Extracto
TRAIL es un ligando del receptor de muerte que induce la muerte celular preferentemente en las células tumorales. TRAIL soluble recombinante, sin embargo, se realiza mal como un terapéutico contra el cáncer ya que se requiere para la oligomerización potente actividad biológica. Hemos generado previamente un formato diacuerpo de TRAIL-dirigida de tumor denomina Db
αEGFR-scTRAIL, que comprende moléculas de cadena sencilla (TRAIL scTRAIL) y los dominios variables de una variante humanizada del anticuerpo EGFR bloqueando Cetuximab. Aquí se define la bioactividad de Db
αEGFR-scTRAIL con respecto tanto a la inhibición del EGFR y la activación del receptor TRAIL en cultivos 3D de células de cáncer de Caco-2 colorrectales, que expresan de tipo salvaje K-Ras. En comparación con los cultivos convencionales 2D, células Caco-2 se muestran mejorado fuertemente la sensibilidad hacia Db
αEGFR-scTRAIL en estos cultivos 3D. Se demuestra que la fracción de anticuerpo de Db
αEGFR-scTRAIL no sólo compitió de manera eficiente con la función de EGFR inducida por ligando, pero también determinó la respuesta apoptótica dirigiendo específicamente Db
αEGFR-scTRAIL a las células EGFR-positivo. Para hacer frente a la forma aberrante activa K-Ras, lo que conduce a la resistencia a Cetuximab, afecta Db
sensibilidad αEGFR-scTRAIL, hemos generado células Caco-2tet estables que expresan de manera inducible oncogénico K-Ras
G12V. En presencia de doxiciclina, estas células mostraron una mayor resistencia a la Db
αEGFR-scTRAIL, asociada con la elevada expresión de las proteínas anti-apoptóticas cIAP2, Bcl-xL y Flip
S. Co-tratamiento de las células con la Smac mimética SM83 restauró la respuesta apoptótica Db
αEGFR-scTRAIL inducida. Es importante destacar que esta sinergia entre Db
αEGFR-scTRAIL y SM83 también tradujo a cultivos 3D de oncogén K-Ras que expresan las células de cáncer colorrectal LoVo HCT-116 y. Nuestros resultados apoyan la idea de que DB
terapia αEGFR-scTRAIL en combinación con agentes sensibilizantes a la apoptosis puede ser prometedor para el tratamiento de los cánceres colorrectales EGFR-positivos, independientemente de su
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de estado.
Visto: Möller Y, Siegemund M, beyes S, R Herr, Lecis D, Delia D, et al. (2014) TRAIL EGFR y un Smac mimética Synergize para Superar la resistencia a la apoptosis en células
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mutante cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (9): e107165. doi: 10.1371 /journal.pone.0107165
Editor: John Souglakos, Hospital General Universitario de Heraklion y Laboratorio de Biología de Células Tumorales, Escuela de Medicina de la Universidad de Creta, Grecia
Recibido: June 2, 2014; Aceptado: August 4, 2014; Publicado: 8 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Möller et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Este trabajo fue financiado por el Ministerio Federal de Educación und Forschung (BMBF; http://www.bmbf.de/) e:. Bio subvención 'PREDICT' de la MAO, RK y KP. RH y la tuberculosis son apoyados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; http://www.dfg.de/) a través del Centro de Investigación Cooperativa 850 y la Iniciativa de Excelencia de la BMBF a través de EXC 294 BIOSS. TB y MAO son apoyados por el programa de Heisenberg de la DFG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. DL y DD son los inventores de la patente WO /2013/124701 (PCT /IB2012 /000297: 'homo y heterodímeros compuestos miméticos SMAC como inductores de apoptosis'). KP y RK y MS son los inventores de la patente CA2831820 A1 (PCT /EP2012 /001426: 'polipéptidos miembro de la familia de ligandos TNF recombinantes con dominio de unión de anticuerpos y usos de los mismos "). KP es un consultor y ha recibido financiación de la investigación comercial del SME. RK es un consultor y ha recibido financiación de la investigación comercial de BionTech. Los autores confirman que esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más frecuentes en todo el mundo y especialmente en pacientes con CCR avanzado tasas de supervivencia son bajas [1]. Además de la quimioterapia, terapias dirigidas han entrado en la clínica. En la actualidad, el EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) anticuerpos bloqueantes cetuximab y Panitumumab están aprobados para el tratamiento del CCR metastásico en combinación con quimioterapia o como terapia de mantenimiento en los tumores quimio-refractario [2], [3].
