Extracto
Recientemente hemos demostrado que las células cancerosas que se recuperan de exhibición daños aumentaron la glucólisis aeróbica, sin embargo, los mecanismos moleculares mecanismo por el cual las células cancerosas sobrevivan los daños y muestran el aumento de la glucólisis aeróbica sigue siendo desconocido. Aquí, hemos demostrado que diversas células de cáncer que sobreviven a la hipoxia o la proliferación celular rápida muestran el daño oxidativo, y desarrollan tolerancia a los daños asociados con el aumento de la producción de sulfuro de hidrógeno (H
2S) que acciona sobre regulación de nicotinamida fosforribosiltransferasa (Nampt). En consonancia con la existencia de un H
circuito energético 2S-Nampt, daños en las células cancerosas se recuperó, H
2S, Nampt y exhibir la producción de ATP una correlación significativa. Por otra parte, el tratamiento de células cancerosas con H
2S donante, NaHS, aumenta coordinadamente Nampt y los niveles de ATP, y protege las células del daño inducido por fármacos. La inhibición de la cistationina beta-sintasa (CBS) o cistationasa (CTH), enzimas que impulsan la generación de H
2S, disminuye la producción de Nampt mientras que la supresión de la vía por la Nampt FK866, disminuye H
2S y los niveles de ATP. células recuperadas de daños aislados de tumores que crecen subcutáneamente en ratones atímicos también muestran un aumento de la producción de H
2S, Nampt y los niveles de ATP, asociados con un aumento glucólisis y la proliferación rápida. En conjunto, estos datos muestran que después de la recuperación de potencial daño letal, H
2S-Nampt dirige el gasto de energía y la glucólisis aeróbica en las células cancerosas, conduce a su crecimiento exponencial, y causa un alto grado de tolerancia a los daños. Identificación de H
2S-Nampt como una vía responsable de la inducción de la tolerancia al daño en las células cancerosas pueden ser la base de la resistencia a la terapia y ofrece la oportunidad de dirigir esta vía como medio en el tratamiento del cáncer
Cita.: Sanokawa-R Akakura, Ostrakhovitch EA, Akakura S, S Goodwin, Tabibzadeh S (2014) AH
2S-Nampt dependiente Circuito energético es fundamental para la supervivencia y la citoprotección de daños en las células cancerosas. PLoS ONE 9 (9): e108537. doi: 10.1371 /journal.pone.0108537
Editor: Stefan Strack, Universidad de Iowa, Estados Unidos de América
Recibido: 29 de mayo de 2014; Aceptado: 27 Agosto 2014; Publicado: 23 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Sanokawa-Akakura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
En los últimos años, se ha demostrado que gasotransmitters, óxido nítrico (NO), el monóxido de carbono (CO) y sulfuro de hidrógeno (H
2S), juegan un papel crítico en diversas funciones fisiológicas, incluyendo el tono vascular, la defensa del huésped contra los patógenos, la neuromodulación, apoptosis, y el metabolismo energético en células de mamíferos [1]. Entre estas moléculas gaseosas, H
2S se produce durante el metabolismo de aminoácidos por las vías de trans-sulfuración y cisteína desulfuración [2]. Endógena H
producción 2S es catalizada por tres enzimas, cistationina beta-sintasa (CBS), cistationasa (CTH), también conocidos como cistationina gamma-liasa, y sulfurtransferase 3-mercaptopiruvato (MST) [3] - [5].
H
2S funciona como un estimulador de la bioenergética celular, contribuye al aumento de la dependencia de las células cancerosas en la ruta glicolítica para la producción de ATP y promueve la angiogénesis y la citoprotección [6] - [8]. H
2S protege las células del estrés oxidativo [9], que puede afectar a la respuesta celular a la lesión [10], [11] y se demostró que exhiben ambos efectos pro-apoptóticos y anti-apoptóticos [12] - [14]. Aunque algunos sugerido que H
2S tiene efectos contra el cáncer [15], otros informaron que promueve la proliferación de células HCT116 y SW480 de cáncer de colon [16]. Fu
et al.
Mostró que Ca
2 + causas de estimulación aumento de la expresión CTH y aumenta H
2S y la producción de ATP [17]. Se demostró que endógena H
2S producción impulsada por 3-MST complementa y equilibra las bioenergética celular y mantiene el flujo de electrones en la mitocondria [18]. células de cáncer de colon se ha demostrado que exhiben hasta reguladas expresión de CBS y el aumento de formación de H
2S, que dirige la proliferación celular y la angiogénesis en el cáncer de colon [6].
