Extracto
Antecedentes
Los genes específicos están metiladas con alta frecuencia en la neoplasia colorrectal, y pueden filtrarse en la sangre. La detección de múltiples biomarcadores de ADN metilado en la sangre puede mejorar la sensibilidad del ensayo para el cáncer colorrectal (CRC) en relación con un único marcador. Se realizó un estudio de casos y controles evaluar la presencia de dos marcadores de metilación de ADN,
BCAT1
y
IKZF1
, en circulación para determinar si eran complementarios para la detección de CCR.
Métodos
los ensayos de PCR específica de metilación fueron desarrollados para medir el nivel de metilado
BCAT1
y
IKZF1 Hoteles en ADN extraído de plasma obtenido de 144 controles sanos-colonoscopia y confirmado 74 casos de CCR
Resultados
rendimientos de ADN fue de 2 a 730 ng /ml de plasma. (media 18.6ng /ml; 95% CI 11-26 ng /ml) y no se correlacionó con el género, la edad o el estado de CRC. Metilado
BCAT1
y
IKZF1
ADN se detectaron en, respectivamente, 48 (65%) y 50 (68%) de los 74 tipos de cáncer. Por el contrario, sólo 5 (4%) y 7 (5%) fueron positivas para los controles
BCAT1
y
IKZF1
la metilación del ADN, respectivamente. Un modelo clasificador de dos genes ( "cualquiera o" regla) la mejora de la segregación de CRC de los controles, con 57 de 74 tipos de cáncer (77%) en comparación con sólo el 11 por 144 de los controles (7,6%) que sean positivas para
BCAT1
y /o
IKZF1
la metilación del ADN. Se han observado niveles crecientes de ADN metilado como etapa CRC progresó.
Conclusiones
La detección de metilado
BCAT1
y /o
ADN IKZF1
en el plasma puede tener aplicación clínica como un nuevo análisis de sangre para CRC. La combinación de los resultados de los dos ensayos de PCR específicas de metilación mejor detección CRC con un cambio mínimo en la especificidad. Además validación de este análisis de sangre de dos genes con vistas a la aplicación en el cribado ahora se indica
Visto:. Pedersen SK, Baker RT, McEvoy A, Murray DH, Thomas M, Molloy PL, et al. (2015) Un Análisis de sangre de dos genes de ADN metilado sensible para el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (4): e0125041. doi: 10.1371 /journal.pone.0125041
Editor Académico: Alejandro H. Corvalán, Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Medicina, CHILE
Recibido: 13 Noviembre 2014; Aceptado: March 8, 2015; Publicado: 30 de abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Pedersen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue cofinanciado por el Clinical Genómica Pty Ltd, y el Commonwealth Scientific y Industrial Research Organization (CSIRO). LCL, SKP, RTB, AM, DHM y MT son empleados por Clínica Genómica Pty Ltd. PLM, SM y TL son empleados por CSIRO. GPY es un consultor pagado de la Clínica Genómica Pty Ltd. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los siguientes autores declaran potencial intereses en competencia, en que fueron empleados por, o se reciben honorarios por consultoría de, Clinical Genomics Technologies Pty. Ltd .: LCL, SKP, RTB, AM, DHM, MT, y GPY. LCL, RTB, SKP, PLM, SM, TL son inventores en una o más solicitudes de patente de los biomarcadores de metilación de ADN descritas en este documento. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es un importante problema de salud pública y de detección es una herramienta importante en el cáncer Control en países con una significativa carga CRC. Sin embargo, las tasas de participación con el cribado basado en la colonoscopia invasiva o toma de muestras fecales son bajos [1]. Una encuesta reciente de los sujetos en edad de cribado es compatible con la probable aceptabilidad de un análisis de sangre para el CDN con el 78% de los participantes prefieren un análisis de sangre para un análisis de materia fecal [2].
Las recientes mejoras en las tecnologías moleculares han demostrado que ácidos nucleicos derivados del tumor en la sangre se pueden detectar de una manera robusta y reproducible [3]. En particular, no hay acumulación de literatura que documenta ADN circulante mutado y /o metilados específicos del tumor y el ARN [4-8].
