Extracto
Uso de ensayo de selección basado en células, hemos identificado un agente anti-tubulina novela (Z) -5- ((5- (4-bromo-3-clorofenil) furan-2-il) metilen) -2-tioxotiazolidín-4-ona (BCFMT) que inhibió la proliferación de carcinoma cervical humano (HeLa) (IC
50, 7.2 ± 1,8 M), adenocarcinoma de mama humano (MCF-7) (IC
50, 10,0 ± 0,5 M), adenocarcinoma de mama altamente metastásico (MDA-MB-231) (IC
50, 6,0 ± 1 M), cisplatino-resistentes carcinoma de ovario humano (A2780-cis) (IC
50, 5,8 ± 0,3 M) y el tumor a múltiples fármacos ratón resistente mamaria (EMT6 /AR1) (IC
50, 6.5 ± 1 micra) las células. El uso de varias estrategias de cortesía, se encontró BCFMT para inhibir la proliferación de células cancerosas en la fase G2 /M del ciclo celular, aparentemente por la orientación microtúbulos. Además, BCFMT suprime fuertemente la dinámica de los microtúbulos en células vivas individuales MCF-7. En su medio proliferación máxima concentración inhibitoria (10 mM), BCFMT redujo las tasas de crecimiento y acortamiento de las fases de los microtúbulos en las células MCF-7 células por 37 y 40%, respectivamente. Además, se aumentó los microtúbulos tiempo de permanencia en la pausa (creciendo ni acortar de forma detectable) Estado en un 135% y redujo el dinamismo (intercambio de dímero por unidad de tiempo) de los microtúbulos en un 70%.
In vitro
, BCFMT unido a la tubulina con una constante de disociación de 8,3 ± 1,8 M, inhibida ensamblaje de la tubulina y suprimió la actividad GTPasa de los microtúbulos. BCFMT inhibe competitivamente la unión de BODIPY FL-vinblastina a la tubulina con una concentración inhibidora (K
i) de 5,2 ± 1,5 mM lo que sugiere que se une a la tubulina en el sitio de la vinblastina. En células cultivadas, BCFMT tratos despolimeriza los microtúbulos en interfase, perturba la organización del huso y control de las proteínas acumuladas (BubR1 y Mad2) a los cinetocoros. MCF-7 células BCFMT tratados mostraron una mayor acumulación nuclear de p53 y su p21 aguas abajo, que por lo tanto activa la apoptosis en estas células. Los resultados sugieren que BCFMT inhibe la proliferación de varios tipos de células cancerosas, incluyendo las células de resistencia a fármacos mediante la supresión dinámica de los microtúbulos y se indica que el compuesto puede tener un potencial quimioterapéutico
Visto:. Un Rai, Surolia A, D Panda (2012) un agente antitubulina BCFMT inhibe la proliferación de células cancerosas e induce la muerte celular por inhibición de los microtúbulos dinámica. PLoS ONE 7 (8): e44311. doi: 10.1371 /journal.pone.0044311
Editor: Miklos S. Kellermayer, Universidad de Semmelweis, Hungría
Recibido: Abril 27, 2012; Aceptado: August 1, 2012; Publicado: August el 31 de, 2012
Copyright: © Rai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. D. P. con el apoyo de una beca de DAE-SRC, Departamento de Energía Atómica. COMO. con el apoyo de una beca J. C. Bose, Gobierno de la India. ARKANSAS. es un CSIR (Consejo de Investigación Científica & amp; Industrial Research) compañero. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Co-autor Avadhesha Surolia es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El desarrollo de resistencia a los medicamentos contra el cáncer y la metástasis de tumores existentes son algunos de los principales obstáculos en la quimioterapia del cáncer [1], [2]. ensayos de citotoxicidad basados en células se han encontrado para ser un método de cribado atractivo para descubrir agentes contra el cáncer. Varios de los agentes contra el cáncer clínicamente eficaces se identificaron primero a través de selección de alto rendimiento [3] - [6]. Por ejemplo, el taxol se descubrió primero a través de un ensayo de selección basado en células de alto rendimiento [6].
