Extracto
proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) posee una variedad de funciones fisiológicas y de desarrollo y también es conocido para facilitar la progresión de muchos cánceres comunes, en particular su invasión esquelético, principalmente por el aumento de la resorción ósea. El propósito de este estudio fue determinar si la PTHrP podría promover epitelial a mesenquimal transición (EMT), un proceso implicado en células madre de cáncer que es críticamente implicados en la invasión del cáncer y la metástasis. EMT se observó en DU 145 células de cáncer de próstata de forma estable sobreexpresan o bien el 1-141 o 1-173 isoforma de la PTHrP, donde no había regulación positiva de Caracol y vimentina y regulación a la baja de E-cadherina en relación con los padres DU 145. Por el contrario, el efecto contrario se observó en células de cáncer de próstata PC-3 en los que se derribado altos niveles de PTHrP mediante transducción lentiviral siRNA. Se observó aumento de la progresión del tumor en células DU 145 PTHrP que sobreexpresan mientras que disminuyó la progresión se observó en células PC-3-PTHrP desmontables. PTHrP que sobreexpresa DU 145 formado tumores más grandes cuando se implanta orthoptopically en ratones desnudos y en un caso dio lugar a la metástasis vertebral, un efecto no observado entre los ratones inyectados con células parentales DU 145. células DU 145 PTHrP que sobreexpresan también causaron la destrucción ósea significativa cuando se inyecta en las tibias de los ratones desnudos, mientras que los padres células DU 145 causó poca o ninguna destrucción del hueso. En conjunto, estos resultados sugieren que la PTHrP puede trabajar a través de EMT para promover un fenotipo agresivo y metastásico en el cáncer de próstata, una vía de importancia en las células madre de cáncer. De este modo, continuó esfuerzos por esclarecer las vías involucradas en la PTHrP EMT inducida, así como para desarrollar maneras de dirigir específicamente la señalización PTHrP pueden conducir a terapias más eficaces para el cáncer de próstata
Visto:. Ongkeko WM, Burton D, Kiang A, Abhold E, Kuo SZ, Rahimy E, et al. (2014) hormona paratiroidea relacionadas-proteína promueve la transición epitelio-mesenquimal transición en el cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (1): e85803. doi: 10.1371 /
Editor journal.pone.0085803: Seema Singh, Universidad del Sur de Alabama Mitchell Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de junio de 2013; Aceptó 2 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero, 2014
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Premio al Mérito Administración de Veteranos (LJ Deftos) apoyado este proyecto (http://www.research.va.gov/services/csrd/merit_review.cfm#.UcI2KPY-UCG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores desean declarar que aunque Robert M. Hoffman está afiliado a anticancerígenos, Inc., no hay patentes, productos en desarrollo o productos comercializados y todos los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Introducción
paratiroidea proteína relacionada con la hormona (PTHrP) posee una variedad de fisiológica y funciones de desarrollo, pero también se conoce para facilitar la progresión de muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer de próstata. Nosotros y otros han demostrado previamente que la PTHrP estimula el crecimiento celular del cáncer de próstata, invasión y metástasis, que opera a través de ambas vías /autocrinos y paracrinos intracrina [1] - [3]. PTHrP es conocida por activar una variedad de rutas mitogénicas incluyendo MAPK y PI3K /Akt, así como las vías que estimulan las metástasis óseas, uno de los trastornos que amenazan la vida más comunes asociados con el cáncer [4] - [6] .Secreted PTHrP se sabe que mediar sus efectos celulares a través de la interacción con el receptor PTH acoplado a la proteína G /PTHrP [7]. Co-expresión de PTHrP y su receptor previamente se ha identificado en los tumores primarios de cáncer de próstata y sus correspondientes metástasis óseas [8]. Además, Freemont et al han informado anteriormente de un aumento de la expresión del receptor de PTHrP en las metástasis óseas del cáncer de próstata en comparación con los tumores primarios, lo que sugiere un papel potencial de la vía mediada por el receptor en la formación de metástasis óseas [9].