Hemos descrito previamente el descubrimiento y validación de una gama de nuevos hypermethylated genes característicos de colorrectal tejido neoplásico [9]. ensayos específicos de metilación diseñados para detectar estos genes hipermetilados mostraron mínima de la señal en el ADN extraído de sangre agrupado de donantes sanos para un subconjunto de los marcadores [9]. Sobre la base de sus niveles relativos de fondo potencial elegimos dos genes, de cadena ramificada aminoácido transaminasa 1,
BCAT1
, y Ikaros de zinc dedo de la familia de proteínas 1,
IKZF1
[9,10] como candidatos principales para la evaluación como la base de un análisis de sangre para el CCR.
Se presenta la evaluación de dos ensayos de PCR específicos de metilación para la detección de metilado
BCAT1
y
IKZF1
ADN extraído de muestras de plasma de 218 individuos examinados-colonoscopia (144 controles sanos y 74 casos de CCR) para determinar si los biomarcadores de metilación eran complementarias para la detección de CCR.
Materiales y Métodos
casos y controles
se obtuvo sangre de voluntarios e informó a los sujetos programados para colonoscopia a Flinders Medical Centre (FMC) o el hospital general de repatriación (Adelaida, SA, Australia) que dieron su consentimiento por escrito en concordancia con el protocolo del estudio revisado y aprobado por el Comité de Investigación y Ética del Comité de Ética del hospital y Repatriación general de Flinders Medical Centre. La sangre se recogió mediante flebotomía después de la preparación del intestino, pero antes de la colonoscopia. El diagnóstico clínico se determinó sobre la base de los resultados de colonoscopia y evaluación histológica. Los cánceres se clasifican de acuerdo a AJCC Cancer Staging 7
ª edición. muestras adicionales de plasma de sujetos-colonoscopia examinados procedían de Proteogenex Inc. CA, EE.UU. (PGX) que se recogió sangre de voluntarios 3-10 días después de la colonoscopia de exploración. Las muestras fueron seleccionadas para el análisis a posteriori de diagnóstico basado en la colonoscopia. Los casos de cáncer (FMC: n = 25, PGX: n = 49) fue seleccionada en base a la disponibilidad de volumen, mientras que los controles (FMC: n = 85, PGX: n = 84) fueron seleccionados sobre la base de no aparición de hiperplasia y pólipos adenomatosos (pero lo que permite condiciones benignas tales como hemorroides y enfermedad diverticular), con un intento de match-edad de género los casos de CCR disponible para la prueba.
preparación de plasma
El componente de plasma de la sangre total extraída en K
tubos 3EDTA Vacuette (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) fue aislado por centrifugación a 1.500 g durante 10 minutos a 4 ° C (frenos de lesionados el centrífuga). La fracción de plasma de la capa superior se recuperó y se repitió la centrifugación. El plasma resultante 'de dos espín' se almacenó a -80 ° C hasta su uso posterior. El tiempo total de extracción de sangre para la congelación del plasma fue de no más de cuatro horas en todos los sitios de reclutamiento.
Controles de Proceso
mezclas de plasma de donantes de género y de la misma edad menor de 30 años de edad fue de origen en el comercio (Bioreclamation, Nueva York, EE.UU.) y se usan puras como control negativo o de pinchos con sonicated ADN genómico humano totalmente metilado (Millipore, MA, EE.UU.), 1250pg /ml, como un control positivo. Estos controles de proceso se hicieron como 2 lotes litros y posteriormente almacenan como alícuotas de 4 ml a -80 ° C hasta su uso posterior.
Diseño del estudio
Las muestras de plasma se procesaron al azar en grupos de 24 muestras incluyendo uno control de procesos positivos, uno negativo y el control del proceso 22 muestras clínicas (fenotipos cegado para ensayar los operadores).