Los microtúbulos son componentes estructurales del huso mitótico y los microtúbulos dinámicos juegan un papel importante en varios procesos celulares incluyendo el tráfico intracelular, celular la migración y la división celular [7]. Varios de los inhibidores de la mitosis se sabe que inhiben ensamblaje de los microtúbulos [8] - [12] y la inhibición de la dinámica de ensamblaje de los microtúbulos se ha demostrado que el modo de acción para varios fármacos anticancerosos clínicamente éxito, incluyendo vinblastina, vincristina, estramustina y paclitaxel [11 ], [12]. Además de sus aplicaciones clínicas en diversos tipos de enfermedades que incluyen cáncer, enfermedades fúngicas y parasitarias [13], inhibidores de microtúbulos también son muy útiles para la comprensión de la función de los microtúbulos en los procesos celulares [14], [15]. inhibidores de microtúbulos en general, bloquean la progresión del ciclo celular en la mitosis y una mitótico detención prolongada desencadena diversas vías de apoptosis [12], [16], [17].
compuestos Rodanina derivados están adquiriendo atención en la quimioterapia debido a la presencia de anillo heterocíclico (2-tioxotiazolidín-4-ona) en los andamios de padres [18]. Sustituciones en el anillo heterocíclico proporcionan una excelente oportunidad para formular nuevos derivados con amplia gama de actividades biológicas [18]. Las actividades biológicas de los compuestos rodanina derivados han sido examinados en varios estudios [18] y estos agentes exhibido antibacteriana [19], [20], antimaláricos [21], antiviral [22] y el cáncer potencial [23]. En el presente trabajo, se intentó encontrar una nueva entidad química que tienen actividades antiproliferativas y antimicóticos de un gran subconjunto (una biblioteca de 156 compuestos) de los andamios derivados rodanina con una idea que el compuesto puede tener potencial contra el cáncer.
Se encontró que tres compuestos a saber, (E) -5 - ((5- (2-metil-5-nitrofenil) furano-2-il) metilen) -2-tioxotiazolidín-4-ona (MNFMT), (E) -5 - (3,5-dicloro-4-hidroxibenciliden) -3-fenil-2-tioxotiazolidín-4-ona (DHBPT) y (Z) -5 - ((5- (4-bromo-3-clorofenil) furan-2 il) metilen) -2-tioxotiazolidín-4-ona (BCFMT) inhibió la proliferación de las células HeLa y MCF-7 en cultivo. Entre estos compuestos, se encontró BCFMT para aumentar la población de células mitótica de células HeLa y MCF-7 más potente que los otros dos compuestos. BCFMT inhibe el ensamblaje de la tubulina purificada
in vitro
y en células cultivadas, mientras que MNFMT y DHBPT no mostraron ningún efecto significativo en el conjunto de la tubulina. Se obtuvieron varias líneas de evidencia que sugiere que BCFMT ejerce sus actividades antiproliferativos y antimitóticos al reducir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos individuales en células cultivadas mediante la unión en el sitio de vinblastina en la tubulina. Además, BCFMT potentemente inhibida la proliferación de las drogas a saber cisplatino resistente carcinoma de ovario A2780-cis humano y de tumor mamario de ratón resistente a múltiples fármacos células resistentes EMT6 /AR1 y-231 MDA-MB células altamente metastásicas que sugiere que puede tener potencial quimioterapéutico.
Materiales y Métodos
Materiales
sulforodamina B, albúmina de suero bovino, ratón anti-α-tubulina IgG, ratón anti-β-actina IgG, conjugado con FITC anti-IgG de conejo se obtuvieron de Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.. Alexa Fluor 568 de cabra anti-IgG de ratón se adquirió de Molecular Probes, Invitrogen, CA, EE.UU.. Mouse anti-ciclina B1, de conejo anti-p-Histona H3 (Ser 10), IgG de ratón anti-p53, anticuerpos de IgG anti-p21 de ratón y kit de detección de apoptosis (anexina V-yoduro de propidio) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, CA, ESTADOS UNIDOS. Mouse anti-BubR1 IgG se obtuvo de BD Biosciences, CA, EE.UU.. Conejo anti-IgG Mad2 fue adquirido de los laboratorios Bethyl, Montgomery, EE.UU.. Mouse anti-IgG Hec1 fue adquirido de Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.. El suero bovino fetal se obtuvo de BioWest, Nuaille, Francia. Todos los demás reactivos fueron de grado analítico y obtenidas de Sigma, MO, EE.UU. y Himedia, Mumbai, India. Todos los compuestos ensayados se obtuvieron de Chembridge Corporation, San Diego, CA, EE.UU..