epitelial-a-mesenquimal transición (EMT) es un proceso en el que las células epiteliales se someten a cambios en el citoesqueleto y morfológicos para adquirir un fenotipo mesenquimal y es importante en los procesos normales como la fibrosis [10]. Debido a sus efectos sobre la adhesión celular y EMT movilidad también es críticamente implicado en la metástasis del cáncer y la invasión [11], [12]. EMT puede caracterizarse por la pérdida de marcadores epiteliales, tales como E-cadherina y aumento de la expresión de las proteínas mesenquimales incluyendo vimentina y N-cadherina [13]. Los factores de transcripción Snail, Slug y torsión son conocidos por reprimir la expresión de E-cadherina e inducir la EMT [14] - [16]. Otras vías oncogénicas incluyendo Src, Ras, Wnt /β-catenina, PI3K /Akt, MAPK, y TGF-β han sido relacionados con EMT [17]. Múltiples estudios han demostrado que las células cancerosas se vuelven más invasivo y metastásico después de someterse a EMT. Además, EMT se ha demostrado que confieren propiedades de células madre a las células de cáncer de mama [18].
Dado que PTHrP tiene un papel en la promoción de la invasión y metástasis en el cáncer de próstata y que EMT es uno de los principales reguladores de la estas propiedades en el cáncer, la cuestión crucial es si se presenta la PTHrP es capaz de promover la EMT en las células cancerosas. PTHrP se ha demostrado que induce la EMT en algunos contextos, incluyendo durante la formación endodermo parietal y la fibrogénesis renal [19], [20], aunque la capacidad de PTHrP para regular EMT en el cáncer se ha mantenido sin investigar. En el cáncer de mama, los efectos pro-metastásicos de TGF-β, un potente inductor de EMT, se ha demostrado que estar mediada por PTHrP [21]. En su conjunto, la literatura existente sugiere que la regulación de la EMT por la PTHrP en el cáncer es altamente probable. En este estudio hemos tratado de determinar el papel de la PTHrP en la regulación de la EMT en las células del cáncer de próstata, junto con la invasión y la metástasis. El establecimiento de un papel de la PTHrP en la regulación de cáncer de metástasis ósea y EMT proporciona tanto fundamentos básicos y clínicos para elucidar el mecanismo molecular de las acciones de PTHrP en muchos cánceres comunes, como la próstata.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El VA CICUAL aprobó este estudio. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publicación Número 85-23) con el número de aseguramiento A3873-01. Los animales se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano durante la cirugía, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Estos animales se observaron de cerca, comprobado diariamente y sacrificados en los primeros signos de malestar. Los signos de malestar incluyen movimientos anormales, alimentación y abrevado de comportamientos anormales, falta de auto-aseo o cualquier otro comportamiento anormal.
Células
Los DU 145 y PC-3 líneas celulares de cáncer de próstata humano y se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en monocapa en medio RPMI 1640 (MediaTech, Herndon, VA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gemini Bio Products, Woodland, CA) a 37 ° C en una incubador humidificado con un 95% de aire, 5% de CO
2. Se seleccionó la línea celular DU 145, ya que tiene una baja expresión constitutiva y PTHrP no crece o metástasis bien en modelos de tumores de ratón, en contraste con las células PC-3 [22] - [24]. La línea celular PC-3, que fue aislado originalmente a partir de un adenocarcinoma de próstata que se había hecho metástasis al hueso, tiene un fenotipo osteolítica en los modelos de ratones inmunodeficientes [22], [25].
Construcción de plásmidos
Los plásmidos de expresión de PTHrP utilizados en este estudio eran humanos prepro PTHrP1-87, PTHrP1-141, y PTHrP1-173; las formas prepro se utilizaron para facilitar la secreción de PTHrP. Las construcciones se subclonaron direccionalmente en el vector de expresión pCI-neo (Promega, Madison, WI) y de las fidelidades de todos los plásmidos se confirmaron mediante secuenciación de ADN e inmunoensayos PTHrP específicas de sitio [23], [26].
transfección PTHrP y lentiviral mediada por el silenciamiento
Las células de la próstata DU 145 se sembraron a una densidad de 2 × 10
4 células /cm
2 en placas de cultivo celular de 12 pocillos y se transfectaron con 1 mg plásmido por pocillo. las colonias resistentes a G418 individual (800 mg G418 /ml) se aislaron 21-30 días más tarde. El medio acondicionado de las colonias de células recogidas fueron evaluados para la expresión de PTHrP mediante inmunoensayos específicos del sitio y la PTHrP que expresan las células DU145 estables se expandieron [23], [26]. Previamente se ha demostrado que la de tipo salvaje y el vector transfectadas exposición DU 145 un fenotipo similar [27], [28]. parentales células de tipo salvaje DU 145 se utilizaron por lo tanto como un control para RT-qPCR y los experimentos de invasión Matrigel, sin embargo experimentos paralelos se realizaron con un derivado de control transfectadas con vector vacío. Las células de la próstata PC-3 fueron sometidos a una caída estable de la PTHrP mediante lentiviral siRNA. Las células de control se sometieron a transducción lentiviral siRNA con un no-constructo de secuencia.