El aislamiento y la conversión de bisulfito de ADN circulante libre de células
-Cell libre de ADN circulante (cfDNA) se extrajo a partir de plasma 4 ml usando el QIAamp circulante Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La extracción se semi-automatizado en dos manejadores de líquidos QIACube (12 muestras por instrumento por corrida) según lo recomendado por el fabricante (Qiagen). Volumen de elución se ajustó a 40μL y el eluato se manualmente volver a aplicar a la columna de sílice para mejorar el rendimiento cfDNA. El kit de conversión de bisulfito rápida EpiTect (Qiagen) se utilizó para convertir bisulfito aislado cfDNA. El bisulfito convertida se purificó el ADN en instrumentación QIACube utilizando el kit EpiTect Plus bisulfito (Qiagen) con dos modificaciones: 1) columnas del kit QIAamp ácido nucleico de circulación se utilizaron en lugar de columnas incluidas en el kit Epitect Plus bisulfito; 2) El tampón de unión Epitect Plus se preparó con isopropanol en lugar de etanol. Volumen de elución se ajustó a 40μL y el eluato se manualmente volver a aplicar a la columna de sílice para mejorar el rendimiento cfDNA. Un total de 36μL de bisulfito convierte cfDNA se recuperó de cada muestra de plasma de 4 ml. La recuperación exitosa de bisulfito convertida cfDNA se confirmó en la entrada duplicada de 5μL 1: 5 de bisulfito diluida convierte ADN utilizando un ensayo ACTB PCR como se describe anteriormente [11], con modificaciones menores (ver Tabla S1). Cada reacción de PCR incluyó tres muestras de control sin plantilla y una curva estándar basado en un 4 veces dilución en serie de 5 ng de ADN humano-bisulfito convertido aislado de las células blancas de la sangre (WBC; Roche Applied Science, Basilea, Suiza) preparado en un fondo de agua libre de nucleasa (Promega, WI, EE.UU.). los valores de la masa de bisulfito recuperado convertido cfDNA para cada muestra procesada se estimó a partir de la curva estándar utilizando regresión lineal se ajusta al umbral de ciclo (Ct) (véase la figura S1).
Detección de metilado
BCAT1
y
IKZF1
ADN
La apariencia del metilado
BCAT1
y
se midió ADN IKZF1
en circulación en la entrada triplicada de 5μL bisulfito de ADN purificado convertida (por ejemplo equivalente a 0,5 ml de plasma por PCR) utilizando ensayos específicos de metilación conversión- y bisulfito como [9] se ha descrito anteriormente, con modificaciones menores (ver Tabla S1). En pocas palabras, los dos ensayos de PCR en tiempo real dirigidas sitios CpG metilados en las regiones que abarca 102- 95- o nucleótidos, ya sea dentro o justo aguas arriba del primer exón del
BCAT1
y
IKZF1
genes, respectivamente (véase la figura S2). amplificación de la diana de ADN se realizó durante 50 ciclos en un LightCycler LC480, Modelo II (Roche). Los valores de Ct se calcularon mediante un
nd algoritmo derivado de 2 proporcionado con el software LC480. El
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ensayo de PCR (sonda de hidrólisis) y
IKZF1
ensayo de PCR (SYBR verde /derretir) fueron llamados cualitativamente "positivos" para los
BCAT1
metilación si un cambio total en la intensidad de fluorescencia por encima de los niveles de fondo se midió a 50 ciclos de amplificación por PCR. Además, para
IKZF1
llamados positivos, el componente de análisis de perfil de fusión de la
IKZF1
ensayo de PCR tuvieron que dar una temperatura de fusión superior a 80 ° C (ver Tabla S1). Los ensayos de PCR sin señal se les asignó un valor arbitrario de 50 Ct para las artes gráficas. Cada ejecución PCR incluyó tres muestras no-plantilla de control, el ADN WBC tres 5 ng bis-convertida (Roche) muestras de control negativo, y una curva estándar sobre la base de 4 veces la dilución en serie de 5 ng de ADN genómico humano completamente metilado-bisulfito convertido (Millipore) preparados en un fondo de ADN de WBC bisulfito convierte (Roche) (ver figura S2). Cada concentración estándar punto contenía un total de 5 ng de ADN. Los ensayos específicos de metilación fueron cuantitativa de 20 pg (0,4%) a 5 ng (100%) del ADN diana metilada en un fondo de ADN de WBC (R
2 valores cuadrados:
BCAT1
, 0.9370;
IKZF1
, 0,9387, S2 figura), pero capaz de detectar hasta 5 pg (equivalente a 1-2 copias genómicas) de metilado
BCAT1
y
IKZF1
ADN. La masa de metilado
BCAT1
y
ADN IZKF1 Opiniones de cada espécimen procesados se estimó a partir de la curva estándar utilizando regresión lineal se ajusta a los valores de Ct. La masa de metilado
BCAT1
o
IKZF1
ADN se expresó como la masa media (picogramos; pg) de metilado
BCAT1
o
ADN IKZF1
por ensayo de PCR o triplicado por ml de plasma (ver Tabla S2).