EGFR, también conocido como ErbB1 o HER1, se asocia con la patogénesis de diversos cánceres epiteliales humanos. Esta tirosina quinasa del receptor comprende un dominio extracelular de unión al ligando, una región que abarca la membrana única, y un dominio de tirosina quinasa citoplasmática [4], [5]. Tras la unión de ligandos tales como EGF y TGF-α, la homo- receptor y heterodimerizes preferentemente con el miembro de la familia ErbB2 /HER2 conduce a la activación del receptor y la transfosforilación de tirosinas específicas dentro de las colas citoplasmáticas. Estos fosfotirosinas proporcionan sitios de atraque para moléculas de señalización intracelulares que desencadenan la activación de MAPK y PI3K vías, que median las respuestas biológicas tales como la proliferación, la migración y la supervivencia [5], [6]. Cetuximab compite con ligandos de EGFR para la unión al receptor, la fosforilación del receptor reprimiendo de ese modo y la activación de la señalización aguas abajo [1].
Las diferentes alteraciones genéticas encontradas en CRC limitan la eficacia de las terapias anti-EGFR. Casi el 40% de todos los casos de CCR albergan mutaciones activadoras en el
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gen. Receptor de señalización de la tirosina quinasa converge al nivel de la pequeña GTPasa Ras, un regulador maestro de ambos, las vías de MAPK y PI3K. Las mutaciones más frecuentes se producen en el codón 12 o 13, que conduce a la activación constitutiva Ras y, en consecuencia, la reducción o falta de respuesta al tratamiento Cetuximab [7], [8].
TRAIL (necrosis apoptosis relacionado con el factor-tumor ligando inductor) es un ligando de muerte que induce la apoptosis preferentemente en las células tumorales a través de los receptores de muerte y TRAILR1 TRAILR2, también conocidos como DR4 y DR5, respectivamente [9]. La unión de TRAIL provoca la oligomerización del receptor, seguido por el reclutamiento de proteínas adaptadoras y la formación del complejo de señalización inductor de la muerte. En última instancia, conduce a la activación de caspasas iniciadoras y la activación consecutiva de caspasas efectoras, lo que resulta en la muerte celular apoptótica [10]. Los ensayos clínicos utilizando TRAIL recombinante confirmaron la baja toxicidad para los tejidos normales, pero los efectos terapéuticos fueron insuficientes [11], [12]. Para superar estos enfoques de ingeniería de proteínas limitaciones han dirigido a mejorar la bioactividad mientras se mantiene la selectividad tumor. Correcta trimerización y zinc coordinación de TRAIL recombinante parece ser crucial para la actividad biológica [13]. De acuerdo con ello, el diseño de una cadena polipeptídica única que comprende los dominios extracelulares de tres monómeros TRAIL (scTRAIL) mejoró la bioactividad de la molécula recombinante [14]. Tales moléculas pueden además estar fusionados a anticuerpos dirigidos contra marcadores tumorales. Anteriormente puso de manifiesto que la fusión de scTRAIL a un fragmento de anticuerpo de cadena única (scFv) funcionalmente imitado TRAIL unido a la membrana natural y fue más eficaz que scTRAIL sola [14]. La introducción de una configuración diacuerpo basado en las regiones variables humanizadas de Cetuximab (Db
αEGFR-scTRAIL) dio lugar a una bioactividad aún mayor de TRAIL recombinante tanto in vitro como in vivo, como se ve por la fuerte reducción del tamaño del tumor y prolongada supervivencia de los ratones desnudos que llevan xenoinjertos de Colo205 [15].