Se sabe que las células tumorales pueden recuperarse de potencial daño letal inducida por la hipoxia, acidosis, o por la radiación y tratamiento de drogas [19] - [22]. Recientemente hemos informado de que las células cancerosas que se recuperan de los daños inducidos por la hipoxia, acidosis y la glucosa espectáculo privación remodelación mitocondrial, el aumento de la glucólisis aeróbica, y presentan una alta tasa de producción de ATP [23]. En este estudio, se explora el papel de H
2S en el proceso de recuperación de las células cancerosas de los daños. las células cancerosas dañadas agotan su suministro de energía debido a los mecanismos de reparación. Tanto ATP y NAD
+ (nicotinamida adenina dinucleótido) son las principales fuentes de energía. fosforribosiltransferasa nicotinamida (Nampt), una enzima necesaria para NAD ruta de recuperación sintético [24], es vital para el mantenimiento del suministro de energía celular. Por lo tanto, hemos examinado el papel de Nampt en conjunción con H
2S en las células cancerosas que se recuperan de los daños. Se demuestra que H
2S controla la recuperación de las células de cáncer de daños mediante la regulación de Nampt cambio dirigido en el gasto de energía, que impulsa la adopción de la glicolisis aerobia y aumento de ATP y NAD
+ síntesis. La interacción de H
2S y Nampt confiere a las células cancerosas de una alta tasa de proliferación y un alto grado de tolerancia al daño.
Materiales y Métodos
Materiales
H
2O
2, NaHS, bleomicina,
O CD - (carboximetil) hidroxilamina hemihidrocloruro (CHH) DL-propargilglicina (PAG) y FK866 se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Los anticuerpos contra CBS (A-2), CTH (G-1) y β-actina (C-2) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra Nampt (visfatina, PBEF) y Bax se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA). Anticuerpo contra γ-H2AX se adquirió de Millipore (Billerica, MA). Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante se adquirieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories (Baltimore, PA).
Cultivo celular
HepG2, MDA-MB-231 y MDA-MB-435S se obtuvieron de ATCC ( Manassas, VA) se cultivaron en DMEM con glutamina 2 mM, glucosa 25 mM y suero bovino fetal al 10%, en 37 ° C incubadora con 5% de CO
2. El daño fue inducida en las células de cáncer por la hipoxia, privación de glucosa y peróxido de hidrógeno. Para la inducción de la hipoxia (DR
H), las células fueron incubadas durante 18 horas en 1% de O
2. Para la privación de glucosa (DR
G), las células se cultivaron durante 18 horas en un medio sin glucosa en presencia de 5% de CO
2. Para la inducción del daño por el peróxido de hidrógeno (DR
H2O2), las células fueron tratadas con 800 mM H
2O
2 durante 3 horas.
Los experimentos con animales
Cuidado de los animales y todos los procedimientos se llevaron a cabo después de la aprobación de los Comités institucionales de Cuidado de animales de la Universidad de California, Irvine (protocolo#2.012 a 3.042). Ocho semanas de edad desnudos (Nu /Nu) ratones macho atímicos (n = 10) fueron adquiridos de Charles River Laboratories (San Diego, CA). Los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano antes de la inyección de las células tumorales. Cada ratón recibió 1 × 10
5 células tumorales en un volumen total de 100 l por vía subcutánea en cuatro localizaciones en las áreas del flanco abdominal media e inferior. Los ratones se controlaron 2 veces por semana durante el experimento el crecimiento del tumor. Veinte días después de la inyección de las células, los ratones fueron sacrificados por inhalación de dióxido de carbono cuando los tumores crecieron con el tamaño de 10 a 15 mm de diámetro. Los tumores fueron removidos para el aislamiento de las células cancerosas viables (T
V) o el daño se recuperaron las células de los
in vivo
tumoral crecido (T
DR).
