Extracto
ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga son esenciales para probar nuevas terapias y manipulaciones moleculares de líneas celulares
in vivo
. xenoinjertos actuales se basan en la inoculación de células tumorales mediante instilación intravesical o inyección directa en la pared de la vejiga. La instilación está limitada por la falta de líneas de células que son tumorigénicas cuando se entrega de esta manera. El modelo invasivo inflige morbilidad en los ratones por la necesidad de la laparotomía y la movilización de la vejiga. Además, este procedimiento es complejo y requiere mucho tiempo. Tres líneas celulares de cáncer de vejiga (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC13) se inocularon en 50 ratones desnudos atímicos mediante inyección percutánea bajo control ecográfico. PBS se inyectó primero entre la pared muscular y la mucosa de separar estas capas, y las células tumorales se inyectaron posteriormente en este espacio. La bioluminiscencia y el ultrasonido se utilizan para controlar el crecimiento del tumor. ecografía con contraste se utilizó para estudiar los cambios en la perfusión del tumor después del tratamiento con gemcitabina /cisplatino sistémica. Para demostrar la prueba de principio de que los agentes terapéuticos se pueden inyectar en xenoinjertos establecidos bajo guía de ultrasonido, se inyectó virus oncolítico (VSV) en tumores UM-UC3. tejido de xenoinjerto se cosechó para inmunohistoquímica después de 23-37 días. la inyección percutánea de células tumorales en la pared de la vejiga se llevó a cabo de manera eficiente (tiempo medio: 5,7 min) y sin complicaciones en los 50 animales. La ecografía y la bioluminiscencia confirmaron la presencia de tumor en la pared anterior de la vejiga en todos los animales 3 días más tarde. Los volúmenes promedio de tumor aumentó de forma constante durante el período de estudio. tumores UM-UC13 mostraron una marcada disminución en el volumen y la perfusión después de la quimioterapia. Tinción inmunohistoquímica para VSV-G demostró la captación de virus en todos los tumores UM-UC3 después de la inyección intratumoral. Hemos desarrollado un nuevo método para la creación de ortotópico de xenoinjerto de cáncer de vejiga de una manera mínimamente invasiva. En nuestras manos esto ha sustituido el modelo tradicional que requiere laparotomía, ya que este modelo es más eficiente en el tiempo, más preciso y se asocia con una menor morbilidad para los ratones
Visto:. Jäger W, Moskalev I, Janssen C, T Hayashi , Awrey S, Gust KM, et al. (2013) guiada por ultrasonido intramural Inoculación de vejiga ortotópico xenoinjertos de cáncer: Un nuevo enfoque de alta precisión. PLoS ONE 8 (3): e59536. doi: 10.1371 /journal.pone.0059536
Editor: Xiaolin Zi, Universidad de California Irvine, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Enero, 2013; Aceptado: 15 Febrero 2013; Publicado: 26 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Jäger et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Grant financiación fue proporcionada a través de la DFG (WJ; www.dfg.de/en; JA 2117 /1-1:1), la Sociedad del cáncer del Instituto de Investigación de Canadá (PCB; www.cancer.ca/Research.aspx; desde 2.010 hasta 700.527) y una Médico Mentored Scientist Award de Vancouver Coastal Health Research Institute (PCB; http://www.vch.ca/about_us/awards_&_recognition; F08-04967). La plataforma de imágenes de ultrasonido fue financiado por la Fundación Canadiense para la Innovación (PCB; www.innovation.ca; 27255). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común en hombres y el noveno cáncer más común en las mujeres en los países desarrollados [1]. En 2010 se registraron 70,530 casos nuevos y 14.680 muertes por cáncer de vejiga en los EE.UU. [2]. Aproximadamente tres cuartas partes de los casos son invasivos no musculares [3]. Estos tienen una alta propensión a la recurrencia y un subconjunto está en riesgo de progresión a enfermedad invasiva [4]. La una cuarta parte restante de los casos se presentan como el cáncer de vejiga invasivo muscular. A pesar de la terapia multimodal óptima, aproximadamente la mitad de los pacientes con cáncer de vejiga invasivo muscular va a sucumbir a su enfermedad [5]. No hay avances significativos se han hecho en las últimas dos décadas para mejorar la terapia sistémica de esta población de pacientes [6].