Además de su efecto de orientación tumor, el resto de anticuerpo EGFR dirigida contenida dentro de la Db
molécula αEGFR-scTRAIL puede interferir activamente con la función de EGFR, mientras que la estimulación simultánea apoptosis. Para diseccionar la contribución del bloqueo de EGFR a la bioactividad de Db
αEGFR-scTRAIL que utiliza las células Caco-2 línea celular CRC EGFR-positivo, que alberga las mutaciones en APC, p53, y SMAD4 pero es de tipo salvaje para la MAPK y vías PI3K [16]. Para imitar más de cerca la situación in vivo, se hicieron crecer células Caco-2 en cultivos de colágeno /3D Matrigel donde forman quistes polarizados completamente diferenciadas [17]. se conocen las condiciones de crecimiento para influir en el equilibrio de las señales de supervivencia y apoptosis, poniendo de relieve la necesidad de estudiar los mecanismos de tratamiento de drogas y de resistencia no sólo en cultivos 2D convencionales [18]. De hecho, nuestros resultados muestran que el cultivo de células Caco-2 en una matriz 3D hace que las células sensibles a TRAIL. Además, demuestran que la señalización de EGFR contribuye a la proliferación de células Caco-2 y puede ser bloqueada por la inhibición del EGFR farmacológica. La importancia del resto de anticuerpo-EGFR específico para la selección eficaz de Db
αEGFR-scTRAIL es subrayada por el hecho de que los bajos niveles de EGFR caracterizan la subpoblación de células que sobrevive Db
tratamiento αEGFR-scTRAIL. Por otra parte, aunque insensibles a EGFR bloqueo per se, las células mutantes Ras CRC EGFR-positivos están dirigidos y sensibilizaron a Db
apoptosis αEGFR-scTRAIL inducida por el co-tratamiento con la Smac mimética SM83. La potente actividad citotóxica de Db
αEGFR-scTRAIL revela en este estudio por lo tanto se presta apoyo a su desarrollo como un anti-cáncer terapéutico para el tratamiento de la CRC.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos utilizados fueron conejo monoclonal anti-pEGFR (Y1068) (1:1000), conejo monoclonal anti-caspasa-3 (1:1000), policlonal de conejo anti-TRAILR2 (1:500), policlonal de conejo anti-perk (T202 /Y204) (1:1000), conejo monoclonal anti-pAKT (T308) (1:1000), policlonal de conejo anti-cIAP1 (1:1000), conejo monoclonal anti-cIAP2 (1:1000 ), ratón monoclonal anti-ERK (1:1000), monoclonal de ratón anti-AKT (pan) (1:1000), ratón monoclonal anti-cadherina E (1:250), ratón monoclonal anti-Smac (1:1000), policlonal de conejo anti-Bcl-2 (1:1000), conejo monoclonal anti-Bcl-xL (1:400) y conejo monoclonal anti-survivin (1:1000) (todos de Cell Signaling, Danvers, MA, EE.UU.), monoclonal ratón anti-xIAP (1:400), monoclonal de ratón anti-Ras (1:200) (BD, CA, San Jose, EE.UU.), monoclonal de ratón anti-voltea /L (1:400) y policlonal de conejo anti-TRAILR1 (1 :1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.), ratón monoclonal anti-EGFR (1:500) (Thermo Scientific, Fremont, MA, EE.UU.), ratón monoclonal anti-alfa-tubulina (1:5000) (Sigma -Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.), y el ratón monoclonal anti-GFP (1:1000) (Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania). HRP-etiquetados secundario anti-ratón y anticuerpos IgG anti-conejo (1:10000) eran de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). Alexa Fluor 488- y 546-etiquetados secundario anti-ratón y anticuerpos IgG anti-conejo (1:500) y faloidina marcada con Alexa Fluor 633 (1:100) fueron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). DAPI fue de Sigma-Aldrich, Z-VAD-FMK era de Bachem AG (Bubendorf, Suiza), y Cetuximab de Merck (Darmstadt, Alemania). Db
αEGFR-scTRAIL se produjo en células HEK293 y se purifica a partir de sobrenadantes de cultivo de células [15]. La síntesis y purificación de SM83 se describió anteriormente [19], [20].