Medición de H
2S producción en
Medición adicional y las células de intra extracelular H
2S nivel se realizó utilizando el Analizador de Free Radical (TBR4100 e ISO-H2S-2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) siguiendo las instrucciones del fabricante . En pocas palabras, el número de células se ajustó a 1 x 10
6 células viables en PBS y las suspensiones celulares se incubaron a 37 ° C durante 1 hr. Las células fueron entonces centrifugadas y los sobrenadantes fueron sometidos a mediciones. Antes de cada medición, el sensor se polarizó y calibrado mediante la adición de cuatro alícuotas de la Na
2S solución madre a las concentraciones finales de 0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 mM. La detección de intracelular H
2S fue realizado por H
2S sonda fluorescente HSN2 (una especie de regalo del profesor Michael D. Pluth, Universidad de Oregon, Departamento de Química, Eugene, Oregón).
Total extracción de la proteína celular y transferencia Western
Las proteínas de las células se extrajeron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% NP-40, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, 1 mM Na
3Vo
4, 50 mM NaF, y cóctel inhibidor de la proteasa). mediciones de proteína se llevaron a cabo mediante el ensayo de proteína Bio-Rad basado en Bradford método de fijación de colorante (Bio-Rad Lab, Hercules, CA).
bandas blotting se detectaron por quimioluminiscencia ECL (Amersham ECL Plus Western Blotting Detección reactivos de GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) usando C-Digit digital Imager (LI-COR, Lincoln, NE) y el análisis densitométrico se realizó utilizando el software de análisis myImage (Thermo Scientific). β-actina sirvió como control de carga.
La viabilidad celular de medición
Número celular relativa se midió mediante el ensayo XTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células se incubaron con XTT y metosulfato de fenazina (PMS) a 37 ° C durante 2 horas y se leyó la absorbancia a 450 y 650 nm como referencia.
Invertir reacción de transcripción-polimerasa en cadena (PCR) y PCR cuantitativa ( qPCR)
El ARN total se aisló utilizando GenElute mamíferos ARN total Miniprep Kit (Siγma-Aldrich, St. Louis, MO). La transcripción inversa se realizó a través de alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). RT-PCR se llevó a cabo utilizando los cebadores específicos para la CBS humana (adelante: GAACCAGACGGAGCAGACAA; revertir: GTCGCTCAGGAACTTGGTCA), de la CTH humana (adelante: AAAGACGCCTCCTCACAAGG; inversa: AAGGCAATTCCTAGTGGGATTTC) y para el sistema multilateral de comercio humana (adelante: CGCCGTGTCACTGCTTGAT; inversa: CAGGTTCAATGCCGTCTCG ). La expresión génica se evaluó por PCR utilizando
Taq
5 × Master Mix (New England Biolabs. Ipswich, MA) con una etapa de desnaturalización inicial 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos con cada uno a 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 segundos, y 68 ° C durante 1 min.
La evaluación cuantitativa se realizó mediante el uso de software de análisis myImage (Thermo Scientific, Nueva Hampshire). Para la normalización de los datos,
β-actina
se amplificó con los cebadores específicos (adelante: AAGCCACCCCACTTCTCTCT; inversa: GAGACCAAAAGCCTTCATACATCT). qPCR se realizó utilizando el kit Quanti Tect SYBR Green PCR. qPCR se llevó a cabo utilizando los cebadores específicos para el NAMPT humana (adelante: ATC CTG CAG TTC GCT ATT CTG; revertir: CCC CAT ATT TTC TCA CAC GCA T).
XF (flujo extracelular) análisis bioenergético
XF24 extracelular flujo Analizador de Seahorse Bioscience (N. Billerica, MA) se utilizó para el análisis bioenergético líquido extracelular [25]. Bajo típica
in vitro | condiciones actuales de cultivo de células, velocidad de acidificación extracelular (ECAR) es aportado por la producción de ácido láctico generado por la glucólisis. Para examinar la glucólisis aeróbica, cinco cultivos replicados biológicas de control (3 × 10
4) y cinco células DR generados de forma independiente (3 × 10
4) se sembraron en cada pocillo de la placa de cultivo XF 24 y las células se incubaron durante la noche a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2. Todos los cultivos se examinaron en los medios XFAssay en ausencia de CO
2. Nivel de ECAR se normalizó con el contenido de proteínas.
Cuantificación de Nampt, ATP y NAD
+ /NADH
niveles intracelulares Nampt se midieron usando un visfatina C-terminal (humano) EIA kit de productos farmacéuticos (Phoenix, Belmont, CA, EE.UU.). los niveles de ATP en las células se ensayó usando el kit ATP bioluminiscente somática ensayo de células (empresa FLASC, Sigma-Aldrich) y el kit de ensayo de ATP colorimétrico (Abcam, Cambridge, MA) según las instrucciones del fabricante. NAD niveles
+ /NADH se midieron utilizando NAD kit
+ ensayo /NADH (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan y Bio Sistemas de Ensayo, Hayward CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los niveles de Nampt, ATP y NAD
+ /NADH se normalizaron al contenido de proteína.