Muestra Resultado Interpretación
recuperación de ADN convertida bisulfito se confirmó si al menos una réplica fue positiva en el
ACTB
ensayo qPCR. El ADN restante convertida bisulfito se analizó a partir de entonces como entradas por triplicado de 5μL ya sea en el
BCAT1
o
IKZF1
ensayos de qPCR. Se recogieron los siguientes datos para cada muestra procesada: dos
ACTB
mediciones qPCR Ct, masa de ADN convertida bisulfito, tres
BCAT1
mediciones qPCR Ct, tres metilado
BCAT1
de masas mediciones, tres
IKZF1
qPCR Ct mediciones y tres metilado
IKZF1
mediciones (S2 Tabla). Todas las curvas de amplificación por PCR se inspeccionaron visualmente. Antes de desenmascarar los fenotipos de la muestra, una muestra se definió como cualitativamente clínicamente positivo para CRC presentación de informes si alguno de los triplicados en el
BCAT1
o
IKZF1
ensayos de PCR fueron positivos.
análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v5.0d para Mac OS X (GraphPad Software, San Diego, CA). Para gráficos de densidad de cantidades de metilado
BCAT1
o
ADN IKZF1
, se omitieron las muestras con resultados "sin señal". Cada uno de los ensayos por triplicado ADN contenido aislado del equivalente de 0,5 ml de plasma. La densidad empírica de ln (metilado
BCAT1
, pg) o ln (metilado
IKZF1
, pg
)
fue estimado por separado para los controles sanos, etapa temprana (etapa I + II) y la etapa tardía (etapa III + IV) cáncer. Suponiendo una distribución gaussiana para los valores de masa de metilación (PG), para dar la entropía máxima (el peor de los casos) con la media y la varianza observada, se estimaron de nuevo las densidades. El uso de estas densidades, se calculó la función de distribución acumulativa (F (x) = P (X≤x)) e informar 1-F (x) para ln (pg) metilado
BCAT1
y
IKZF1
valores de 3, 3.9 y 4.6. Nos informan también de la razón de verosimilitud respecto a los controles sanos.
Resultados
El aislamiento de células libres de ADN a partir de muestras de plasma
Diez lotes individuales se llevaron a cabo para procesar las muestras de plasma 218 . Controles de Proceso confirmaron ninguna variación de confusión en el procesamiento por lotes (datos no mostrados). El
ACTB
ensayo qPCR confirmó la recuperación exitosa de bisulfito convierte el ADN de los 218 especímenes de plasma procesados (ver Figura S3 y el cuadro S2) y las concentraciones medias de ADN en relación con el fenotipo y las condiciones clínicas de la colección se resumen en la Tabla 1. La mayoría de los rendimientos de ADN recuperados se encontraban dentro de un intervalo de concentración de dos veces (95% gama de CI: 11.2-26.2ng /ml). Significativamente más bajos rendimientos de ADN convertida bisulfito fueron recuperados de muestras recogidas por FMC en comparación con los rendimientos medios recuperados de especímenes recogidos por PGX (mediana de las concentraciones: FMC: 7,0 ng ml, PGX /: 17.8ng /mL, value & lt t-test, p; 0,0001, véase la figura S3). diferencias de protocolos entre los sitios han sido descritas como causantes de la variación más fuerte en las concentraciones circulantes de ADN medidos [12]. Hemos supervisado cuidadosamente los procedimientos de recopilación y procesamiento para asegurar protocolos comunes. La única variación sistemática que podría explicar estos rendimientos de ADN contrastantes era los diferentes puntos de tiempo en el que se recogió la sangre con respecto a la colonoscopia. No hubo correlación entre la cantidad de ADN recuperado a partir de plasma y el fenotipo clínico (ver Fig S3) en contraste con estudios que incluyeron una mayor proporción de cánceres en etapa finales de [13,14]. Por otra parte, no se observó correlación entre el rendimiento de ADN, la edad o el sexo del paciente (datos no mostrados).