Cultivo de células
Caco-2, HCT-116, y LoVo líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen ), y Caco-2tet células en DMEM (Invitrogen) suplementado con 10% de FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania). Las líneas celulares se incubaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C. Por factor de crecimiento de células dependientes de ensayos se cultivaron en medio que contenía 2% de FCS más 10 ng /ml EGF (Sigma-Aldrich) y TGF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.). Para el crecimiento en 3D, las células fueron sembradas en una cama del factor de crecimiento reducido Matrigel (BD) y colágeno PureCol-S (Avanzado Biomatrix, San Diego, CA, EE.UU.) (01:01) y se cubrieron con medio de cultivo que contenía 2% de matrigel. la expansión del lumen fue inducida por la adición de 100 choleratoxin ng /ml. (CTX; Sigma Aldrich) en el día 3 después de la siembra
Generación de células Caco-Ras 2tet
células G12V
El PTET /
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G12V-IRES-GFP-BSR vector de expresión, que permite la expresión inducible por doxiciclina de K-Ras
G12V, se generó mediante la recuperación del K-Ras
G12V de lectura abierto fotograma de pBABE-K-Ras
G12V (Addgene) por
BamH
I digestión, seguido de la inserción en el
Bgl
linealizado-II vector pMIG [21]. El K-Ras
G12V-IRES-GFP casete resultante fue amplificado por PCR utilizando oligonucleótidos que contienen flanqueando
No
sitios, que fueron utilizados para la subclonación en PSC-A-amp /kan (Stratagene, La Jolla , CA, EE.UU.). Posteriormente, el K-Ras
G12V-IRES-GFP casete se clonó a través de
No
la digestión en el vector PTET-BSR [22], dando PTET /K-Ras
G12V-IRES GFP-BSR. Para conseguir la expresión inducible por doxiciclina de oncogénico K-Ras, las células Caco-2tet, expresan de forma estable los componentes del sistema inducible por doxiciclina rtTA y RTT [21], se transfectaron con el
Ahd
I-linealizado pTet /K- Ras
G12V-IRES-GFP-BSR vector mediante electroporación. Después de la selección con blasticidine S (5 mg /ml) y puromicina (5 g /ml), conjuntos de células resistentes se seleccionaron para la inducción eficiente de K-Ras
expresión G12V. La expresión del transgen fue inducida por la adición de 2 mg /ml de doxiciclina (Merck).
análisis FACS
Análisis de la expresión transgénica de las células Caco-2tet se realizó después del tratamiento 72 dox. Las células se lavaron, se resuspendieron en PBS que contenía 2% de FCS y azida de sodio al 0,01%, y se analizaron usando un EPICS FC500 (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania). análisis de datos posteriores a la adquisición se realizó utilizando el software FlowJo (árbol de la estrella; Ashland, Oregón, EE.UU.).
Western Blot
Las células se lisaron en tampón RIPA (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,5 desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, ortovanadato de sodio 1 mM, fluoruro de sodio 10 mM y beta-glicerofosfato más proteasa completa inhibidores 20 mM (Roche)). Para lisados 3D, las células fueron cultivadas en Matrigel puro sin colágeno. Esferoides se aislaron después de 4 días usando solución de recuperación de la célula (BD) y se lisaron en tampón RIPA. Los lisados se clarificaron por centrifugación, cantidades iguales de proteína se separaron mediante SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris gel; Invitrogen) y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (iBlot Gel de transferencia de pilas; Invitrogen). Las membranas se bloquearon con 0,5% de reactivo de bloqueo (Roche) en PBS que contenía 0,1% de Tween-20 y se incubaron con anticuerpos primarios, seguido de anticuerpos secundarios conjugados con HRP. La visualización se realiza con el sistema de detección ECL (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
Ensayos
MTT, citotoxicidad, y la caspasa 3/7 de actividad
Para los cultivos 2D, 2,5 × 10
3 células /pocillo en 100 l de medio se sembraron en placas de 96 pocillos no recubiertos. Para los cultivos en 3D, 5 × 10
3 células /pocillo fueron sembradas en matrigel /placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno en 100 l de medio que contiene 2% matrigel. La viabilidad se determinó mediante la adición de 10 l de 3- (4,5-dimetiltiazol-2yl-) tetrazolio 2,5-difenil (MTT; Roth, Karlsruhe, Alemania) solución (5 mg /ml) seguido de incubación durante 3 h. Las células se lisaron mediante la adición de 100 l 50% de dimetilformamida que contiene 10% de SDS y se midió la absorbancia a 570 nm utilizando el lector de multimodo Infinito 200 PRO (Tecan, Männedorf, Suiza). La citotoxicidad se midió utilizando el Ensayo de citotoxicidad CytoTox-Glo de Promega (Madison, WI, EE.UU.). La actividad de proteasa de células muertas en el cultivo se determinó mediante la adición de 50 l de sustrato luminógeno. Después de 15 min de incubación a RT, la luminiscencia se midió usando el lector de multimodo Infinito 200 PRO (Tecan), seguido de la lisis celular y la medición de la luminiscencia total para la normalización.
se determinó la caspasa 3/7 actividad usando la caspasa Glo3 /7 Ensayo de Promega (Madison, WI, EE.UU.) por adición de 70 l de sustrato luminógeno que contiene la secuencia DEVD. Después de 30 min de incubación a RT, la luminiscencia se midió usando el lector de multimodo Infinito 200 PRO (Tecan).