Estadísticas
Todos los ensayos se realizan en 3-6 repeticiones en al menos tres experimentos independientes. Los datos se muestran como la media ± SEM (error estándar de la media).
P
valores se determinaron mediante la comparación de los datos de experimental frente a las células de control a partir de al menos tres experimentos independientes o seis repeticiones del mismo experimento. Los medios y
p valores Opiniones de los datos experimentales se analizaron por someter los datos a los dos t-test de cola. Los datos entre más de dos grupos se accede por ANOVA de una vía con la prueba de Bonferroni para el análisis post hoc.
p
los valores inferiores a 0,05 se consideraron significativos.
p
valores se muestran como & lt; 0,05 (*), & lt; 0,005 (**) o. & Lt; 0,0005 (***)
Resultados
La generación H
2S aumenta en respuesta al estrés
a diferencia de informes previos en los que H
2S se ha medido en el lisado celular, se utilizó H
2S-electrodo sensible para medir la liberación de H
2S a partir de células intactas. Se encontró que la cantidad de H
2S liberadas de las células fue significativamente mayor que el medido en extractos celulares homogeneizados (datos no mostrados). En comparación con los niveles de H
2S liberados de 293 células y los fibroblastos, células de cáncer (HepG2, MDA-MB-231, MDA-MB-435S) produjo significativamente más H
2S (Figura 1A). Hemos sometido células de cáncer epitelial de diferentes orígenes (hígado, mama y melanocitos) a las duras condiciones que existen en el microambiente tumoral, situaciones que causan daño celular incluyendo la hipoxia (
H), la privación de glucosa (
G) y peróxido de hidrógeno (
H2O2). El H
2S generación se incrementó en las células cancerosas en respuesta a estrés agudo, tales como la hipoxia, la bleomicina, el peróxido de hidrógeno y la privación de glucosa (Figura 1B). Estrés aumento relacionado en H
2S liberado de las células de cáncer se asocia con aumento de la cistationina beta sintasa (CBS), una de las enzimas que impulsa H
producción 2S, concomitante con el aumento en el estrés y la Bax y γH2AX relacionada con la apoptosis , que es un factor crítico de la S /G
2 daños de ADN compleja puesto de control (Figura 1 C, D). Curiosamente, el estrés inducido por la elevación en H
producción 2S correlaciona con la gravedad de la lesión (Figura 1E).
(A) Cantidad de H
2S liberada por las células 293, fibroblastos (Fibro.), HepG2, MDA-MB-231 y MDA-MB-435S células. (B) Los niveles de H
2S en HepG2, células MDA-MB-435S Pc MDA-MB-231 y sometidos a hipoxia (0,5% de O
2, 18 h), la privación de glucosa (medio de glucosa libre, 18 h) o el tratamiento con bleomicina (35 nM, 18 h), H
2O
2 (800 mM, 3 h). Los datos se expresan como porcentaje de H
2S liberados de las células no tratadas. (C) intracelular CBS y Bax (panel izquierdo), evaluada por Western blot en células MDA-MB-435S Pc, Pc y células tratadas con 400 o 800 M de H
2O
2 durante 3 horas. (D) El nivel de CBS y γH2AX con o sin tratamiento con H
2O
2 (800 mM, 3 h) en células MDA-MB-435S. densidad de la proteína se normalizó utilizando β-actina. (E) La cantidad de H
2S y la viabilidad celular después del tratamiento con un rango de concentración de H
2O
2. *;
p Hotel & lt; 0,05, **;
p Hotel & lt; 0,005, ***;
p
. & Lt; 0,0005
El aumento de la generación de H
2S en dañan las células recuperadas aumenta la tolerancia a los daños
El esquema muestra en la Figura 2A el método que se utilizó para generar el daño recuperó células cancerosas. Dentro de las 24 horas después del daño, pocas células viables permanecieron unidos a los frasco de cultivo, mientras que la mayoría de las células desprendidas de la superficie de cultivo. células desprendidas dañados exhiben un alto nivel de H
2S puede limitar la lesión y pueden mejorar el potencial de supervivencia (Figura S1). Para eliminar las células mitóticas, cultivamos células en nuevos recipientes de cultivo de 24 hr. Para aislar las células dañadas que no se unió a recipientes de cultivo, pero tenía el potencial para recuperarse del daño, transferimos células a nuevos recipientes de cultivo flotante para permitir que las células que se recuperan de los daños para unirse a los sustratos de cultivo. pasajes semanales en serie de células flotando a nuevos recipientes de cultivo permitió el aislamiento de células con daño diferente tiempo de recuperación se recuperó. A lo largo de este documento, nos referimos a estas células como células de daños-recuperados (DR) con el tiempo de recuperación indicada de uno (DR