Detección de hacer circular metilado
BCAT1
y
IKZF1
ADN
los niveles de metilación
BCAT1
y
ADN IKZF1 Hoteles en bisulfito convierte ADN recuperado de las muestras de plasma 218 se midieron mediante análisis por triplicado de un volumen equivalente de plasma plasma de 0,5 ml por cada PCR también. Sesenta y ocho de las 218 muestras de plasma fueron positivos para ambos
BCAT1
y /o
IKZF1
metilación (Tabla 1 y Tabla S2). No se observó correlación entre las tasas de positividad de ensayo y rendimiento de bisulfito recuperado convertido cfDNA, la edad del paciente (figura 1) o el sexo (véase la figura S4). Estadísticamente tasas significativas de positividad más altas se midieron en los casos de CCR en comparación con los controles tanto para los ensayos de metilación (Fig 2, los valores de P & lt; 0,0001). El
BCAT1
ensayo de metilación fue positiva en 53 de las 218 muestras analizadas de las que 48 (65%) de cáncer y 5 (4%) controles. El
IKZF1
ensayo tuvo una tasa de positividad ligeramente más alta con 57 muestras positivas entre ellos 50 (68%) casos de CCR y 7 (5%) controles. El aumento de las tasas de positividad se observaron con el CRC etapa para ambos marcadores, como se muestra en la Tabla 1. Los lugares lesión fuese conocido por 70 de los 74 casos de cáncer (S2 Tabla). No hubo diferencia en las tasas de positividad medidos en proximal frente a cánceres distales (proximal, n = 21, 16 positivos (76%); distal, n = 49, 38 positivos (78%), el valor p de la prueba t: 0,9029).
gráficos de correlación de señales promedio Ct medidos en los
BCAT1 gratis (triángulos negros) y
IKZF1 gratis (triángulos blancos) en comparación con los ensayos de metilación (a) la masa de bisulfito de ADN recuperado convertido plasma por ml o edad (B) de los sujetos en el momento de extracción de sangre. Ensayo replica con "ninguna señal" se les asignó el valor Ct arbitrario de '50' para los propósitos depiction.
BCAT1 gratis (panel superior, triángulos negros) y
IKZF1
(panel inferior, triángulos blancos) se utilizaron ensayos específicos de metilación para evaluar la aparición de circulante metilado
BCAT1
y
ADN IKZF1 Hoteles en 218 muestras de plasma que incluye 144 controles sanos y 74 tipos de cáncer. Mann-Whitney pruebas t se realizaron en las tasas de positividad calculados para cada clase fenotípica para derivar los valores de P. Los intervalos de confianza del 95% (IC 95%) se indican.
complementariedad metilación biomarcador
Sesenta y ocho especímenes fueron positivos en al menos uno de los dos ensayos de metilación, de los cuales Sólo 42 fueron positivos para ambos marcadores de metilación (41 casos de CCR y 1 de control). La figura 3A muestra que un resultado cualitativo combinada basada en al menos una réplica positiva, ya sea en el
BCAT1
o
IKZF1
ensayo de metilación produce la más alta precisión de la clasificación (CI 0,8469, 95%: 0,7848 a 0,9091 ) en comparación con cualquiera de los marcadores solo (
BCAT1
; 0,8070, 0,7368 a 0,8771 IC del 95%,
IKZF1
; 0,8135, IC del 95%: 0,7448 a 0,8822). El modelo clasificador 2-gen ( "bien o" regla) tuvo una sensibilidad estimada para el CCR del 77% (IC del 95%: 65,8-86,0), con una especificidad del 92,4% (IC del 95%: 86,7-96,4; la figura 3), mejorando así la tasa de detección de cáncer en más de un 10%, con menos de una disminución del 4% en la especificidad. La positividad ensayo de dos etapas para la combinación de genes CRC I-IV fue del 50%, 68%, 87% y 100% respectivamente (Tabla 1).