Los modelos murinos de cáncer humano utilizando líneas celulares derivadas de tumores de pacientes (xenoinjertos) son una herramienta esencial en Investigación sobre el cáncer. Nos permiten interrogar a la biología del tumor con la manipulación molecular, para identificar biomarcadores diagnósticos y predictivos relevantes, y para probar los efectos antineoplásicos de nuevas terapias. Para el cáncer de vejiga, la inoculación de líneas celulares humanas en el ratón vejiga (xenoinjerto ortotópico) es el estándar de referencia [7], [8]. Esta inoculación se puede lograr ya sea por la instilación intravesical de las células tumorales ( "modelo intravesical") [9] o la inyección directa en la pared de la vejiga ( "modelo intramural") [10]. modelos alternativos incluyen la inoculación de células de cáncer de vejiga murino en ratones inmunocompetentes (modelo singénico) [11], así como modelos transgénicos [12]. modelos similares también son posibles en ratas [13], [14].
Cada modelo de xenoinjerto orthoptic tiene sus defectos. instilación intravesical conduce a la formación de tumores en la superficie urotelial de la vejiga que son susceptibles de la instilación intravesical posterior de nuevos fármacos. Sin embargo, ha demostrado ser extraordinariamente difícil de usar este método para lograr tumoral fiable tomar con cualquier líneas celulares diferentes a [9] KU7, que recientemente se ha comprobado que son HeLa [15]. Además, la inoculación de células intravesical es mucho tiempo y puede conducir a un crecimiento incontrolado del tumor en órganos adyacentes (uretra, uréter, pelvis renal) [16]. Finalmente, la localización del tumor dentro de la vejiga es impredecible, que el crecimiento de tales alrededor de los orificios ureterales puede causar la obstrucción del tracto superior severa antes de ratones llegan a los puntos finales terapéuticos.
La inyección directa de las células tumorales en la pared de la vejiga conduce a la formación de invasiva tumores de la vejiga que son adecuados para tratamientos sistémicos [10]. Aunque varias líneas de células crecen de forma fiable como xenoinjertos en este modelo, la aplicación está limitada por la morbilidad infligido a los ratones por la necesidad de la laparotomía y la movilización de la vejiga [17]. También es técnicamente difícil de asegurar la inyección adecuada en la pared de la vejiga, y este método se asocia con una curva de aprendizaje significativo.
Hemos desarrollado un nuevo enfoque para abordar estas limitaciones de la inoculación intramural de xenoinjertos de cáncer de vejiga, y de ese modo mejorar potencialmente la precisión y reproducibilidad de este modelo. Hemos optimizado la inyección percutánea, guiada por ultrasonido de las células de cáncer de vejiga en la pared anterior de la vejiga. Además, somos capaces de controlar el crecimiento de xenoinjertos y la perfusión
in vivo
longitudinalmente durante la terapia [18], [19], y somos capaces de inyectar agentes terapéuticos directamente en el tumor bajo guía ecográfica. Aquí se demuestra la viabilidad y reproducibilidad de la inoculación intramural guiada por ultrasonido de xenoinjertos de cáncer de vejiga ortotópico así como la posterior manipulación y supervisión de la imagen guiada.
Materiales y Métodos
Animales
cincuenta 10 semanas de edad, los ratones desnudos atímicos hembra fueron comprados a Harlan (Indianapolis, IN, EE.UU.). Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Columbia Británica (Número de protocolo: A10-0192).
líneas de células tumorales
Las líneas celulares de cáncer de vejiga humana UM-UC1, UM -UC3 y UM-UC13 fueron amablemente proporcionados por el núcleo de Patología del cáncer de vejiga SPORE en el MD Anderson Cancer Center (Houston, TX, EE.UU.) [20] - [22]. identidades de líneas celulares fueron confirmados por la huella de ADN utilizando el protocolo de amplificación AmpFlSTR® Identifiler® (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.) [23]. Todas las líneas celulares se cultivaron durante menos de 3 meses en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera.