W1), dos (DR
W2) o tres semanas (DR
W3) de daño, mientras nos referimos a las células de control parental como Pc células (Figura 2A). Este método nos permitió separar tres poblaciones de células que reflejan la cantidad de tiempo necesario para la recuperación. Con el fin de evaluar si las células DR aislados recuperados de los daños, se analizó la expresión de la molécula pro-apoptótica Bax. células DR mostró una disminución en la expresión de Bax en una manera dependiente de tiempo de recuperación como una indicación de la reparación, mientras que como se predijo, las células PC expuestos a H
2O
2 durante 3 horas (daño agudo) expresaron un alto nivel de Bax (Figura 2B). Además, las células de cáncer recuperados de daño también mostraron un aumento de la producción de H
2S, en comparación con las células PC no dañadas de una manera dependiente del tiempo de recuperación (Figura 2C, D). Dado que el sulfuro de hidrógeno endógena es generado por tres enzimas, CBS, CTH y el MST, se examinaron los niveles de ARNm y proteínas de estas enzimas en las células PC y DR. Como se muestra en la Figura 2E, los niveles de mRNA de CBS y CTH aumentaron en las células DR también en una manera dependiente de tiempo de recuperación. Sin embargo, el MST estuvo ausente en las células PC o DR. En comparación con las células PC no dañadas de los padres, las células cancerosas recuperados de daños habían aumentado proteínas CBS y CTH en correlación directa con el período de recuperación. Entre las células DR, esas células con un mayor tiempo de recuperación de los daños muestran el mayor regulación de la CBS y CTH (Figura 2F). CBS se reguló arriba hasta 2 veces después de la recuperación de los daños inducidos por la privación de glucosa, la hipoxia y peróxido de hidrógeno (Figura 2G). En comparación con las células PC, las células DR generando mayores niveles de H
2S tenían una tasa de proliferación superior y mostraron un nivel más alto de tolerancia al daño inducido por bleomicina (Figura 2H, I). Estos hallazgos muestran que en las células recuperadas de daños, H
2S producción podría desempeñar un papel en su mayor tolerancia a los daños.
(A) Un esquema para el aislamiento de las células de daños-Recuperado (DR). (B) la expresión de Bax en H
2
tratadas
células HepG2 W3 H2O2 H2O2 W2 y DR Pc, DR
H2O2 W1, DR
2O. (C) Cantidad de H
2S liberados por DR
H2O2 W1, DR
células HepG2 W3 H2O2 H2O2 W2 y DR. Importancia entre el PC y tres células DR fue
p Hotel & lt; 0,0005 en el análisis estadístico ANOVA. (D) H
2S tinción de Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 y DR
células HepG2 con H2O2 W3 5 M H
2S sonda fluorescente, HSN2. Las barras de escala, 50 m. análisis (E) por PCR de
CBS
,
CTH
y
MTS
genes en Pc, DR
H2O2 W1 y DR
H2O2 células HepG2 W3. (F) Western blot de CBS y CTH en Pc, DR
células HepG2 W3 H2O2 H2O2 W1, DR
H2O2 W2 y DR. (G) Western blot de CBS en PC y DR
H2O2 W1, DR
G células HepG2 W1 W1 y H DR. (H) proliferación de las células HepG2 se recuperó de células H
2O
2, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 como un porcentaje de la de las células PC. (I) La viabilidad de Pc, DR
células H2O2 W1 y DR
H2O2 W2 HepG2 con y sin tratamiento con bleomicina. *;
p Hotel & lt; 0,05, **;
p Hotel & lt; 0,005, ***;
p
. & Lt; 0,0005
DR células presentan una mayor glucólisis y la bioenergética celular mejoradas
Dado que las células que se dividen rápidamente adoptan la glucólisis aeróbica para promover un aumento de la biomasa seguido por celular división, se analizó el nivel de intermedios clave glicolítico y enzimas en células recuperadas de los daños. células DR mostraron una elevada tasa extracelular acidificación (ECAR), que es un indicador del nivel de la glucólisis (Figura 3A). células DR generando niveles altos de H
2S tenían un mejor perfil bioenergético como se evidencia por el aumento de nivel de ATP celular (Figura 3B)
.