Cell Cultura
carcinoma cervical humano (HeLa), adenocarcinoma de mama humano (MCF-7) y adenocarcinoma de mama metastásico ( se obtuvieron células MDA-MB-231) desde el repositorio de células del Centro Nacional para la Ciencia de la célula, (NCCS) Pune, India. NCCS caracteriza por la secuencia de las células MT-rDNA para confirmar la especie. Se encontró que estas líneas celulares para estar libre de micoplasma. (A2780-cis) las células resistentes al cisplatino de carcinoma de ovario humano y de tumor mamario de ratón resistente a múltiples fármacos células (EMT6 /AR1) se adquirieron de Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.. autentificación línea celular hecho por repeticiones cortas en tándem de perfiles y análisis de isoenzimas por el proveedor y también se informó negativo para la presencia de micoplasma.
células
HeLa y MCF-7 se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (MEM). MDA-MB-231 células se cultivaron en de Leibovitz L-15 Medium. células A2780-cis se mantuvieron en medio RPMI-1640 que contienen 1 cisplatino M. células EMT6 /AR1 se cultivaron en medio MEM que contiene 1 mg /ml de doxorrubicina. Los medios se suplementaron con 10% de suero bovino fetal, 2,2 g /l de bicarbonato de sodio y solución de 1% de antibiótico-antimicótico que contiene estreptomicina, anfotericina B y la penicilina. Las células se cultivaron y se mantuvieron a 37 ° C incubadora en atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire.
Detección de actividad antiproliferativa de Rodanina serie de compuestos
El potencial antiproliferativo de 156 compuestos rodanina derivado contra las células HeLa se determinó por el ensayo de sulforrodamina B [24], [25]. células HeLa (1 × 10
5 células /ml) se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Las acciones de los compuestos se prepararon en DMSO. Después de 24 h de la siembra, el medio se reemplazó con medio fresco que contenía o bien vehículo (0,1% DMSO) o 2 mM de cada uno de los compuestos rodanina. Después de 24 h de incubación con diferentes compuestos, las células se fijaron con 10% TCA y se procesan para el ensayo de sulforrodamina B [24], [25].
Para determinar la concentración inhibitoria media máxima (IC
50) de MNFMT, DHBPT y BCFMT, 1 × 10
5 células /ml HeLa y células MCF-7 se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Diferentes concentraciones de los compuestos se diluyeron en medios de comunicación y se añaden en los pocillos después de 24 h de la siembra de células. células HeLa y MCF-7 se cultivaron en ausencia y presencia de compuestos durante 24 h y 48 h, respectivamente. La inhibición de la proliferación celular en presencia de los compuestos se determinó usando el ensayo de sulforrodamina B estándar. Los datos fueron un promedio de tres experimentos independientes.
Dispersión de Luz Experimento
Los efectos de MNFMT, DHBPT o BCFMT en el ensamblaje de la tubulina purificada se controlaron mediante dispersión de la luz a 400 nm. Tubulina se purificó como se ha descrito anteriormente [26], [27]. Tubulina (10 mM) en tampón PEM (25 mM TUBOS pH 6,8, MgCl 3 mM
2, EGTA 1 mM) y 1 M de glutamato se incubó sin y con diferentes concentraciones de MNFMT, DHBPT o BCFMT en hielo durante 10 min. A continuación, 1 mM de GTP se añadió a las mezclas de reacción y la cinética de montaje se controló a 37 ° C utilizando un espectrofluorímetro FP-6500 JASCO, Tokio, Japón.
Microscopía Electrónica de
tubulina (10 M) se polimerizó sin o con BCFMT 25 y 50 micras, con 37 ° C durante 15 min como se describió anteriormente. Las muestras se fijaron con glutaraldehído al 0,5%, se transfirieron a rejillas recubiertas de carbono-formvar (Electron Microscopy Sciences, USA) y se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 2%. Las muestras se visualizaron bajo microscopio electrónico (Tecnai G
212, FEI, Eindhoven, Países Bajos).
Efectos de BCFMT sobre la actividad GTPasa de microtúbulos in vitro
tubulina (25 mM) en 4 M de glicerol, mM MgCl 5
2 y 1 mM GTP se polimerizó a 37 ° C durante 30 min. semillas de microtúbulos fueron generados por cizallamiento de los polímeros a través de una aguja de calibre 23 de una jeringa de 5 ml. Tubulina (15 mM) en tampón PEM y 1 mM GTP se polimerizó mediante la adición de 20% (v /v) Semillas de microtúbulos a 37 ° C durante 10 min. Después de 10 min de polimerización, se añadieron diferentes concentraciones de BCFMT en las mezclas de reacción y más polimerizado para 30 min. La reacción de hidrólisis se detuvo añadiendo 10% (v /v) de ácido perclórico al 7 M y la cantidad de fosfato inorgánico liberado se determinó mediante un ensayo de verde de malaquita [28].