Para
in vivo
estudios, las líneas celulares se sometieron a transducción con un constructo lentiviral que lleva el gen de la luciferasa de luciérnaga
in vivo
de imágenes [9]. El plásmido de luciferasa contenía un gen de resistencia a blasticidina que permite la selección positiva con 10 mg /ml de blasticidina (Invitrogen, Life Technologies Inc., Burlington, ON, Canadá). Las líneas celulares fueron controlados por la actividad de luciferasa in vitro y el número de células se correlacionó con la bioluminiscencia (R & gt; 0,99; datos no mostrados), utilizando el Xenogen IVIS Spectrum (Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA, EE.UU.). Para los estudios de xenoinjertos se recogieron las células en 70% de confluencia y se suspendieron en Matrigel® (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá). La concentración de células fue modificado basado en la cinética de crecimiento previamente establecidos de las tres líneas celulares diferentes (UM-UC1 luc 9 × 10
6 /ml; UM-UC3 luc 12 × 10
6 /ml; luc UM-UC13 11 × 10
6 /ml).
tumor percutánea inoculación
inoculación del tumor se realizó con la pequeña plataforma de imágenes de animales Vevo 770® (Visual Sonics, Toronto, ON, Canadá). Una alta frecuencia RMV 706 cabeza de exploración de ultrasonido (20-60 MHz), lo que permitió una resolución lateral de 30 micras y las tasas de fotogramas de hasta 240 fps, se utilizó.
Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se monta en la formación de imágenes mesa con un seguimiento continuo de los signos vitales [Fig. 1A]. El abdomen se desinfectó con alcohol y se aplicó gel de ultrasonido estéril. La vejiga se visualiza en la pantalla [Fig. 1B] y el lumen de la vejiga se llenó con solución salina estéril, tamponada con fosfato caliente (PBS) a través de un angiocatéter de calibre 24 a un volumen deseado de 50 a 100 l.
A. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se montan en la mesa de formación de imágenes se calienta con el control continuo de los signos vitales. Después de la visualización de la vejiga con una pequeña plataforma de formación de imágenes de animales del Vevo 700® la piel se perfora con una aguja 30G. B. visualización ecográfica de la vejiga normal de ratón en la sección sagital con dimensiones típicas indicadas (dimensiones de la luz 4.4 × 6.5 mm; ancho de la pared 0,25 mm).
Una jeringa de 1,0 mL llena con PBS y se conecta a un 30 calibre, de ¾ de pulgada de la aguja (Kendall, Mansfield, MA, EE.UU.) fue llevado a la piel justo por encima del hueso púbico en un ángulo de 30 ° con el bisel dirigido hacia delante. Después de la detección de la aguja en la pantalla del ultrasonido [Fig. 2A], se pasa a través de la piel y los músculos de la pared abdominal [fig. 2B]. El bisel de la aguja se gira 180 ° (dirigida posteriormente) antes de la punta se inserta en la pared de la vejiga sin penetración de la mucosa [Fig. 2C]. PBS (50 l) se inyectó entre la capa muscular y la mucosa para crear un espacio [Fig. 2D] y la aguja fue retirada. Una segunda jeringa de 1,0 mL (lleno de células de cáncer suspendidas en Matrigel®, (BD Biosciences)) con una aguja de calibre 30, de ¾ de pulgada fue guiado en el mismo espacio [Fig. 2E]. 40 l (UM-UC1 luc) o 50 l (luc UM-UC3, UM-UC13 luc) de la suspensión de células se inyectaron en este espacio [Fig. 2F].