Quantitative PCR de transcripción inversa
Las células se recogieron dos días después de haber sido un pase a alrededor del 70-80% de confluencia. se recogió el lisado celular total y el ARN se extrajo usando un kit RNeasy (Qiagen). Se sintetizó ADNc utilizando Superíndice III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. En tiempo real las mezclas de reacción de PCR partiendo de alimentación SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), y se ejecutan en el 7300 en tiempo real del sistema de PCR (Applied Biosystems) usando el siguiente programa: 95 ° C durante 10 min, 95 ° C durante 30 s, y 60 ° C durante 1 min, durante 40 ciclos. Los resultados se analizaron usando el método comparativo DDCT y se realizaron curvas de fusión para asegurar la especificidad del producto. Los experimentos se realizaron por triplicado técnicas y se repitieron al menos dos veces de forma independiente. la expresión del gen GAPDH se midió como control endógeno. Los cebadores se ordenados a la medida (Eurofins GTM Operon, Huntsville, AL) utilizando las siguientes secuencias:
Caracol adelante 5'-TCTGAGTGGGTCTGGAGGTG-3 ', 5'-Caracol inversa CTCTAGGCCCTGGCTGCTAC-3', 5'-GAPDH Forward CTTCGCTCTCTGCTCCTCC 3 ', 5'-GAPDH inversa CAATACGACCAAATCCGTTG -3', E-cadherina adelante 5'-GGCGGAGAAGAGGACCAGGACT-3 ', E-cadherina inverso 5'-TGGCAGGGCGGGGAAGATACC-3', 5'-vimentina Delantero GGAAATGGCTCGTCACCTTCGT-3 ', vimentina inversa 5'-AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT-3 '.
inmunofluorescencia
Las células se trataron con tripsina y se cultivaron en cubreobjetos. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y se bloquearon en suero de cabra en tampón fosfato salino de Dulbecco a temperatura ambiente antes de la incubación con anticuerpo monoclonal de ratón para vimentina anti-humano (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las células fueron incubadas con un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con FITC anticuerpo secundario (Chemicon, Temecula, CA) y contratinción con DAPI. Por último, se utilizó el reactivo antidecoloración SlowFade Gold (Invitrogen, Carlsbad, CA) para montar la cubierta se desliza sobre portaobjetos. Se obtuvieron imágenes fluorescentes en 40X usando Leica DMIRE2 microscopio invertido de fluorescencia y programa de ordenador PCI simple se utilizó para la captura de imagen.
Matrigel Invasion Ensayo
invasión de PC3 y DU 145 células se midió usando un Matrigel ensayo de invasión (Becton Dickinson, Bedford, MA). Transwell inserciones de 8 micras de tamaño de poro se recubrieron con una concentración final de 1 mg /ml de Matrigel en DMEM libre de suero frío. Las células se trataron con tripsina, y 500 ml de suspensión de células (1 × 10
5 células /ml) se añadieron en pocillos por triplicado. La cámara inferior de la transwell se llenó con 750 l de medio de cultivo que contiene 0,5% de suero como un quimioatrayente y se dejó incubar a 37 ° C durante 48 horas. La invasión de las células en la superficie inferior que pasaron por el filtro se fijaron y tiñeron usando un cristal violeta en glutaraldehído y fotografiada. El número de los núcleos teñidos se contó en una sección predeterminada y constante de cada pocillo.
Animales
Seis meses de edad, de sexo masculino, inmunodeficiencia combinada (SCID) graves fueron alojados en una barrera sala de filtro y alimentados con Purina para roedores ad lib. Los animales fueron sangrados en el final del estudio utilizando un método de retro-orbital.