(A) ECAR en células HepG2 Pc tratados con o sin 800 mM de H
células 2O
2 y DR
H2O2 W2 HepG2. (B) los niveles de ATP en Pc, DR
células HepG2 W3 H2O2 H2O2 W2 y DR
H2O2 W1, DR. Importancia entre el PC y tres células DR fue
p Hotel & lt; 0,005 en el análisis estadístico ANOVA. (C) NAD
+ niveles en Pc HepG2 (con o sin H
2O
2), DR
H2O2 W1, DR
células H2O2 W3 HepG2 H2O2 W2 y DR. NAD
+ se normalizó al nivel de proteína total. Importancia entre el PC y no las células DR fue
p Hotel & lt; 0,005 en el análisis estadístico ANOVA. (D) NAD
+ niveles en PC y DR
H células HepG2 W1. (E) Western blot de Nampt intracelular y CBS en PC y DR
H2O2 MDA-MB-231 células. niveles (F) Nampt evaluados por ELISA en Pc, DR
células HepG2 W3 H2O2 H2O2 W1, DR
H2O2 W2 y DR. Importancia entre el PC y tres células DR fue
p Hotel & lt; 0,05 en el análisis estadístico ANOVA. (G) La correlación entre la expresión y la producción de Nampt H
2S y el nivel de ATP en Pc, DR
H2O2 W1, DR
células HepG2 W3 H2O2 H2O2 W2 y DR. Importancia de H
2S y Nampt fue
p Hotel & lt; 0,05, y el significado de ATP y Nampt fue
p Hotel & lt; 0,05 en el análisis estadístico ANOVA. *;
p Hotel & lt; 0,05, **;
p Hotel & lt; 0,005, ***;
p
. & Lt; 0,0005
Con el fin de abordar si la supresión de la glucólisis atenúa H
producción 2S, medimos H
2S nivel en las células DR tratado con HK1 inhibidor, 100 mM de ácido bromopirúvico, o inhibidores de la LDH-A, de oxamato de sodio 1 mM, durante 15 horas. Como se muestra en la Figura S2, no hubo diferencia estadísticamente significativa en el nivel de H
2S después del tratamiento con ácido bromopirúvico o oxamato de sodio, mientras que, como se esperaba, la actividad glucolítica se redujo sustancialmente por ambos inhibidores. Estos datos indican que las enzimas glucolíticas no regulan H
Circuito de 2S-Nampt.
Las células se recuperaron de daños en gran medida basado en la glucólisis que el aumento de la demanda de NADH /NAD
+. Por lo tanto, como una medida del estado bioenergético, se evaluaron los niveles de NAD
+ y NADH. Aunque el daño agudo condujo a una disminución en el nivel de NAD
+, NAD
+ fue significativamente mayor en las células cancerosas que se recuperaron de daño inducido por H
2O
2 y la hipoxia (Figura 3C, D La figura S3). forma reducida de NAD
+, NADH, fue significativamente mayor en las células DR (figura S4).
Nampt, que se requiere para NAD
+ ruta de recuperación sintético [24], fue significativamente mayor en recuperación de las células DR y este incremento coincidió con la sobre regulación de H
2S generar CBS (Figura 3E). Las células DR con mayor tiempo de recuperación de los daños que mostraron el mayor incremento en Nampt (Figura 3F). Por otra parte, se encontró que los niveles de Nampt correlacionados tanto con el nivel de H
2S liberadas de las células (R
2 = 0,9,
p Hotel & lt; 0,05) y el nivel intracelular de ATP (R
2 = 0,94,
p
. & lt; 0,05) (Figura 3G)
en conjunto, estos resultados muestran que las células cancerosas se recuperaron de daños generan un alto nivel de H
2S y Nampt, y que dependen en gran medida de la producción de H
2S y la glucólisis aeróbica para su metabolismo eficiente.