Los valores de precisión de sensibilidad, especificidad y discriminación para el
BCAT1
,
IKZF1
y de dos ensayos de genes combinados se calcularon utilizando las verdaderas y falsas las tasas de positividad medidos en 144 casos de cáncer de 74 controles sanos y (a) y, posteriormente, representados en el espacio de característica del receptor operador (ROC) parcelas (B). Los ensayos de un solo gen: Una muestra de plasma se llaman cualitativamente "positivo" si al menos una PCR replicar dio lugar a una señal Ct. ensayo de dos genes: Un espécimen fue llamado cualitativamente "positivo" si al menos uno de duplicados, ya sea en el
BCAT1
o
IKZF1
ensayos produjeron un valor de Ct
Niveles de metilado
BCAT1
o
ADN IKZF1
frente gravedad de la enfermedad
se observó una buena correlación en el ciclo de umbral de los valores (Ct) medidos en las muestras positivas para ambos
BCAT1
y
IKZF1
la metilación del ADN (co-eficiencia de correlación R
2 = 0.9053, figura 4A). Cada uno de los ensayos por triplicado ADN contenido aislado del equivalente de 0,5 ml de plasma. Las masas medias de metilado
BCAT1
o
ADN IKZF1
medido en el CCR estadios II, III y IV fueron significativamente mayores en comparación con la masa media de metilación medido por el número limitado de controles que fueron positivos (Fig 4B y 4C). La relación entre los niveles medidos de circulante metilado
BCAT1
o
ADN IKZF1
en la etapa de plasma y el cáncer fue modelado para estimar la probabilidad de cáncer, dado un metilado
BCAT1
o
IKZF1
masa estimada de ADN por ensayo por triplicado. gráficos de densidad fueron estimados (figura 5A y 5B, líneas discontinuas) utilizando sólo las masas de metilación positivos para el plasma de fenotipos conocidos clasificados como controles sanos, cáncer en etapa temprana (etapa I + II) y el cáncer en estadio tardío (estadio III + IV). Los gráficos de densidad modelados, asumiendo los niveles de metilación observados fueron extraídos de una distribución normal (Figura 5A y 5B, líneas continuas), donde utiliza para estimar las probabilidades acumuladas (figura 5C) que una muestra de plasma a partir de una clasificación conocida produciría un cáncer- observada derivado nivel de metilación de ADN igual a o mayor que la correspondiente a 20-, 50- o 100 pg. Se determinó que menos del 8% de las muestras de plasma de control positivo se encontró que contenía al menos 20 pg de metilado
BCAT1
o
IKZF1
ADN, mientras que 63-77% de los cánceres en fase inicial tenía 20 pg o más. Por lo tanto la probabilidad de una muestra de plasma con ≥ 20 pg metilado
BCAT1
o
ADN IKZF1
sea un cáncer en etapa temprana es de aproximadamente 9: 1 y 210: 1, respectivamente (etapa temprana de CRC: controlar). Además, una muestra de plasma con 100 pg de metilado
es aproximadamente 2,5 veces más probabilidades de ser extraída de un sujeto con CRC etapa tardía IKZF1
ADN (fase III o IV) que un sujeto con etapa temprana de CRC (Etapa I o II).
(A) gráfica de correlación de los valores medios Ct (log (Ct)) medida por el
BCAT1
o
IKZF1
ensayos de 144 controles sanos (negro círculos) y 74 de CRC (círculos blancos). PCR se replica sin señal se les asignó un valor arbitrario de 50 Ct para los propósitos depiction. cuadrantes cuadrados (a) a (d) representan: (a) 15
BCAT1
negativa, pero
IKZF1
casos positivos; (B) 42
BCAT1
y
IKZF1
casos positivos, incluyendo el cáncer y 41 de control 1; (C) 11
BCAT1
positivo, pero
IKZF1
casos negativos; (D) 150
BCAT1 Opiniones y
IKZF1
casos negativos. Un análisis de regresión lineal se realizó en 38 de los 41
BCAT1
y
IKZF1
CRC casos positivos (cuadrante B), omitiendo tres valores atípicos CRC. líneas diagonales discontinuas indican el rango IC del 95%. Se muestra el valor R cuadrado calculado. La masa (ng) de metilado
BCAT1 gratis (B) y
IKZF1 gratis (C) de ADN se calculó y se representa como masa de metilación por ml de plasma procedentes de 144 casos de control, 4 Etapa I, 28 Etapa II, 23 en estadio III, IV Etapa 8 (los 8 casos de CCR con puesta en escena desconocida omitidas). Los niveles promedio y la mediana de la masa en las cinco clases fenotípicas A continuación se indican los gráficos. Mann-Whitney test t realiza sobre valores de la mediana, ***: valor de p & lt; 0,05, ns:. No significativa, en comparación con los 144 casos de control sanos
La masa promedio estimado de (A)
BCAT1
y (B)
IKZF1
ADN en cada uno de los ensayos por triplicado que contienen ADN aislado a partir del equivalente de 0,5 ml de plasma de los controles sanos (líneas negras,
BCAT1
: n = 5,
IKZF1
: n = 2 * ), cáncer de etapa temprana (líneas azules, etapa I + II,
BCAT1
: n = 19,
IKZF1
: n = 17) y el cáncer de etapa tardía (líneas rojas, etapa III + IV ,
BCAT1
: n = 22,
IKZF1
: n = 26) fueron utilizados para calcular los gráficos de densidad de probabilidad empírica, omitiendo los resultados de "no hay señal" (líneas discontinuas). Las líneas continuas: medias de población (μ) y desviación estándar (σ) se calcularon suponiendo una distribución normal para cada una de las tres clasificaciones fenotípicas. * Cinco de los siete
IKZF1
casos de control tenían señales positivas Ct dentro de los últimos 5 ciclos de PCR, por lo tanto, no hay estimación de la masa. (C) probabilidad acumulada de una muestra de plasma con
BCAT1
o
IKZF1
los niveles de metilación de ADN igual a o mayor que 20-, 50- o 100 pg de ADN metilado procedente de un paciente con el fenotipo indicado clasificación; los umbrales de masas se determinaron como el área bajo la curva (líneas continuas en los paneles A y B) para ln (PG) valores superiores a 3, 3,9 y 4,6, respectivamente (ver las líneas verticales de puntos y flechas) en los paneles A y B. Probabilidad relaciones relativas a los controles sanos se muestran entre paréntesis.