A. La detección de la aguja en la pantalla del ultrasonido. B. La perforación de la piel y los músculos de la pared abdominal. C. inserción de la aguja en la pared de la vejiga sin penetración de la mucosa. D. La inyección de PBS (50 l) entre la capa muscular y la mucosa. E. Orientación de la segunda aguja en el espacio creado artificialmente. F. La inyección de células tumorales suspendió en Matrigel®.
En dos de agarosa ratones adicionales se inyectaron de forma similar con el fin de establecer la ubicación exacta de la inoculación de xenoinjertos dentro de la pared de la vejiga. Los ratones se sacrificaron inmediatamente y sus vejigas se eliminaron para el análisis histológico.
Crecimiento xenoinjerto Monitoring
El crecimiento tumoral se controló mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) y ultrasonido cada tercer día a partir de 4 días después de la inoculación del tumor . El sistema Xenogen IVIS se utilizó para BLI y los ratones se obtuvieron imágenes de 10 y 15 minutos después de la inyección intraperitoneal de D-luciferina (150 mg /kg de peso corporal; Firefly, Caliper Life Science). ultrasonido 3D se realizó en ratones anestesiados con la exploración de la vejiga en su conjunto en pasos de 0,1 mm. El volumen del tumor se determinó utilizando el paquete de Visual Sonics software de imágenes mediante el análisis de cada quinta imagen de acuerdo con el manual de usuario [24].
microburbujas con contraste Análisis Ecografía de tumores
Para visualizar el estado de la perfusión de los tumores de xenoinjertos, un bucle de cine se registró como la referencia. Un segundo bucle de cine (1000 fotogramas a 30 Hz) se registró 10 segundos después de la inyección de 120 mu l microburbujas no específica (Visual Sonics) en la vena de la cola de ratones anestesiados. Se determinó el punto en el que las microburbujas entraron en el avión y se restó la referencia de fondo. El tumor fue seleccionada como la región de contraste y se usaron de referencia medio sustraído de datos. Los cambios de la Zona contraste porcentual en el tiempo y se documentaron las imágenes 2D se registraron en el que cualquier pixel fue marcado en verde cuando un microburbujas pasó [24].
Tratamiento
intratumoral del virus de la inyección.
para demostrar el potencial de la ecografía guiada inyección intratumoral percutánea de agentes de tratamiento en xenoinjertos establecidos, se inyecta el virus oncolítico (VSV) en xenoinjertos luc UM-UC3 en el día 22 después de la inoculación. La carga tumoral según lo determinado por BLI y el ultrasonido se utiliza para dividir los animales en dos grupos relativamente iguales. Los tumores se visualizaron longitudinalmente por ultrasonido y se insertó una aguja 30G en el centro del tumor [Fig. 3A]. VSV (1,05 × 10
7 pfu) suspendidos en 25 l de PBS se inyectó en los ratones 7, y solo PBS se inyectó en el grupo de control (n = 7).
A. Los xenoinjertos se visualizaron por ultrasonido y, o bien VSV (1,05 × 10
7 pfu) disuelto en 25 l de PBS o PBS solo se inyectó a través de una aguja 30G en el centro del tumor. B. 48 h después de la inyección de VSV, todos los tumores de xenoinjertos mostraron tinción positiva para VSV-G alrededor del sitio de inyección que correlaciona con la tinción de TUNEL. C. VSV-G y la tinción de TUNEL fueron negativos después de la inyección de PBS solo.
La quimioterapia sistémica.
Para demostrar el potencial de
in vivo
monitoreo en tiempo real de la perfusión de xenoinjerto, se trataron ratones portadores de tumores luc UM-UC13 con quimioterapia citotóxica. En el día 28 después de la inoculación, los ratones se dividieron en dos grupos iguales sobre la base de la carga tumoral determinado por ultrasonido y BLI. Ocho animales recibieron gemcitabina intraperitoneal (120 mg /kg de peso corporal; Sandoz, Boucherville, QC, Canadá) en el día 30 y 35, así como el cisplatino (2,5 mg /kg de peso corporal; Hospira, Saint-Laurent, QC, Canadá) en el día 31 y 36. Un volumen equivalente de PBS se inyectó en los mismos momentos en los animales de control (n = 7).