Tumor ortotópico Implantación
PTHrP-DU145 (1-173) GFP células
subconfluentes DU145 y transfectadas de manera estable fueron recién tripsinizaron, se contaron, y se colocan en hielo inmediatamente antes de la inyección. Los ratones fueron inyectados con 10 espacio 6 células subcutánea
del flanco del animal en un volumen total de 0,25 ml de suero libre de RPMI 1640. Los ratones se sacrificaron para cosechar tejido tumoral 4 semanas después de las inyecciones de células tumorales. fragmentos de tumor (1 mm
3) estaban recién preparados a partir de los tumores subcutáneos e implantados en el lóbulo lateral de la próstata de otro ratón SCID (22-24). Los 1 mm
3 fragmentos de tumor fueron disecados, medida con calibres, y se pesaron para asegurar la cantidad exacta de tumor de partida se utilizó para cada animal. La cápsula de la próstata se ha expuesto tras una incisión abdominal en la línea media inferior y se insertó un fragmento de tumor en la cápsula. A continuación, la cápsula de la próstata se cerró con una sutura quirúrgica 8-0 y la incisión en la pared abdominal se cerró con una sutura quirúrgica 6-0 en una capa [29].
Los animales se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano durante cirugía. Todos los procedimientos de la operación descrita anteriormente se realizaron con un microscopio de aumento 7 X. Los ratones fueron evaluados 60 días después de la implantación del tumor para la progresión tumoral y la metástasis por fluorometría y anormalidades esqueléticas por rayos-X. de imágenes de alta magnificación de los tumores que expresan GFP se realizó con un microscopio estereoscópico de fluorescencia Leica, modelo LZ12, equipado con una proyección de imagen lámpara de mercurio de 50 W y de todo el cuerpo se llevó a cabo en una caja de luz iluminada por la luz azul de la fibra óptica (Investigación Lightools , Encinitas, CA) y fotografiado usando una termoeléctrica enfría cámara a color CCD (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ).
intraóseos inyecciones
Para evaluar el efecto de la PTHrP en el crecimiento del cáncer de próstata en el hueso, Se utilizó un modelo intra-tibial para la metástasis del cáncer de próstata hueso (1, 24). Se estudiaron cinco tipos de GFP transfectadas establemente que expresan las células DU145: (1) de tipo salvaje, (2) vector (pCI-neo), (3) PTHrP (1-87), (4) PTHrP (1-141) y ( 5) PTHrP (1-173) células transformadas. Los ratones fueron inyectados con 10
6 células en 15 l de PBS estéril en la médula ósea de la tibia proximal derecha usando una aguja de calibre 26 y una jeringa de vidrio Hamilton. La tibia izquierda sirvió como control negativo. Los ratones fueron evaluados 60 días después de las inyecciones intra-óseos de anomalías esqueléticas por rayos X [24]. Las radiografías del esqueleto fueron expuestos a 40 keV durante 20 segundos en un gabinete de rayos X de la serie 5000 Faxitron y películas Kodak X-Omat TL se procesaron en un procesador de película Kodak. Para mayor resolución de imagen de las anormalidades en los huesos, se utilizó un GE eXplore Micro CT (GE Healthcare).
PTHrP Inmunoensayo
Los extractos celulares y los medios de comunicación PTHrP se midieron por RIA basado en PTHrP (1- 34), PTHrP (38-64), y PTHrP (109-141), como se describe anteriormente [30]. Todas las muestras se ensayaron en diluciones múltiples y por triplicado.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y las barras de error representan la desviación estándar. La significación estadística fue probada usando un muestra de dos t-test independiente (de 2 colas de prueba) con el umbral fijado en
P
. & lt; 0,05
Resultados
PTHrP sobreexpresión promueve la expresión de marcadores mesenquimales
Para estudiar la regulación de la EMT, PTHrP se sobreexpresa de forma estable en DU 145, una línea celular de cáncer de próstata con baja expresión basal PTHrP según se determinó mediante inmunoensayo (Figura 1A). Dos clones fueron creados, con una sobreexpresión de la isoforma 1 a 141 de PTHrP y la otra que sobreexpresan la isoforma 1 a 173 (Figura 1B). Ambos clones muestran marcadores de EMT, que expresan niveles notablemente más alta de las proteínas mesenquimales caracol y vimentina y menores niveles de E-cadherina en relación con los padres DU 145, según lo determinado por QRT-PCR (Figura 1B). Tras la sobreexpresión estable de larga duración PTHrP- (1-173) en el DU 145, vimentina y ARNm de caracol expresión fueron elevados por 115 y 6,82 veces, respectivamente, mientras que la expresión de E-cadherina se redujo demostrable en el año 2080 veces. Del mismo modo, la sobreexpresión estable de PTHrP- (1-141) aumentó vimentina y la expresión del ARNm de caracol en un 23,5 y 3,88 veces, respectivamente, y la disminución de la expresión de E-cadherina en 12,3 veces. Los datos se muestran con el derivado parental de tipo salvaje como control. En un experimento paralelo, las células DU 145 PTHrP que sobreexpresan demostraron una inducción de plegado 6,06 de caracol y 9,68 disminución de la expresión de E-cadherina en comparación con el vacío DU vector transfectadas 145 derivado (datos no mostrados). La inducción de la EMT es verificada por un ensayo de inmunofluorescencia. Sobreexpresiones de ambas isoformas de PTHrP demuestran una disminución de la E-cadherina con un aumento de la expresión de la proteína vimentina (Figura 1C).