Tunel tinción
ADN roturas de la cadena se analizaron con el kit de detección de muerte celular in situ (TMR ) de Roche. Las células fueron fijadas con PFA al 4% durante 1 h a TA y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en citrato de sodio 0,1% durante 2 minutos a RT. Etiquetado se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para 1 h a 37 ° C. Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Los portaobjetos se montaron en Fluoromount G (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, EE.UU.) y se analizaron en un microscopio confocal de barrido láser (LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Alemania). Las imágenes fueron procesadas con el software ZEN (Zeiss). TUNEL-células positivas se contaron usando ImageJ (W. Rasband, Instituto Nacional de Salud, EE.UU., versión 1.48).
La inmunofluorescencia
Las células cultivadas en 3D en Matrigel /colágeno recubierta de 8 pocillos portaobjetos de cámara de vidrio (BD) se fijaron con PFA al 4% durante 15 min, se permeabilizaron con PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 durante 10 min y se bloquearon con 5% de suero de cabra (Invitrogen) en PBS que contenía 0,1% de Tween-20. Las células fueron incubadas con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo (2 h a TA), se lavaron con PBS que contiene 0,1% de Tween-20 y se incubaron con anticuerpo secundario en tampón de bloqueo (2 h a TA). F-actina y los núcleos se counterstained con Alexa Fluor 633 faloidina marcada con DAPI y. Los portaobjetos se montaron en Fluoromount G y se analizó en un microscopio confocal de barrido láser (LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Alemania), utilizando 488, 561 y 633 nm de excitación con aceite de lentes del objetivo Plan-Apocromático 63x /1.40 DIC M27. Las imágenes fueron procesadas con el software ZEN (Zeiss).
El análisis estadístico
Los datos se expresan como media (± S.E.M.), y 'n' se refiere al número de experimentos independientes. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t y ANOVA de una vía seguido de post-test de Tukey (GraphPad Prism versión 4.03; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativas (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001; ns, p & gt; 0,05).
Resultados
En 3D Matrigel culturas, células Caco-2 se diferencian en quistes polarizadas compuestos de una sola capa de células que rodea a un lumen central [17], [21], lo que refleja la organización organotípicos del colon. Debido a que estas células son EGFR-positivos y expresan Ras de tipo salvaje, que representan un sistema de modelo ideal para estudiar el efecto combinado de la inhibición de EGFR y un agente inductor de la apoptosis tales como TRAIL. Para probar la eficacia de primera Db
αEGFR-scTRAIL, Caco-2 células fueron cultivadas durante tres días en 3D en un medio que contenía FCS al 10% antes de la adición de Db
αEGFR-scTRAIL seguido por mediciones MTT tres días más tarde. En estos cultivos, dosis relativamente bajas de Db
αEGFR-scTRAIL causó una reducción significativa de la viabilidad celular que se asoció con la interrupción de quistes y la formación de cuerpos apoptóticos (Fig. 1a, b), scTRAIL solo o en combinación con Cetuximab no pudo provocar una respuesta citotóxica en Caco-2 3D culturas (Fig. S1), apoyando nuestros datos anteriores que la estructura dimérica diacuerpo mediada de Db
αEGFR-scTRAIL confiere bioactividad superior sobre scTRAIL [15]. Curiosamente, en cultivos celulares convencionales en 2D plástico, células Caco-2 eran altamente resistentes a Db
tratamiento αEGFR-scTRAIL (Fig. 1a, b), de acuerdo con un informe anterior utilizando TRAIL humano recombinante [23]. El tratamiento previo de las 2 Caco-3D cultivos con Z-VAD, un inhibidor de pan-caspasa, redujo significativamente el efecto citotóxico de Db
αEGFR-scTRAIL (Fig. 1c), y la inducción de apoptosis por Db
αEGFR- scTRAIL fue confirmada por el análisis de la fragmentación de ADN mediante tinción TUNEL (Fig. 1d, e). Además, en comparación con cultivos 2D, la activación dependiente de la dosis de las caspasas 3/7 en respuesta a Db
αEGFR-scTRAIL fue significativamente mayor en los cultivos 3D (Fig. 1f). Esta diferencia en la sensibilidad hacia Db
αEGFR-scTRAIL en 3D frente a cultivos 2D no podía atribuirse a cambios en EGFR o TRAILR1 /2 expresión (Fig. 1 g, h). Desafortunadamente, debido a que los receptores señuelo DcR1, DcR2 podría no ser detectado por inmunotransferencia con los anticuerpos disponibles, los cambios de expresión de estos receptores no se puede descartar. Análisis de las vías de señalización claves reveló que, en cultivos en 3D, la actividad de la vía PI3K se suprimió en comparación con las células cultivadas en 2D como se mide por los niveles de fosfo-Akt mientras que la vía ERK /MAPK se upregulated como se ve por el aumento de 2 fosforilación /ERK1 ( Fig. 1 g, h). Sin embargo, la inhibición de PI3K por LY294002 en cultivos 2D no era suficiente para sensibilizar a las células para Db
αEGFR-scTRAIL (datos no presentados), lo que indica un escenario más complejo en cultivos 3D. En conjunto, estos resultados ponen de relieve el impacto de las condiciones de cultivo en la respuesta celular a agentes inductores de apoptosis.