Medición de la constante de disociación de la unión de BCFMT a la tubulina El uso de triptófano fluorescencia de la tubulina
tubulina (2 M) en las tuberías de 25 mM de tampón de pH 6,8 se incubó sin y con diferentes concentraciones de BCFMT a 25 ° C durante 20 min. La intensidad de fluorescencia se monitorizó mediante excitación de la mezcla de reacción a 295 nm y el espectro de emisión se registró en el intervalo de 310 nm a 370 nm. Se utilizó una celda de fluorescencia de 0,3 cm longitud de la trayectoria y las intensidades de fluorescencia se corrigieron para efecto de filtro interno utilizando la fórmula
Los datos de fluorescencia se ajustaron de la siguiente ecuación; Donde, Delta F es el cambio en la intensidad de fluorescencia de la tubulina en presencia de BCFMT, Delta F
max es el cambio máximo en la intensidad de fluorescencia de la tubulina cuando está saturado con BCFMT y C es la concentración de BCFMT. La constante de disociación (K
d) para la unión a tubulina BCFMT se estimó utilizando el software Graph Pad Prism 5 (GraphPad Software, CA, EE.UU.).
Efecto de BCFMT en BODIPY FL-vinblastina La unión a tubulina
tubulina (2 M) en las tuberías 25 mM pH 6,8 se incubó sin y con 10, 25 y 50 BCFMT M durante 20 minutos a 25 ° C. Se añadió BODIPY FL-vinblastina (2 M) en las mezclas de reacción y se incubó a 25 ° C durante 20 min adicionales en la oscuridad. Tubulina-BODIPY FL-vinblastina complejo se excitó a 490 nm y el espectro de emisión fue tomada en el rango de 500-550 nm [29]. El espectro de BODIPY FL-vinblastina en ausencia de tubulina también se controló.
microscopía de inmunofluorescencia
células MCF-7 o HeLa se sembraron a una densidad de 5 x 10
4 células /ml en cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina-en placa de cultivo celular de 24 pocillos. Después de 24 h de la siembra, se añadieron diferentes concentraciones de BCFMT en los pocillos. Las células de control se trataron con vehículo (0,1% DMSO). Después de 24 o 48 h de incubación con BCFMT, la inmunotinción se realizó usando anticuerpo contra α-tubulina, p53, p21, BubR1, ciclina B1, β-actina (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 Alexa-568 de etiqueta), fosfohistona-H3 (Ser 10) (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 marcado con FITC), HEC 1 (1 ° 1:800, 2 ° 1:800 Alexa-568 marcado) y Mad2 (1 ° 1:500 , 2 ° 1:500 marcado con FITC), como se describe anteriormente [29] - [32]. El ADN se tiñeron con Hoechst 33258 (1 mg /ml). Las imágenes fueron tomadas usando Eclipse TE 2000U microscopio (Nikon, Tokio, Japón) a 40 aumentos y se procesan utilizando Image-Pro Plus software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Las mediciones de los microtúbulos dinámica en MCF 7 Las células
La transfección de tubulina α-EGFP construir en células MCF-7 se realizó utilizando lipofectamina-2000 [29]. Los parámetros cinéticos para la inestabilidad dinámica de los microtúbulos se determinaron como se describe anteriormente [8], [31] - [34].
Análisis Western Blot
MCF-7 Las células se incubaron en ausencia y la presencia de 20 y 40 M de BCFMT durante 36 h. El efecto de la cantidad polimerizada de los microtúbulos en las células se determinó por transferencia de Western usando el anticuerpo monoclonal para la α-tubulina como se describe anteriormente [31]. La intensidad de las bandas de proteína se calculó utilizando la versión del software Image J 1.43u.
Efectos de BCFMT en la cinética de la liberación de Nocodazol inducida mitótico bloque en células MCF-7
MCF-7 Las células fueron bloqueadas en fase M del ciclo celular después de 24 h de tratamiento con nocodazole 1 mM. Para eliminar nocodazol, las células se lavaron cuidadosamente cytospinned y tres veces con medio fresco. Después de la eliminación nocodazol, las células se incubaron en ausencia y presencia de 40 BCFMT mu M a 37 ° C. Las células se fijaron en 0, 1, 2 y 4 h de incubación con BCFMT a 37 ° C incubadora. Las células fijadas se tiñeron con Hoechst 33258 y se marcaron las células mitóticas (n = 3; en cada conjunto se contaron 1.000 células).