H
2S, en una forma dependiente de la dosis, hasta regula Nampt, aumenta glucólisis aeróbica y proporciona citoprotección
a fin de evaluar la importancia de H
2S en la adquisición de nuevas características metabólicas, las células PC fueron tratados con H
2S donante, NaHS. Al igual que en nuestras observaciones en las células DR (Figura 3A), el tratamiento con NaHS ECAR de una manera dependiente de la dosis mejoradas, aumento de ATP y NAD
+ de salida y dio lugar a aumento significativo en el nivel de Nampt (Figura 4A-F). De acuerdo con informes anteriores que muestran que H
2S proporciona citoprotección [8], [26], las células PC pre-tratados con NaHS exhiben una mayor resistencia al daño inducido por peróxido de hidrógeno o bleomicina (Figura 4G).
(a) ECAR en las células HepG2 Pc tratados durante 48 horas con 0, 1, y 100 M de NaHS y DR
H células HepG2 W1. (B) Comparación de los niveles de ATP en las células PC HepG2 tratadas durante 48 horas con 0, 10 y 100 mM de NaHS, DR
células H2O2 W1 HepG2 y PC células MDA-MB-231 tratadas durante 48 horas con 0, 10 y 100 mM de NaHS. Los datos se expresan como un porcentaje del nivel de ATP en las células no tratadas. (C) Los niveles de NAD
+ en las células HepG2 y MDA-MB-231 Pc tratados con 0, 10, y 100 mM de NaHS para 48 hr. (D) Análisis de transferencia Western de intracelular Nampt en células MDA-MB-231 Pc tratados por 48 h con 0 y 100 mM de NaHS. análisis (E) qPCR de
NAMPT
expresión en células HepG2 Pc tratados durante 48 horas con 0 y 100 M de NaHS. (F) La cuantificación de intracelular Nampt por ELISA en células HepG2 Pc tratada durante 48 horas con 0, 10 y 100 mM de NaHS. (G) La viabilidad en las células HepG2 pre-tratada durante 24 horas con 0, 1, y 10 mM de NaHS y después se sometió a H
2O
2 (800 mM) o de bleomicina (35 nM, 18 h). La viabilidad se evaluó mediante exclusión con azul de tripano. *;
p Hotel & lt; 0,05, **;
p Hotel & lt; 0,005, ***;
p
. & Lt; 0,0005
En conjunto, nuestros resultados muestran que la sobre regulación de H
2S y Nampt que conducen a la glucólisis y bioenergéticos cambios son mecanismos importantes en el desarrollo de resistencia a los medicamentos y la supervivencia de las células cancerosas.
H
vía 2S-Nampt regula la bioenergética en las células DR
Para estudiar con más detalle la relación entre
producción 2S, células DR Nampt y H fueron tratados con un inhibidor de la Nampt, FK866. El tratamiento de las células con 200 nM de FK866 no afectó la viabilidad celular que indica la ausencia de citotoxicidad FK866 a esta dosis en HepG2 (Figura S5). Represión de Nampt por su inhibidor, FK866, así como la inhibición de la CTH por D, L-propargilglicina (PAG), condujo a la disminución de H
producción 2S (Figura 5A). De acuerdo con un cambio en H
producción 2S, la expresión tanto de CBS y CTH fue atenuada por tratamiento de células con FK866 (Figura 5B, C). El nivel de ATP también se redujo significativamente por el tratamiento de las células DR con PAG y FK866 (Figura 5D, E). Esta reducción de ATP fue consistente con estudios previos que muestran que la inhibición de la Nampt por FK866 suprime la producción de ATP en células de cáncer de ovario [27]. Curiosamente, el tratamiento de las células DR con inhibidor de la CBS (CHH) e inhibidor de la CTH (PAG) redujo Nampt (Figura 5F). Estos datos sugieren que Nampt puede funcionar como un estimulador de la H
2S-producting enzimas y con ello la producción de H
2S, mientras que H
2S causa la sobre regulación de Nampt.