Las células fueron cultivadas en 3D o 2D en medio que contiene 10% de FCS. (A) Tres días después de la siembra, los cultivos fueron tratados con Db
αEGFR-scTRAIL. La viabilidad se midió 72 h más tarde mediante el ensayo de MTT y se normalizaron con el control sin tratar (n = 3). (B) Imágenes de contraste de fase de los cultivos 2D y 3D se describen en (a) tratado con las concentraciones indicadas de Db
αEGFR-scTRAIL durante 72 h (barra de escala: 50 micras). (C) Tres días después de la siembra, los cultivos 3D fueron pretratados con 20 mM Z-VAD como se ha indicado antes de la adición de 1 nM Db
αEGFR-scTRAIL. La viabilidad se midió 72 h más tarde mediante el ensayo de MTT y se normalizaron con el control sin tratar (UT) (n = 3). (D) 24 h después del tratamiento, las células se fijaron y se tiñeron para roturas de la cadena de ADN. Se contaron las células TUNEL positivas (n = 2). (E) las imágenes representativas de las coloraciones Tunel descritos en (d), las células TUNEL positivas (rojo), DAPI (núcleos; azul). Se demuestran las secciones confocal (barra de escala: 100 micras). (F) Tres días después de la siembra, los cultivos se trataron con 0,1 nM o 1 nM Db
αEGFR-scTRAIL para 24 h. se midió la caspasa 3/7 actividad y normalizado a la respectiva control sin tratar (UT) (n = 3). (G) Cuatro días después de la siembra, los lisados se generaron y se analizó mediante inmunotransferencia. Se muestra es una mancha representativos de tres experimentos independientes. Tubulina se detectó como control de carga. bandas específicas están marcadas por puntas de flecha. (H) La cuantificación de las transferencias Western a partir de (g). Los niveles de proteína se normalizaron con el control correspondiente tubulina; Se establecieron los niveles en los cultivos 2D como 1 (n = 3).
A continuación se investigó cómo la presencia de ligandos de EGFR crecimiento y la diferenciación de las células Caco-2 en los cultivos 3D afectada. Las células se sembraron en cultivos que contienen matrigel bajo suero (2%) en presencia de EGF o TGF-α, asegurando que la proliferación se debió principalmente a través de la señalización de EGFR. mediciones de la actividad de MTT después de seis días de cultivo indicaron que EGF y TGF-α aumentaron la proliferación de células Caco-2 en comparación con células de control cultivadas en suero bajo solamente (Fig. 2a). El análisis microscópico reveló que en presencia de EGF y TGF-alfa Caco-2 quistes eran más grandes y contenía más células (Fig. 2b). En particular, la adición de ligandos de EGFR no interfirió con la diferenciación, a juzgar por la distribución típica apical de F-actina y la formación de un lumen libre de células (Fig. 2b). Para hacer frente a la forma de EGFR bloqueo basal afectados y EGFR proliferación inducida por ligandos de Caco-2 establecidos quistes, se trataron las células tres días después de la siembra con cetuximab (0,5 M) y se analizaron las culturas tres días más tarde. En comparación con el control, en estas culturas la actividad MTT se redujo significativamente en un 35-50%, pero las células eran todavía viables, no mostró signos de apoptosis y de manera insignificante aumento de la citotoxicidad (figura 2c-e;. S1d). Esto indica que la activación de EGFR contribuye a la proliferación basal, pero no es necesario para la supervivencia. Cetuximab también inhibió la proliferación en presencia de EGF y TGF-α como se ve por la reducción de la actividad de MTT y el tamaño reducido de los quistes (Fig. 2c, d). En conjunto, estos experimentos demuestran que la proliferación de células Caco-2 en cultivos 3D puede ser impulsado por la señalización del EGFR y es sensible a la inhibición del EGFR farmacológica, y por lo tanto potencialmente pueden ser suprimidas por Db
αEGFR-scTRAIL.