Discusión
Hemos informado anteriormente el desarrollo de dos ensayos de conversión y de PCR específica de metilación bisulfito se utiliza para detectar la metilación específica neoplásica colorrectal en el gen loci
BCAT1
y
IKZF1
[9]. Hemos optimizado el
BCAT1
y
IKZF1
ensayos de metilación qPCR para la detección de metilación proporciones tan bajas como 0,1%, como tales niveles bajos de ADN obtenido de tumores han sido reportados en las muestras de plasma de pacientes con CRC etapa temprana [4,15]. En este estudio de casos y controles se demuestra que metilado
BCAT1
y
IKZF1
ADN se detecta con mayor frecuencia en los casos de CCR (65% y 68%, respectivamente) que en los controles sanos confirmado la colonoscopia ( 4% y 5%, respectivamente) y que los dos marcadores de ADN metilación son complementarios (de forma combinada el 77% y el 7,6% en el CRC y controles sanos, respectivamente).
Un total de 41/74 casos de cáncer eran positiva tanto para metilado
BCAT1
y
ADN IKZF1
en comparación con sólo 1/144 de control). La combinación de los resultados de los dos ensayos dio lugar a una exactitud de 0,8469 discriminatorio que era mejor que sea solo ensayo (
BCAT1 ensayo
: 0,807,
IKZF1
ensayo: 0,8135), Fig 3. Considerando una uno u otro ensayo de dos genes, se detectaron más casos de CCR, con una correcta segregación de 57/74 (77%) y sólo 11/144 (7,6%) controles sanos clasificados erróneamente. Estos datos de dos genes proporcionan pruebas concluyentes, simple que múltiples biomarcadores pueden mejorar la sensibilidad sin mayor compromiso de la utilidad de diagnóstico en términos de especificidad más baja
.
La detección de metilado
BCAT1
y
IKZF1
ADN en la sangre no dependía de la edad o el sexo del sujeto, o la cantidad de bisulfito recuperado convertido cfDNA. Una relación significativa sólo se observó con el fenotipo clínico. Tanto la frecuencia de detección y la cantidad de metilado
BCAT1
y /o
IKZF1
ADN liberado en un aumento de la etapa del cáncer de sangre. Este último fue estadísticamente significativa en la fase II, III y IV de cáncer, con una masa de metilación superior observada en comparación con el nivel medido en los pocos sujetos de control sanos positivos (Fig 4). Observaciones similares también se han observado para el bien estudiado
SEPT9
ensayo de metilación [16,17]. Por el ajuste de modelos de clasificación de cáncer (controles, temprano o cáncer de tarde), se muestra el potencial de usar el nivel de metilado
BCAT1
y /o
ADN IKZF1 Hoteles en sangre para estimar la probabilidad de ser debido a la presencia de cáncer de un resultado positivo (Fig 5). En conjunto, los datos apoyan un modelo simple, donde la capacidad de detectar marcadores de ADN derivadas de tejido en el sistema circulatorio es una función de la extensión de la invasión por la lesión [18].
BCAT1
y
¿Cuáles son IKZF1 tanto implicado en el crecimiento del tumor y la invasión [19,20]. Un hypermethylated
BCAT1
locus ha sido demostrado por varias patologías incluyendo CRC [21,22] y la regulación epigenética aberrante provoca un cambio en la relación de los tres principales
BCAT1
transcritos de ARNm que difieren sólo en el primer exón, que alberga las regiones no traducidas alternativos [20]. ¿Cómo las isoformas BCAT1 afectan a la proliferación celular es desconocida, pero se especula que la producción disfuncional de los aminoácidos de cadena ramificada puede afectar a la síntesis de macromoléculas necesarias para la división celular, tal vez en el punto de control del ciclo celular G1 a S [23].