Histología
UM-UC3 luc, UM-UC1 luc y UM-UC13 xenoinjertos luc se recogieron después de 24, 28 y 37 días, respectivamente. En la necropsia, la pelvis, el retroperitoneo, el hígado y los pulmones fueron examinados cuidadosamente para posibles metástasis, y se eliminó cualquier tejido sospechoso. Este tejido y todo el vejigas fueron fijadas en formalina, embebido en parafina y cortadas en secciones de 4 micras que se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). La profundidad de la invasión tumoral se determinó por un patólogo (LF). Para UM-UC3 tumores se aplicó una etapa T según 7
ª edición del Comité Conjunto sobre el Cáncer de clasificación /Unión Internacional Contra el Cáncer (AJCC /UICC) TNM [25].
La detección de apoptosis las células de la técnica de TUNEL (Terminal desoxinucleotidil transferasa dUTP nick fin de etiquetado) se realizó utilizando transferasa terminal (# 03333566001, Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.), dATP (D4788, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) y DIG-11-dUTP (# 1558706, Roche Applied Science). Utilizando el anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína G de VSV (VSV-G; 1:300, ab1874, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo por el modelo de tinción automática Ventana Descubrir XT (Ventana Medical System, Tucson, AZ, EE.UU. ) con un sistema de estreptavidina biotina marcado con enzima y el kit de Mapa 3,30-diaminobenyidine resistente a los disolventes. Todas las muestras se analizaron posteriormente por un patólogo (LF) y el porcentaje de inmunoexpresión para VSV-G y la tinción de TUNEL se detectó a 200 × aumentos.
Análisis estadístico
Para los análisis estadísticos, la significa volúmenes de bioluminiscencia y tumorales se determinaron con sus desviaciones estándar. La significación de las diferencias se midió mediante la prueba de la t de Student (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.) y P & lt; 0,05 fue considerado significativo. parcelas de regresión se utilizan para describir la correlación entre la bioluminiscencia y volumen.
Resultados
La inoculación de células tumorales
guiada por ultrasonido de tumores de células de la inoculación se realizó con éxito en 50 animales (UM UC1 luc 20 animales, UM-UC3 luc 15 animales y UM-UC13 luc 15 animales) [Tabla 1]. El típico experimental y las imágenes de ultrasonido representativos y dimensiones de la vejiga murino se representan en la Fig. 1. Los pasos de la inoculación se muestran en la Fig. 2. El tiempo medio por procedimiento (de montaje de los ratones sobre la mesa hasta la inyección final) pueden ser la reducción de 7,7 ± 3,7 min para el primer grupo (UM-UC3 luc) a 3,4 ± 1,6 min para el tercer grupo (UM-luc UC1 ). Ninguno de los animales sufrió ninguna complicación durante el procedimiento. La inyección de gel de agarosa demostró que la inoculación se encuentra estrictamente entre la lámina propia y la túnica muscular [Fig. 4]
El sagital H & amp;. La sección E de la vejiga murino entero demuestra una capa de gel estrictamente en la lámina propia entre la mucosa y la muscular propia
xenoinjerto. el crecimiento de Seguimiento
los 50 animales mostraron tumor detectable en la pared anterior de la vejiga en la ecografía en la 4
º día después de la inoculación. Los volúmenes del tumor inicial y final se resumen en la Tabla 1. Después de la inoculación de UM-UC3 luc, un ratón mostró diseminación tumoral intraperitoneal e involucionado un tumor tras día 7. Patrones similares se observaron con BLI. Todos los ratones tenían luminiscencia detectable en la 4
º día, y esto aumentó de forma constante en todos menos un ratón. La tasa global de absorción de tumor era 98%. Estos resultados fueron confirmados en el momento de la necropsia.