Caco -2 células se hicieron crecer en cultivos 3D que contiene 2% de FCS en presencia de factores de crecimiento (10 ng /ml) o en 2% solamente FCS (con). (A) Los cultivos se analizaron mediante el ensayo de MTT en el día 6 y se normalizaron con el control (n = 5). (B) Tres días después de la siembra de 100 ng /ml se añadió CTX para inducir la expansión del lumen. Esferoides se fijaron en el día 6 y se tiñeron con faloidina (F-actina) y DAPI (núcleos). Se muestran las secciones confocal de un quiste representante (barra de escala: 10 micras). (C) Tres días después de la siembra, los cultivos 3D se dejaron sin tratar o tratados con 0,5 M Cetuximab (AEC) durante 72 h. La viabilidad se determinó mediante el ensayo de MTT y se normalizaron con el control sin tratar (UT). (N = 4) (d) Caco-2 3D cultivos se dejaron sin tratar o se trataron con 0,5 mM Cetuximab para 72 h y se analizaron por microscopía de fase (barra de escala: 50 micras). (E) Tres días después de la siembra, los cultivos 3D se dejaron sin tratar (UT) o tratado con 0,5 M Cetuximab (AEC) durante 72 h. La citotoxicidad se determinó usando el ensayo de citotoxicidad CytoTox-Glo (n = 3).
activación del EGFR no sólo estimula la proliferación celular sino que también puede proteger de la apoptosis inducida por TRAIL [24]. Por lo tanto, el próximo exploramos la eficacia de Db
αEGFR-scTRAIL en presencia de ligandos de EGFR. La inmunotransferencia de lisados de células estimuladas con TGF-α EGF- y reveló un grado similar de supresión de la fosforilación de EGFR inducida por ligando por cualquiera de Cetuximab o Db
αEGFR-scTRAIL pretratamiento (Fig. 3a, b), indicando la competencia eficaz de la fracción diacuerpo con los ligandos de EGFR. Esto también podría ser confirmada en las células cultivadas 3D Caco-2 estimuladas con EGF (Fig. S2). De acuerdo con ello, EGF y TGF-α no tuvieron ningún efecto protector sobre la viabilidad en 3D (Fig. 3c), ni eran estos ligandos capaces de interferir con la activación de la caspasa (Fig. 3D), lo que demuestra que Db
actividad αEGFR-scTRAIL no está limitada por la presencia de ligandos de EGFR. Para entender en más mecanismos de resistencia detalle hacia Db
αEGFR-scTRAIL, que volvió a aislar los quistes de las culturas 3D Matrigel sin tratar y Db
αEGFR-scTRAIL tratados con seguido de inmunotransferencia de lisados celulares (Fig. 3f, g). Curiosamente, los lisados derivados de quistes sobreviven (Fig. 3e, flechas) reveló que estos Db
células αEGFR-scTRAIL-insensibles contenían niveles especialmente bajos de EGFR. Es de destacar que los niveles de receptor de TRAIL en estas células eran similares a las de células no tratadas, lo que sugiere que la distribución de la expresión de EGFR en la población de células fuertemente impactos Db
sensibilidad αEGFR-scTRAIL (Fig. 3f, g). Por lo tanto, aunque el resto de diacuerpo no hace activamente contribuir a la apoptosis y principalmente tiene una función inhibidora del crecimiento en células Caco-2 3D culturas, la focalización EGFR-dirigida es importante aumentar la concentración de TRAIL local y desencadenar una respuesta apoptótica eficiente.
