21 de codificación, lo que indica que TIG3 regula la transcripción de genes p21 o la estabilidad del ARN. Nosotros no sabemos si actualmente esta acción es directa o indirecta.
TIG3 expresión se asocia con la agrupación orgánulo pericentrosomal
Una cuestión importante es donde TIG3 se localiza en la célula. Un estudio previo interesante en células de cáncer cervical HeLa sugiere que TIG3 localiza en el cis- y trans-Golgi y que se requiere esta localización para estimular la apoptosis [2]. Como se muestra en la Fig. 6A, anticuerpo co-tinción de SCC-13 células sugiere que TIG3 localiza en el cis- y trans-Golgi (GM130, M6RP), el endosoma tardío (M6PR), el endosoma reciclaje (Rab11), el retículo endoplásmico (calnexina) y las vesículas de transporte intracelular (CHC). Sin embargo, creemos que es poco probable que TIG3 se localiza principalmente en estas estructuras por varias razones. En primer lugar, TIG3 sólo aparece para localizar con el orgánulo sólo en la vecindad inmediata del centrosoma y no más periféricamente. En segundo lugar, demostramos que TIG3 altera la distribución de los microtúbulos y microfilamentos y esto se asocia con la acumulación orgánulo pericentrosomal. En tercer lugar, en otro informe que estamos estudiando la distribución de TIG3 en los queratinocitos humanos normales y estos estudios sugieren fuertemente una ubicación TIG3 pericentrosomal (no se muestra). Sobre la base de estos hallazgos, se argumenta que el principal efecto de TIG3 está en el centrosoma y que la aparición de colocalización de TIG3 con marcadores de orgánulos es un artefacto debido a la conglomeración orgánulo pericentrosomal.
Orgánulos reubicación es una bien conocida fenómeno que se produce durante la apoptosis [45]. Se cree que mejorar la mezcla para facilitar la propagación de efectores pro-apoptóticos de la membrana de orgánulos [45] - [50]. Sin embargo, como estos orgánulos y fragmentos de orgánulos se unen durante la apoptosis que no se entiende bien, pero se cree que la participación del centrosoma y los microtúbulos. El centrosoma sirve como un centro de organización de microtúbulos (COMT) en células en interfase y como organizador del aparato mitótico de las células mitóticas. Como centro de nucleación de microtúbulos, se requiere la función del centrosoma para el tráfico intracelular de orgánulos [24], [51]. Orgánulos se mueven a lo largo de los microtúbulos asociados a proteínas motoras específicas [27], [51]. En informes anteriores implican motores de microtúbulos en traer fragmentos de orgánulos y orgánulos al centro de organización de microtúbulos (centrosoma) durante la apoptosis [45], [52]. Estos incluyen el aparato de Golgi, endosomas, retículo endoplásmico, mitocondrias y otros orgánulos [45], [47], [53], [54]. El mejor ejemplo es caracterizado redistribución de la mitocondria al centro organizador de microtúbulos Golgi-proximal en las células expuestas a TNF, el estrés oxidativo o la infección viral [45]. Varios informes sugieren que este proceso se activa señalización MAPK de fosforilar kinesin cadena ligera para detener mitocondrias dispersión anterógrada lleva a la acumulación de estos orgánulos cerca del centrosoma [45].
Estos informes anteriores describen la agrupación orgánulo pericentrosomal en respuesta al tratamiento con factores de crecimiento, estrés oxidativo o otros estímulos [45]. Nuestros estudios actuales son únicos en que la agrupación orgánulo se activa por la expresión de una proteína supresora de tumor. Por otra parte, el hecho de que TIG3 acumula cerca del centrosoma sugiere que puede tener un papel directo en la regulación del movimiento de orgánulos durante la apoptosis. Nuestros estudios revelan que la presencia TIG3 altera la localización subcelular normal de los microtúbulos y microfilamentos, que puede ser un mecanismo por el cual se altera ubicación orgánulo. Los estudios futuros tendrán que abordar si TIG3 también altera los microtúbulos dependiente del motor, transporte de orgánulos. Nuestra hipótesis de trabajo es que TIG3 puede alterar tanto la distribución de los microtúbulos y la función motora basada en microtúbulos para causar la agrupación orgánulo pericentrosomal. Sobre la base de nuestro análisis, TIG3 promueve la acumulación de los orgánulos en el centrosoma incluyendo retículo endoplasmático, aparato de Golgi, endosomas de reciclaje, endosoma tardío, y las vesículas de transporte. Sin embargo, no todos los organelos son transportados al centrosoma. Por ejemplo, los lisosomas, según se mide mediante la detección de LAMP1, distribuyen en matrices a lo largo de los microtúbulos y, en células TIG3-positivos, este patrón se intensifica (no mostrado). Por lo tanto, serán necesarios estudios adicionales para comprender el papel de TIG3 en la regulación de la función de los microtúbulos y orgánulos de transporte.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y adenovirus infección
SCC-13 se obtuvieron células de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) y se mantuvieron en DMEM de alta glucosa (Gibco, 11960-044) suplementado con 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml estreptomicina y suero bovino fetal al 5% (Sigma, St. Louis, MO). Los adenovirus se produjeron como se describe anteriormente [10]. tAd5-TIG3
1-164, es un virus inducible por tetraciclina que codifica la proteína de longitud completa TIG3 y un elemento potenciador de la tetraciclina que responde a [10], [11]. El virus Ad5-TA codifica el transactivador de tetraciclina (TA). tAd5-EV es un virus de vacío usado como control. Para la infección, las células se lavaron con PBS, se incubaron con 10 MOI de TIG3-codificación o virus vacío en presencia de 5 MOI de Ad5-TA en DMEM que contenía 6 mg /ml polibreno (Sigma, H9268). Después de 5 h, el medio se reemplazó con medio de incubación y libre de virus se continuó durante 24 a 72 h adicional antes de la preparación de células y extractos para inmunohistología y de inmunotransferencia.
Métodos inmunológicos
Para inmunotransferencia, los extractos se prepararon en tampón de lisis celular (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, que contiene NaCl 150 mM, 1 mM etilenglicol-bis (aminoetiléter) tetraacético, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 2,5 mM pirofosfato de sodio, glicerofosfato 1 mM, 1 vanadato de sodio mM, 1 mg /ml de leupeptina (Cell Signaling, 9803, Danvers, MA) y 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo. la concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteínas Bradford de Bio-Rad (Bio-Rad,