Durante el crecimiento del tumor [Fig. 5A, 5B] la relación entre el volumen del tumor entero y BLI no era estable, pero variable en función del tiempo después de la inoculación de células tumorales y de todo el volumen del tumor en sí. A pesar de que se había producido una tendencia hacia una mejor correlación a lo largo del curso temporal (R
2 = 0,75, 0,82 y 0,92 para UM-UC1 luc en el día 16, UM-UC3 luc en el día 19 y luc UM-UC13 en el día 34, respectivamente [Fig. 5C]), una drástica disminución de la luminiscencia por el volumen del tumor se observó ml en volúmenes de tumor (datos no mostrados) .We han demostrado previamente un papel para la hipoxia y la necrosis en esta correlación [17].
El crecimiento del tumor se midió a intervalos de tiempo regulares por: A. imágenes de bioluminiscencia, y B. ultrasonido. C. Correlación de bioluminiscencia y xenoinjerto de volumen para todas las tres líneas celulares. sección E de un representante de xenoinjertos luc UM-UC1 que demuestra el crecimiento invasivo en el músculo (*) sin invasión a órganos adyacentes; D. H & amp. Todos los tumores se originaron de la pared anterior de la vejiga y, a menudo ocuparon la mayor parte de la luz de la vejiga sin infiltrarse en la pared posterior (**).
Tres ratones (dos luc UM-UC1 y una luc UM-UC3) fueron sacrificados por razones humanitarias relacionadas con la carga tumoral excesiva antes del final del seguimiento previsto
Histología
el examen de los xenoinjertos de H & amp;. e secciones demostró que todos los tumores eran invasivos en el músculo y algunos en la grasa perivesical, pero no había ninguna evidencia de invasión en órganos adyacentes [Fig. 5D]. Ninguno de los tumores crecieron a través de la lámina propia en el lumen de la vejiga. linfadenopatía retroperitoneal se observó en el 60% de UM-UC13 luc y el 20% de los xenoinjertos luc UM-UC3. Esto fue confirmado por H & amp; E tinción (datos no mostrados). Estadificación TNM se realizó a modo de ejemplo para todos los tumores luc UM-UC3 por análisis histológico de los tumores primarios y los ganglios linfáticos retroperitoneales, así como el análisis macroscópico de hígado y los pulmones [Tabla 2].
Después de la inyección intratumoral de VSV en xenoinjertos luc UM-UC3 [Fig. 3A], los 7 tumores mostró tinción positiva para VSV-G. Las mismas zonas de los tumores tinción para VSV-G tinción también se demuestra en el ensayo de TUNEL [Fig. 3B]. En contraste, VSV-G tinción fue negativa para los xenoinjertos tratados con PBS en el control negativo [Fig. 3C].
respuesta a la quimioterapia
Los ratones con tumores luc UM-UC13 mostró una notable respuesta a la combinación de gemcitabina y cisplatino. El volumen tumoral medio disminuyó significativamente de 48,6 l (± 7,7) a 25,3 l (± 5,8) después de 7 días de tratamiento, mientras que aumentó de 48,8 l (± 14,8) a 114,5 l (± 26,8) en el grupo de control [Fig. 6A].
A. Los ratones portadores de tumores luc UM-UC13 mostraron una notable disminución en el volumen del tumor después de la terapia sistémica con una combinación de gemcitabina y cisplatino a partir del día#28 después de la inoculación, comparado con el control PBS (** = P & lt; 0,01). B. xenoinjerto de perfusión se mide por inyección y las imágenes por ultrasonido de microburbujas que no son objeto de xenoinjertos luc UM-UC13 antes y 5 días después de la administración del agente de control (PBS; panel izquierdo) o la quimioterapia sistémica (gemcitabina /cisplatino; panel de la derecha). La perfusión se cuantificó como área de contraste por ciento. resultados solo representante de cada 4 animales por grupo medidos se muestran.