El factor de transcripción,
IKZF1
, regula numerosos eventos biológicos y su papel en linfopoiesis y leucémica neoplasia se ha estudiado ampliamente. Una red de epigenéticos y factores de transcripción regulan
IKZF1
actividad de los genes [24] y emergentes datos implican que
IKZF1
también es crucial para una adecuada regulación de la proliferación y diferenciación de las células de origen no hematopoyético, incluyendo de colon [25]. Con el complejo NuRD como el principal socio de la interacción [26], Ikaros controla la actividad transcripcional de un pequeño grupo de genes [23,27], incluyendo
Notch1
[28]. La vía de señalización Notch es crítica para muchas interacciones de célula a célula, incluyendo la formación de invadopodios [29].
SEPT9
es un regulador negativo de la formación de pseudópodos [30], que es un evento clave que inicia la difusión celular y de la propulsión en un entorno de tejido y el estroma (recientemente revisado por [31]). Por lo tanto, la pérdida de
SEPT9
expresión puede desempeñar un papel activo en la invasión tumoral, donde las células tumorales metastásicas a través de mecanismos poco conocidos migran al sistema vascular [32]. Especulamos si
IKZF1
es tal vez un regulador de aguas arriba de la actividad
SEPT9
.
La vía de Notch desempeña un papel crucial en el proceso de auto-renovación de las células madre de las criptas del colon y su producción de la proliferación de progenitores de células no diferenciadas y de tránsito de amplificación, que se mueven hasta la cripta y en la vellosidad en el que además, se diferencian [33,34]. Especulamos si la pérdida de
IKZF1
actividad debido a la hipermetilación, conduce a la señalización de Notch constitutivamente activa que inhibe la diferenciación de las células progenitoras de las criptas y los resultados en un gran aumento de las células de amplificación transitorias indiferenciada tal como se describe anteriormente [35 a 37].
El aumento de la positividad observado en los cánceres de etapa I-IV implica que la detección de marcadores de ADN metilado derivados del tumor en la sangre puede depender en gran parte de la vascularidad del tejido neoplásico colorrectal y aumento de la invasión en general [18,38]. Si esto es cierto, entonces una sensibilidad estandarizado para la detección de marcadores derivados del tumor en circulación se verá afectada por la fracción de los cánceres en etapa I, ya que la mayoría de los cánceres en estadio I probablemente no tendrán ningún linfática o venosa buque de la invasión [18]. Como tal, los ensayos basados en la sangre son poco probable para detectar una fracción significativa de los cánceres en etapa temprana que pueden ser detectados por colonoscopia. Esto podría explicar la baja sensibilidad observada en una evaluación prospectiva reciente de
Hoteles en SEPT9 & gt; 7.900 participantes asintomáticos donde se detectaron sólo el 48% de los 53 casos de CCR (incluyendo veintidós cánceres en estadio I) y el 11% de los adenomas [17]. Nuestro propio conjunto de datos sólo incluyó cuatro tipos de cáncer en estadio I, y si bien se detectaron dos (50%) de éstos, los números de las muestras son actualmente demasiado bajo para concluir si el
BCAT1
IKZF1
prueba /metilado dará una buena detección de los cánceres en estadio I. La inclusión de las variables relacionadas con la vasculatura-(invasión vascular, la capacidad de supervivencia vascular y la angiogénesis tumoral) parece mejorar la estratificación de los pacientes con cáncer [39]. Por desgracia, no pudimos evaluar si detectabilidad de metilado
BCAT1
y
ADN IKZF1 Hoteles en sangre se asoció con la aparición de las características relacionadas con la vasculatura, ya que estas variables no fueron registrados en los informes histológicos para el cánceres incluidos en el conjunto de datos en el presente documento.
Conclusión
Se presenta aquí por primera vez un análisis de sangre, donde la combinación de la detección de dos biomarcadores de ADN metilación mejora la sensibilidad de CRC sin una pérdida sustancial de la especificidad. La sensibilidad para el cáncer fue similar a los estudios de casos y controles retrospectivos publicados para el
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metilación de ensayo, aunque se presenta un mayor especificidad [8,11,16,40].