A) Cuantificación de los niveles de proteína PTHrP en el control y la PTHrP que sobreexpresan DU 145 células por inmunoensayo. B) expresión de ARNm de la PTHrP y de EMT marcadores de control y células DU 145 PTHrP que sobreexpresan. C) Inmunofluorescencia imágenes que confirman la sobreexpresión de la PTHrP, la regulación al alza de la vimentina, y la regulación a la baja de E-cadherina en células DU 145 PTHrP que sobreexpresan.
PTHrP Derribo reduce la expresión de marcadores mesenquimales
Para demostrar aún más la regulación de la EMT por PTHrP en el cáncer de próstata, PTHrP permanente desmontables a través de la transducción retroviral se realizó en PC-3, una línea celular de cáncer de próstata con la expresión de alto PTHrP basal tal como se determina mediante inmunoensayo (Figura 2A). En las células PC-3-KD, la expresión de PTHrP se redujo a 15% del control PC-3 (Figura 2B), mientras que los niveles de Snail y vimentina se redujeron reguladas por 3,03 y 3,73 veces, respectivamente, y E-cadherina expresión fue elevado por 2,30 veces (Figura 2B). El cambio en la expresión de la proteína EMT se demuestra con un ensayo de inmunofluorescencia. El derribo de la PTHrP regula a la baja vimentina y regula al alza la E-cadherina, lo que confirma los datos qPCR (Figura 2C). Junto con la figura 1, estos datos sugieren que la actividad o la expresión de PTHrP promueve EMT en el cáncer de próstata.
A) Cuantificación de los niveles de proteína PTHrP en el control y la PTHrP-knockdown PC 3 células por inmunoensayo. B) expresión de ARNm de la PTHrP y de EMT marcadores de control y células PC-3-PTHrP desmontables. C) Inmunofluorescencia imágenes que confirman la sobreexpresión de la PTHrP la regulación al alza de la vimentina, y la regulación a la baja de E-cadherina en células PC-3 de control y PTHrP-caída.
PTHrP regula la invasión y la regulación al alza de la MMP-9
con el fin de establecer que la activación de PTHrP o EMT resultados en el aumento de la capacidad de invasión en nuestro sistema experimental, se realizó un ensayo de invasión de matrigel para determinar la invasividad relativa de DU-145 PTHrP (1-141), DU-145 PTHrP (1-173), y las células PC-3-KD en comparación con sus respectivos controles. DU 145-PTHrP (1-141) y DU 145-PTHrP se encontraron (1-173) las células a ser 3,0 (p & lt; 0,01) y 2,9 (p & lt; .05) veces más invasivos que las células parentales DU 145, respectivamente ( Figura 3A). Mientras tanto, se encontraron células PC-3-KD ser sólo 0,5 veces (p & lt; 0,01) como invasiva como PC-3 células parentales (Figura 3B). En un experimento paralelo, PTHrP- (1 a 141) y - (1-173) DU 145 células demostró un 2,0 (p & lt; 0,5) y 2,1 veces (p & lt; 0,05) el aumento de la invasión de matrigel en comparación con el vector del vacío transfectadas DU 145 derivado, respectivamente (datos no mostrados). Por último, se observó PTHrP sobreexpresión en DU 145 para regular al alza la expresión de MMP-9 por 17,1 y 7,10 veces en PTHrP- (1-141) y PTHrP- (1 a 173) que expresan derivados, respectivamente, mientras que caída en PC-3 downregulated MMP-9 por 25,1 veces (Figura 3C).