La perfusión del tumor de xenoinjerto se midió antes y después de la administración de la quimioterapia sistémica con microburbujas no específicos. La quimioterapia condujo a una disminución en la velocidad de perfusión (porcentaje de área de Contraste) de 84% a 66%, mientras que el mismo parámetro se mantuvo constante después del tratamiento con PBS solo (79% vs. 77%) [Fig. 6B].
Discusión
La existencia de modelos animales fiables es un requisito básico en la investigación oncológica para la investigación in vivo de la biología del tumor y el ensayo de nuevas estrategias de tratamiento antineoplásicos. A pesar de la existencia de singénico reproducible [11] y transgénico [12] modelos de tumor ortotópico de cáncer de vejiga, no son ampliamente utilizados debido tanto a las limitaciones inherentes (por ejemplo aplicabilidad cuestionable de modelos singénicos de cáncer murino de la vejiga a la enfermedad humana) y la complejidad de la modelos, así como la intensidad de la utilización de recursos asociados. modelos de xenoinjertos ortotópico han demostrado ofrecer la mayor flexibilidad (en términos de la selección de líneas celulares) y tienen la utilidad más práctica, y por lo tanto seguir siendo el estándar de oro para el modelado in vivo de cáncer de vejiga [7], [8].
en este trabajo, hemos generado un nuevo modelo in vivo de xenoinjertos de cáncer de vejiga ortotópico a través de la inoculación de las células del cáncer de vejiga humana en la vejiga murino y han demostrado que es altamente reproducible. Los tumores se establecieron en el 98% de los ratones inoculados utilizando tres líneas celulares humanas diferentes. Debido a la excelente resolución óptica, las células tumorales pueden ser inoculadas por alta precisión estrictamente en la pared anterior de la vejiga, lo que reduce la tasa de complicaciones obstructivas y permitiendo que los períodos de crecimiento y de tratamiento más largos. Además, el tiempo por inoculación es corto en comparación con los modelos existentes, y disminuye rápidamente con la experiencia adicional. La complicación observada solo era una difusión de células tumorales intraperitoneal que se produjo en uno de los primeros animales inyectados y se puede atribuir a la inyección de un volumen demasiado importante en relación con el tamaño del animal. Esto fue apoyado por el hecho de que la reducción del volumen de inyección de 50 a 40 l no dio lugar a más complicaciones.
Nuestro modelo es una modificación del modelo ortotópico descrito previamente por Dinney et al. [10]. Creemos que la inoculación del tumor guiada por ultrasonido mejora este modelo debido a su facilidad, rapidez, precisión y disminuimos grado de invasión. Este último factor es no sólo uno de bienestar de los animales, sino que también puede contribuir a la reproducibilidad de los experimentos por la disminución de las complicaciones quirúrgicas de confusión. La precisión de la inyección intramural estándar a través de una laparotomía está limitada por la capacidad para determinar la ubicación exacta de la aguja en el momento de la inyección. La forma y distribución de la ampolla en la pared de la vejiga después de la inyección a menudo confirman ubicación correcta, pero no hay confirmación a priori antes se inyectan las células. Esto significa que una cierta proporción de los ratones se habrá células se inyecta en el lumen de la vejiga o derramado sobre la superficie serosal de la vejiga. Con la técnica de ultrasonido, se crea un espacio por vía submucosa en la pared de la vejiga con solución salina, lo que no conlleva ningún riesgo de derrame, y la posterior inoculación de células tumorales sigue fácilmente en el mismo espacio bajo visualización directa.
Supervisión volumen del tumor por ultrasonido aumenta la información obtenida por BLI en el modelo de xenoinjerto ortotópico. Mientras BLI se ha convertido en un componente integral de la detección de tumores y el análisis de crecimiento, no siempre se correlaciona bien con el volumen del tumor. Hemos demostrado previamente en el modelo de xenoinjerto ortotópico que la perfusión del tumor y la hipoxia confundir la relación entre el volumen y la luminiscencia [17], y la misma es presumiblemente responsables de las diferencias que se muestran aquí. Esto es particularmente cierto en tumores más grandes [26], mientras que poco después de la inoculación tamaño de ultrasonido puede ser inexacto debido a que el volumen de fluido inyectado, el edema del tejido circundante, y el hecho de que sólo una proporción de células inyectadas sobrevivir y crecer.