(a) células Caco-2 cultivadas en 2D se dejaron sin tratar o se trataron con 4 nM Db
αEGFR-scTRAIL o 4 nM Cetuximab para 15 min antes de la estimulación con EGF o TGF-α (10 ng /ml) durante 10 minutos. proteínas fosforiladas y el total se detectaron por inmunotransferencia. Se muestra es una mancha representativos de tres experimentos independientes. Tubulina se detectó como control de carga. (B) La cuantificación de las transferencias Western a partir de (a). los niveles de fosfo-EGFR se normalizaron a los correspondientes niveles de proteína total; Se establecieron niveles en el control sin tratar como 1 (n = 3). (discos compactos). Tres días después de la siembra, Caco-2 3D cultivos cultivados en ausencia o presencia de factores de crecimiento se trataron con 1 nM Db
αEGFR-scTRAIL. (C) La viabilidad se determinó por el ensayo MTT después de 72 h y se normalizó para el respectivo control sin tratar (UT). se midió (n = 3) (d) la actividad de la caspasa 3/7 después de 24 h. Los valores se normalizaron a los controles no tratados correspondientes (n = 3). (E) Tres días después de la siembra, Caco-2 3D cultivos se dejaron sin tratar o tratados con 5 nM Db
αEGFR-scTRAIL durante 72 h. Los quistes sobreviven en las imágenes de contraste de fase se indican con flechas (barra de escala: 50 micras). (F) Los lisados deriva de se analizaron por inmunotransferencia los cultivos 3D se muestran en (e). Se muestra es una mancha representativos de tres experimentos independientes. Tubulina se detectó como control de carga. bandas específicas están marcadas por puntas de flecha. (G) La cuantificación de las transferencias Western a partir de (f). Los niveles de proteína se normalizaron con el control correspondiente tubulina; niveles en los cultivos no tratados fueron establecidos como 1 (n = 3).
Aproximadamente el 40% de todos los tumores CRC alberga una mutación activa en el
KRAS
gen, lo que constitutiva de ERK /activación de MAPK y la pérdida de capacidad de respuesta a cetuximab [7], mientras que la sensibilidad TRAIL se pueden aumentar [25]. Para investigar la influencia de Ras oncogénico en Db
citotoxicidad inducida por αEGFR-scTRAIL, hemos generado células estables Caco-2 que expresa de manera inducible K-Ras
G12V. En estas células, la doxiciclina induce la expresión bi-cistrónico del oncogén y GFP, mientras que las células de control de vector sólo expresan GFP. Tres días después de la adición de doxiciclina, más de 85% de las células Caco-2tet fueron GFP positiva por análisis FACS (Fig. 4a). La inmunotransferencia de Caco-2tet K-Ras
lisados celulares G12V confirmó Ras sobreexpresión junto con la de GFP, concomitante con una fuerte fosforilación de ERK, mientras que las células de control de vector expresan únicamente GFP (Fig. 4b). Cuando estas células se sembraron en cultivos 3D en ausencia de doxiciclina, tanto vector Caco-2tet y células G12V K-Ras
formaron esferoides bien diferenciadas y polarizados con uniones basolateral adherentes (tinción de cadherina E) y apical F-actina acumulación alrededor de un lumen libre de células. La adición de doxiciclina no tuvo efecto sobre la morfología de las células de control, mientras que las células K-Ras
G12V expresar formados esferoides multi-luminales que carecían de distinta polarización (Fig. 4c). Estos defectos de diferenciación causadas por K-Ras
G12V están de acuerdo con un informe reciente de Magudia et al. (2012) [16].
(a) el control de vectores y células Caco-2tet células G12V K-Ras
fueron tratados con 2 mg de doxiciclina /ml durante 72 h (+ DOX). Se recogieron las células y la fluorescencia de GFP se analizó mediante citometría de flujo. Se utilizaron células no inducidos como control (-DOX). (B) el control de vectores Caco-2tet y células G12V K-Ras
se hicieron crecer en 2D y se trataron con doxiciclina durante los tiempos indicados antes de la lisis. GFP, Ras, pERK (T202 /Y204) y los niveles de ERK se determinaron mediante transferencia Western. Tubulina se detectó como control de carga. Todos los paneles que se muestran son de la misma transferencia. (C) el control de vectores Caco-2tet y células G12V K-Ras
se sembraron en cultivos 3D en la ausencia o presencia de doxiciclina. Tres días post-expansión lumen de siembra fue inducida por la adición de 100 ng CTX /ml. Los cultivos se fijaron tres días más tarde y se tiñeron con anticuerpos E-cadherina-específica (verde), faloidina (rojo) y DAPI (núcleos; azul). Se demuestran las secciones confocal de quistes representativos (barra de escala: 10 micras) guía empresas
Para determinar los efectos de K-Ras
G12V expresión de Db
citotoxicidad inducida αEGFR-scTRAIL, culturas 3D. fueron tratados con doxiciclina durante tres días. En comparación con las células de control, medidas de viabilidad reveladas disminución de la sensibilidad de Ras oncogénico que expresan las células para Db
αEGFR-scTRAIL (Fig. 5a).