/PI tinción
MCF-7 células con anexina V (5 × 10
4 células /ml) fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina-en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Después de 24 horas de la siembra, las células fueron incubadas con y sin diferentes concentraciones de BCFMT durante 48 horas. Las células se recogieron por citogiro a 2400 rpm a 30 ° C durante 10 min. tinción con anexina V /PI se realizó tal como se describe anteriormente [30].
Resultados
Efectos Derivados de rodamina en la proliferación de las células HeLa y células MCF-7
Hemos examinado la potencial antiproliferativo de 156 compuestos rodanina utilizando células HeLa. Entre 156 compuestos, tres compuestos, a saber, MNFMT, DHBPT y BCFMT (Fig. 1A), se encontraron para inhibir la proliferación HeLa & gt célula; 30% a 2 mM. MNFMT, DHBPT y BCFMT se seleccionaron para estudios adicionales. MNFMT, DHBPT y BCFMT inhibieron la proliferación de las células HeLa (Fig. 1B) y MCF-7 (Fig. 1C) con una media máxima concentración inhibitoria (IC
50) de 16,8 ± 1, 7,3 ± 0,4, 7,2 ± 1,8 M, y 12,2 ± 0,3, 4,9 ± 0,3 y 10,0 ± 0,5 M, respectivamente.
(A) Estructuras de MNFMT, DHBPT y BCFMT. (B & amp; C) MNFMT, DHBPT y BCFMT inhibieron la proliferación de células HeLa (B) y las células MCF-7 (C) en la cultura. células HeLa y MCF-7 se incubaron con diferentes concentraciones de MNFMT (▪), DHBPT (•) y BCFMT (▴) para un ciclo celular. La inhibición de la proliferación celular se determinó por el ensayo de sulforrodamina B. Los datos fueron un promedio de tres experimentos independientes. Las barras representan la media ± desviación estándar.
Efectos de MNFMT, DHBPT y BCFMT en el ciclo celular MCF-7 progresión
Para determinar el potencial de antimitótico, se comprobó el efecto de estos agentes sobre la ciclina B1 que es un marcador específico de fase G2 /M [35]. BCFMT bloqueó la progresión de células MCF-7 en fase G2 /M con más fuerza que los otros dos compuestos (Tabla 1). Por ejemplo, en las células de control, 3,2 ± 0,5% de las células fueron positivas para la tinción de ciclina B1 mientras que 11 ± 1,5%, 9 ± 2,5% y 29 ± 3% se encontraron células para ser ciclina B1 positiva en presencia de 4 × IC
50 concentración de MNFMT, DHBPT y BCFMT, respectivamente (Tabla 1). En presencia de 200 y 400 nM nocodazol, 21 ± 2% y 44 ± 2% de las células resultaron ser ciclina B1 positivo. También se examinó el efecto de estos compuestos en el índice mitótico (número de células en mitosis /número total de células) de células MCF-7. En el control, se encontró que el índice mitótico a ser 3 ± 0,5 mientras que a ~ 4 × IC
concentración 50 de MNFMT (50 mM), DHBPT (20 M) y BCFMT (40 mM) se encontraron los índices mitóticos ser 4 ± 0,5, 6 ± 1 y 12 ± 1 (n = 3; en cada conjunto se contaron 1.000 células), respectivamente. Los resultados juntos sugieren que BCFMT bloqueado las células en mitosis con más fuerza que los otros dos agentes; Por lo tanto, hemos explorado aún más la actividad antimicótica de BCFMT.
BCFMT aumentado el índice mitótico de las células MCF-7 y las células HeLa
En las células mitóticas histona H3 se fosforilada en la serina 10 [36 ] y se utiliza como un marcador para las células mitóticas. BCFMT tratamiento aumentó el número de células positivas fosfohistona-H3 (Figura S1 en la información de apoyo). Por ejemplo, se encontró que 2 ± 0,5%, 7 ± 1%, y 11,5 ± 1,5% de células para ser fosfohistona H3-positiva en ausencia y presencia de BCFMT 20 y 40 mM, respectivamente. Además, BCFMT-tratamiento aumentó la proporción /anafase metafase en células MCF-7. En las células MCF-7 tratadas con vehículo, la relación de la metafase /anafase se determinó que era 2,7 ± 1,2, mientras que en presencia de 20, 30 y 40 mM BCFMT, las relaciones de la metafase /anafase se determinó que eran 5 ± 1, 10 ± 2 (p & lt; 0,001) y 15 ± 1 (p & lt; 0,001) (n = 3; en cada conjunto se contaron 1.000 células), respectivamente. La relación de índice mitótico y metafase /anafase aumento sugiere que BCFMT inhibió la progresión del ciclo celular de las células MCF-7 células en mitosis. BCFMT también encontró para suprimir la progresión mitótico de las células HeLa como se determina por el índice mitótico, la tinción fosfohistona-H3 y la relación de la metafase /anafase (Figura S2 en la información de apoyo).