Una ventaja adicional de la ecografía es la capacidad de inyectar nuevos agentes de tratamiento directamente en el tumor. Aquí hemos demostrado la viabilidad de la administración intratumoral de oncolítico VSV. La misma técnica sería susceptible de otras estrategias de tratamiento para el cáncer de vejiga, tales como la terapia génica o la aplicación de nanopartículas [27], [28]. Como un ejemplo de la relevancia de la inyección intratumoral en el tratamiento de cánceres humanos, la inyección intratumoral de ADN plasmídico recientemente ha sido probado en la terapia de los cánceres de páncreas no resecables [29].
También hemos demostrado la capacidad de controlar la vascularización del tumor durante el tratamiento de drogas, en este caso la quimioterapia citotóxica tradicional. Esta capacidad será particularmente útil cuando se evalúa la respuesta de los tumores a nuevos productos terapéuticos, incluyendo el desarrollo de resistencia que puede ser reflejada por un fracaso para disminuir la vascularización.
La principal limitación de la inoculación del tumor guiada por ultrasonido es la dependencia de la plataforma de imágenes de ultrasonido, que puede no ser fácilmente accesible para muchos investigadores. Por otra parte, este modelo requiere estar familiarizado con imágenes ecográficas. Por otro lado, el modelado complejo animales de cánceres humanos, al igual que la cirugía compleja en pacientes humanos, puede ser mejor realizado por los centros de excelencia a través de colaboraciones científicas.
Nuestro modelo no necesariamente sustituye a la instilación intravesical de la vejiga líneas celulares de cáncer [9], [30]. El modelo intramural es superior al modelo intravesical para la mayoría de aplicaciones debido a la capacidad de utilizar varias líneas celulares diferentes. El modelo intramural, sin embargo, no tiene ninguna utilidad para las pruebas de nuevas terapias entregados por vía intravesical porque los tumores no interrumpen la superficie urotelial (lámina propia) en el lumen de la vejiga, y las drogas, por lo tanto no penetran fácilmente en el tumor. Estos tumores crecen expansivamente lejos del lumen de la vejiga de manera que los fármacos administrados en el lumen de la vejiga no pueden penetrar en la profundidad completa del tumor. Por otra parte, el modelo intramural representa la enfermedad invasiva del músculo, que nunca se trata con terapia intravesical en la práctica clínica. En el modelo de tumor intravesical, por otro lado, la superficie del tumor se expone en el lumen de la vejiga y el tumor generalmente no crece más allá de la lámina propia durante varias semanas [9], por lo que los medicamentos administrados en el lumen de la vejiga puede penetrar adecuadamente la tumor. La limitación más significativa al modelo intravescial, sin embargo, es su restricción a muy pocas líneas celulares que, incluso en las manos más experimentadas, crecen sólo en una forma poco fiable.
Conclusiones
Tenemos desarrollado con éxito una técnica para la inoculación guiada por ultrasonido de xenoinjertos de cáncer de vejiga ortotópico que mejora significativamente los modelos preexistentes de cáncer de vejiga. Las principales ventajas de este modelo se encuentran en la rapidez y la facilidad de la inoculación del tumor, así como en la precisión y reproducibilidad del modelo. Además, somos capaces de controlar el volumen del tumor en sentido longitudinal con ultrasonido, para medir la perfusión del tumor in vivo con agentes de contraste de microburbujas, y para inyectar agentes terapéuticos en el tumor bajo guía ecográfica.
Reconocimientos
quisiera agradecer a Ben Deeley por su ayuda en la formación de imágenes por ultrasonido y Eliana Beraldi por su ayuda en la transducción viral de las líneas celulares.