(A ) Cantidad de H
2S liberados de DR
H células HepG2 W1 tratados con inhibidor de CTH, PAG (100 mM, 18 horas), y el inhibidor de Nampt, FK866 (200 nM, 24 h). (B) Análisis de transferencia Western de CBS en las células DR en la ausencia y presencia de FK866 (200 nM, 24 h). (C) Análisis de transferencia Western de CTH en las células DR en la ausencia y presencia de FK866 (200 nM, 24 h). (D) los niveles de ATP en RD
H2O2 células HepG2 W3 en ausencia (-) y presencia (+) de PAG (100 m, 18 hr). los niveles de (E) ATP en Pc, DR
H2O2 W2 y DR
H2O2 células HepG2 W3 en ausencia y presencia de FK866 (200 nm, 24 h). (F) Western blot de Nampt en RD
H2O2 W2 y DR
células H2O2 W3 HepG2 tratadas con el inhibidor de la CBS, CHH (500 mM, 18 horas) o un inhibidor de la CTH, PAG (100 mM, 18 h). *;
p Hotel & lt; 0,05, **;
p Hotel & lt; 0,005, ***;
p
. & Lt; 0,0005
En conjunto, nuestros resultados muestran que la sobre regulación de H
2S y Nampt y su diafonía mejorar la eficiencia bioenergética y facilitar la recuperación de los daños.
La acumulación de H
2S conduce a una mayor glucólisis, mejores bioenergética y el aumento de la proliferación de células cancerosas daños recuperó aislados de
in vivo
tumores que crecen
para identificar si las células similar a
in vitro
existen células DR generados o se pueden generar en los tumores, las células cancerosas epiteliales se inocularon en ratones desnudos atímicos. Se aislaron las células cancerosas viables (T
V) y (T
DR) dañan las células recuperado, tal como se describe en nuestro estudio anterior [23]. T
DR células aisladas a partir de
in vivo
tumores generados mostraron la acumulación de H
2S, así como una mayor expresión de la CBS y CTH (Figura 6 A, B). Similar a
in vitro
de datos, los niveles de NAD
+ y Nampt se incrementaron en T
DR células en comparación con los niveles detectados en Pc y T
células V (Figura 6C, RE). ECAR se incrementó en T
células DR y estas células mostraron un mejor perfil bioenergético como se evidencia por el aumento de nivel de ATP y una tasa de proliferación superior (Figura 6E-G).
(A) H
2S niveles de T
V y células T DR
aislados de tumores HepG2 cultivadas
in vivo
. (B) Expresión de CBS y CTH en T
V y células T DR
. (C) NAD
+ niveles en T
V y T
DR células aisladas de tumores HepG2 cultivadas
in vivo
. (D) los niveles Nampt en T
V y T
DR células aisladas de tumores HepG2 cultivadas
in vivo
. (E) en el CERA T
V y T
DR células aisladas de tumores HepG2 cultivadas
in vivo
expresa como el porcentaje del nivel de ECAR en Pc. (F) nivel de ATP en las células tumorales viables (T
V) aislado de tumores HepG2 cultivadas
in vivo
expresan como el porcentaje del nivel de ATP en Pc. (G) la proliferación de T
V y las células DR T
aisladas de tumores HepG2 cultiva
in vivo
expresado como el porcentaje de la proliferación de Pc. Las células se sembraron a una concentración de 2 × 10
4 y se evaluó el número total de células después de 24 y 48 horas de cultivo. (H) Un esquema para H
circuito bioenergético dependiente 2S-Nampt. El daño celular conduce a un aumento de H
2S y Nampt que coordinadamente conducen a cambios metabólicos. Estas células presentan un crecimiento exponencial y la tolerancia a los daños. *;
p Hotel & lt; 0,05, **;
p Hotel & lt; 0,005, ***;
p
. & Lt; 0,0005
Sobre la base de estos resultados, proponemos un esquema mediante el cual las células cancerosas se recuperaron de daños cambiar su perfil metabólico a través de la regulación de H
2S vía Nampt (Figura 6H). Por lo tanto, H
circuito energético dependiente 2S-Nampt es un regulador crítico de la tolerancia al estrés, aumento de la glucólisis, la mejora de la bioenergética y el aumento de la proliferación celular.
Discusión
La producción endógena de H
2S está altamente aumentada en células de cáncer colorrectal y de próstata epiteliales, y en las células endoteliales derivadas de tumores [28], [29]. En línea con esta evidencia, se muestra que las células cancerosas epiteliales (hígado, mama, piel) producen de forma innata grandes cantidades de sulfuro de hidrógeno independientemente de su origen. H
2S se incrementa aún más en las células cancerosas a un daño agudo inducido por la hipoxia, peróxido de hidrógeno y bleomicina, o después de la recuperación de los daños como resultado de una mayor expresión de H
2S productoras de enzimas,
CBS
y
CTH
.