Además, se encontró que el tratamiento para retrasar el BCFMT cinética de la liberación del bloqueo mitótico inducido nocodazole- en células MCF-7. Por ejemplo, se encontró que 60% de las células para estar en la mitosis en el momento de lavado nocodazol, mientras que 30%, 15% y 5% de células estaban en la fase mitótica después de 1, 2 y 4 h de liberación del bloque de nocodazol. En presencia de 40 BCFMT mu M, 46%, 38% y 30% de células resultaron ser en la fase mitótica después de 1, 2 y 4 h de liberación de bloques que sugiere que BCFMT puede suprimir la progresión mitótica.
BCFMT inhibido in vitro la polimerización de tubulina
Desde BCFMT inhibe la progresión del ciclo celular en la fase M del ciclo celular; examinamos si BCFMT podría perturbar ensamblaje de los microtúbulos
in vitro Opiniones y en células cultivadas. BCFMT inhibe el ensamblaje de la tubulina purificada de una manera dependiente de la concentración (Fig. 2A). Por ejemplo, en presencia de 25, 50 y 100 mM BCFMT, el grado de polimerización de tubulina se inhibió en un 27 ± 3%, 38 ± 4,5% y 64 ± 3%, respectivamente. La velocidad inicial de aumento de la intensidad de dispersión de luz de la reacción de ensamblaje de los microtúbulos se determinó que era 0,97 ± 0,03, 0,54 ± 0,07 y 0,28 ± 0,06 (au /seg) en ausencia y presencia de 50 y 100 mM BCFMT, indicando respectivamente que BCFMT reduce fuertemente la velocidad inicial de montaje de la tubulina. micrografías electrónicas de control mostraron polímeros típicos de microtúbulos (Fig. 2B). En presencia de BCFMT 25 mM, menos microtúbulos se encontraron por campo de la observación que el control. También induce agregación de dímeros de tubulina. En presencia de BCFMT 50 M, la formación de microtúbulos estaba fuertemente inhibido y solo se encontraron agregados de tubulina (Fig. 2B). En condiciones similares, DHBPT y MNFMT no tuvieron ningún efecto significativo en ensamblaje de los microtúbulos. Por ejemplo, 50 mM DHBPT no tuvo ningún efecto detectable sobre la dispersión de la luz del ensamblaje de los microtúbulos y 50 mM MNFMT disminuyó la señal de dispersión de la luz del ensamblaje de los microtúbulos solamente en un 10%.
(A) tubulina (10 M) fue polimerizado en ausencia (▪) y presencia de 10 (◊), 25 (▴), 50 (x), 75 (○) y 100 (□) micras BCFMT. (B) Las micrografías electrónicas de los polímeros de tubulina en ausencia y presencia de BCFMT 25 y 50 mM. La barra de escala es de 2000 nm. (C) BCFMT suprimió la actividad GTPasa de los microtúbulos. Efectos de la vinblastina sobre la actividad GTPasa de los microtúbulos en condiciones experimentales similares se muestran en el recuadro. Los datos fueron un promedio de tres experimentos independientes. Las barras representan la media ± desviación estándar.
Además, se determinó el efecto de BCFMT sobre la actividad GTPasa de los microtúbulos. BCFMT disminuyó la liberación de fosfato inorgánico en una forma dependiente de la concentración. Por ejemplo, 20, 30 y 50 mM BCFMT reduce la cantidad de fosfato inorgánico liberado por 17%, 25% y 32%, respectivamente (Fig. 2C). En condiciones experimentales similares, 1, 2, 4 y 10 mM vinblastina reduce la cantidad de fosfato inorgánico liberado por 12%, 20%, 25% y 35%, respectivamente, lo que indica que BCFMT inhibe la actividad GTPasa de los microtúbulos como vinblastina (Fig. inserción 2C).
Caracterización de la unión de BCFMT a la tubulina
la fluorescencia intrínseca del triptófano de la tubulina se ha utilizado ampliamente para determinar la constante de unión de un ligando a la tubulina [37]. BCFMT redujo la intensidad de la fluorescencia de triptófano intrínseca de la tubulina de una manera dependiente de la concentración (Fig. 3A). Por ejemplo, en presencia de 10 mM BCFMT triptófano fluorescencia de la tubulina se redujo en un 21 ± 2,5%. Montaje de los cambios de fluorescencia en una isoterma de unión cedido K
d de 8,3 ± 1,8 M (Fig. 3B).
se muestra (A) Los efectos de BCFMT en los espectros de fluorescencia de triptófano de la tubulina. Los espectros se monitorizó en ausencia (♦) y la presencia de 0,25 (▪), 0,5 (▴), 1 (x), 2 (-), 5 (○), 7 (l) y 10 (•) micras BCFMT. (B) El cambio en la intensidad de fluorescencia de la tubulina (Df) se representó frente a la concentración de BCFMT. La constante de disociación (K
d) para la unión a la tubulina BCFMT se estimó utilizando una ecuación describe en los métodos. Los datos fueron la media de cuatro experimentos independientes. (C) La reducción de la intensidad de fluorescencia del complejo tubulin- FL-vinblastina BODIPY en ausencia (♦) y la presencia de 10 (▪), 25 (▴) y 50 (•) M BCFMT. (D) de tubulina (2 M) en las tuberías de 25 mM de tampón (pH 6,8) se incubó con y sin diferentes concentraciones (5, 10, 15, 20, 25 M) de BCFMT a 25 ° C durante 20 min. Se prepararon tres de estos conjuntos diferentes. Después de 20 minutos de incubación, en un juego 2 M (♦), en el segundo set (▴) y en el tercer set 6 M se añadieron 4 M (▪) BODIPY FL-vinblastina. La fluorescencia de la tubulina BODIPY-FL-complejo vinblastina se midió y se calculó la concentración inhibitoria (Ki) a partir de la representación de Dixon modificado.
Los inhibidores de ensamblaje de tubulina en general o bien se unen a la vinblastina o los sitios de unión de colchicina en tubulina [11], [12]. Por lo tanto, se examinó si BCFMT se une a la tubulina en el sitio de la colchicina utilizando colchicina-tubulina de fluorescencia [38]. BCFMT (10 y 20 mM) no inhibió el desarrollo de la fluorescencia colchicina-tubulina que indica que no inhiben la unión de la colchicina a la tubulina (Figura S3 en la información de apoyo). BODIPY FL-vinblastina se ha utilizado para investigar el sitio de unión de vinblastina en tubulina [29]. La intensidad de fluorescencia de BODIPY FL-vinblastina aumentó tras la unión a la tubulina (Fig. 3C). La vinblastina disminuyó la mejora de la fluorescencia de BODIPY FL-vinblastina lo que sugiere que se une al sitio vinblastina en la tubulina. BCFMT también disminuyó la fluorescencia de BODIPY complejo FL-vinblastina-tubulina de una manera dependiente de la concentración que indica que BCFMT inhibió la unión de BODIPY FL-vinblastina a la tubulina (Fig. 3C). Por ejemplo, 10, 25 y 50 mM BCFMT disminución de la fluorescencia del complejo tubulina FL-vinblastina-BODIPY por 40 ± 2,5%, 51 ± 3% y 64 ± 4%, respectivamente.
Además, BODIPY FL- vinblastina mostró un aumento significativo en el valor de polarización de fluorescencia cuando se une a la tubulina (Figura S4 en la información de apoyo). La inclusión de BCFMT en el medio de reacción disminuyó la polarización de BODIPY FL-vinblastina, indicando que se reduce la unión de BODIPY FL-vinblastina a la tubulina. En comparación con el control, 20 ± 3%, 31 ± 4% y 49 la reducción de ± 2% en los valores de polarización de fluorescencia de la tubulina-BODIPY FL-vinblastina se observaron en presencia de 10, 25 y 50 M de BCFMT, respectivamente.
Desde BCFMT inhibida BODIPY FL-vinblastina unión a tubulina, se analizó el modo de inhibición modificada usando [39]. Un análisis de la representación de Dixon modificado sugirió que BCFMT inhibió la unión de BODIPY FL-vinblastina a la tubulina competitivamente con una concentración inhibidora (K
i) de 5,2 ± 1,5 M (Fig. 3D).
A breve exposición de BCFMT despolimerizada los microtúbulos en células MCF-7
para examinar el efecto de BCFMT de microtúbulos celulares, se incubaron las células MCF-7 con y sin BCFMT 40 M durante 3 h. células tratadas con vehículo muestran red típica de los microtúbulos mientras que las células BCFMT (40 M) tratados mostraron una despolimerización significativa de los microtúbulos (Fig. 4A). polímeros microtúbulos no eran visibles en 40 mM células BCFMT tratados; se observó una tinción difusa para tubulina soluble en las células MCF-7 tratadas.
Las células (A) se trataron sin y con BCFMT 40 M durante 3 h y los microtúbulos se tiñeron utilizando el anticuerpo contra α-tubulina (rojo) . (B) BCFMT perturbado organización de microtúbulos interfase de células MCF-7. MCF-7 células se incubaron en ausencia y en presencia de diferentes concentraciones de BCFMT para 48 h. Las células se fijaron y se tiñeron utilizando el anticuerpo contra la α-tubulina (rojo). (C) BCFMT disminuyó la relación de la tubulina polimérico /soluble en las células MCF-7 determinados por transferencia de western. MCF-7 células fueron tratadas sin (carril 1) o con 20 M (carril 4) y 40 M (carril 5) de BCFMT para 36 h. 20 nM taxol (carril 2) y 200 nM nocodazol (carril 3) también se utilizaron en condiciones experimentales similares. fracciones de tubulina poliméricos y solubles se aislaron y cantidades iguales de proteínas se cargaron en SDS-PAGE. La inmunotransferencia se realizó con anticuerpo α-tubulina. Experimento se realizó de forma independiente tres veces. Se muestra es representativa de la mancha. (D) BCFMT despolimerizado microtúbulos del huso en células MCF-7. ADN tiñó de azul. La barra de escala es de 10 micras.
BCFMT despolimerizado microtúbulos del MCF-7 y las células HeLa
células MCF-7 o HeLa se incubaron con diferentes concentraciones de BCFMT para un ciclo celular. BCFMT despolimeriza los microtúbulos en interfase en las células MCF-7 de una manera dependiente de la concentración. Por ejemplo, la red de microtúbulos no estaba visiblemente perturbado en presencia de BCFMT 10 mM mientras BCFMT 20 M indujo una despolimerización significativa de los microtúbulos en interfase y una fuerte despolimerización de los microtúbulos se observó en la presencia de 30 mM BCFMT (Fig. 4B). El análisis de transferencia Western indicó que en las células MCF-7 tratadas con vehículo, la relación de polímero a soluble tubulina era 2,2 ± 0,3 mientras que fue de 1,2 ± 0,1 y 0,8 ± 0,1 en presencia de 20 y 40 BCFMT mu M, lo que sugiere respectivamente que el tratamiento BCFMT microtúbulos celulares despolimerizados (Fig. 4C). Se encontró que la relación de polímero a tubulina soluble en células MCF-7 a ser 3,1 ± 0,2 en presencia de 20 nM de taxol y 1,1 ± 0,1 en presencia de 200 nM nocodazol (Fig. 4C). BCFMT tratos despolimeriza los microtúbulos del huso en células MCF-7 y también indujo la formación de husos monopolares o multipolares con cromosomas mal alineados en la placa de la metafase (Fig. 4D). Al igual que en sus efectos sobre células MCF-7, BCFMT despolimeriza los microtúbulos en las células HeLa en su proliferación efectiva intervalo de concentración inhibitoria (Figura S5 en la información de apoyo). Sin embargo, BCFMT (15 y 30 mM) de tratamiento no perturbar la organización de las fibras de actina en las células MCF-7 (Figura S6 en la información de apoyo).
BCFMT Suprimida microtúbulos reensamblaje en células MCF-7
los microtúbulos se despolimerizan por incubación de las células MCF-7 en hielo durante 1 h y, posteriormente, la cinética de crecimiento de los microtúbulos en interfase se monitorizaron mediante la incubación de las células a 37 ° C. Los microtúbulos de las células tratadas con vehículo crecieron rápidamente y alcanzaron red interfase normal dentro de 30 min mientras BCFMT tratamiento (40 M) suprime fuertemente el crecimiento de los microtúbulos (Figura S7A en la información de apoyo).
Además, el efecto de se analizó BCFMT sobre la cinética de ensamblaje del huso mitótico en las células MCF-7. Las células se bloquearon primero en mitosis mediante su incubación con 1 nocodazole mu M durante 20 h. Las células fueron lavadas cuidadosamente con medio fresco y se incubaron adicionalmente en hielo durante 30 min sin y con BCFMT 40 mM. Posteriormente, las células se colocaron a 37 ° C y la cinética de reensamblaje de los microtúbulos del huso se monitorizó mediante tinción de los microtúbulos en diferentes intervalos de tiempo.