a) ensayo de invasión de Matrigel que muestran un aumento en la invasión de células DU145 a la sobreexpresión de cualquiera de PTHrP 1-141 o 1-173. B) ensayo de invasión de Matrigel que muestra disminución de la invasión de las células PC3 en desmontables de PTHrP. los niveles C) de mRNA de MMP-9 en células DU145 PTHrP que sobreexpresan y células PC3-PTHrP caída en relación con sus respectivos controles. * Indica p & lt; 0,05, ** indica p & lt;. .01
PTHrP promueve el crecimiento tumoral y la destrucción ósea en un archivo /intraósea modelo de ratón ortotópico
DU DU 145 y 145- (1-173) células PTHrP se transfectaron de forma estable con un plásmido de expresión de GFP y se implantaron de forma ortotópica en el lecho de próstata de ratones desnudos o directamente en el hueso, como (1) descrito anteriormente. Aunque todos los tumores de ratones formado, los implantados con DU 145-PTHrP (1-173) células formadas tumores significativamente más grandes en comparación con los inyectados con las células normales DU 145. Imágenes representativas muestran masa tumoral extensa en ratones inyectados con DU 145-PTHrP (1-173) las células en comparación con los ratones inyectados con los padres DU 145 (Figura 4A). Además, se observó metástasis en la columna vertebral en uno de los ratones inyectados con DU 145-PTHrP (1 a 173), mientras que no hay ratones inyectados con DU 145 metástasis formados (Figura 4B). DU 145 o 145 células DU-vector formado ningún tumor cuando se inyectan en ratones tibias mientras DU-145 PTHrP (1-141) o 145 DU-PTHrP (1-173) células inyectadas en ratones tibias dieron lugar a la formación de tumores, invasión y destrucción de hueso (Figura 5), lo que confirma el papel bien establecido de la PTHrP en la resorción ósea. Por último, la expresión de PTHrP en los tumores se confirmaron mediante técnicas de inmunohistoquímica (Figura 5B).
A) modelo ortotópico de ratón que muestra un ratón inyectado con células DU145-GFP. B) ratón inyectado con 145 DU-PTHrP (1-173) las células. C) La evidencia de la destrucción ósea en ratones inyectados con células 1-173) (DU-145 PTHrP. D) la metástasis de la espina dorsal en un ratón inyectado con células 1-173) (DU-145 PTHrP.
A) Imágenes UCT muestran el efecto de la sobreexpresión de la PTHrP en la destrucción ósea en un ratón intraósea de rayos X y modelo. La tibia de ratones que recibieron la PTHrP que sobreexpresan DU 145 muestra una significativa destrucción del hueso en comparación con el control. B) El tumor de próstata DU 145-GFP-PTHrP1-173 se retiró del ratón, fijadas y teñidas inmunohistoquímicamente para PTHrP utilizando un sistema de peroxidasa de rábano picante biotina-estreptavidina (producto de reacción marrón indica la expresión PTHrP).
Discusión
Hemos identificado PTHrP no sólo como un mediador crítico de la progresión tumoral en el cáncer de próstata, sino también como promotor de la EMT. Mientras que la PTHrP se ha demostrado que induce la EMT en desarrollo [10], [31], nuestra observación de que promueve EMT en el cáncer así sigue siendo un hallazgo novedoso. Este hallazgo implica que PTHrP puede tener un papel aún más importante en la progresión del cáncer que se creía anteriormente, ya que la capacidad de regular EMT implica el potencial para regular una variedad de propiedades relacionadas con la progresión del cáncer, incluyendo la invasión, metástasis, células motilidad, de adhesión celular , la angiogénesis y stemness /tumorigenicidad [11], [18], [32] - [34]. El pronóstico para el cáncer de próstata avanzado sigue siendo pobre debido a la metástasis ósea frecuente y la invasión [35], [36]. Por lo tanto, la orientación de la PTHrP puede conducir a terapias más eficaces para el cáncer de próstata.
Nuestros datos muestran que la sobreexpresión de la PTHrP en células DU 145 inducidos EMT y promovieron la invasión, la tumorigenicidad y metástasis, mientras que desmontables PTHrP en las células PC-3 inducidas efectos contrarios. Además se observó que la línea celular PC-3 tiene una alta expresión basal de PTHrP según lo determinado por PTHrP inmunoensayo y es inherentemente más metastásico e invasivo en comparación con DU 145, que tiene una baja expresión basal PTHrP. Estas observaciones plantean que PTHrP no sólo puede facilitar la metástasis mediante la promoción de la resorción ósea, pero también pueden ser un importante regulador de fenotipo agresivo en el cáncer de próstata. Se encontró que ambos 1-141 y 1-173 isoformas de PTHrP para promover EMT, en consonancia con el hecho de que el sitio activo clásica se encuentra cerca del extremo amino terminal como se muestra por estudios anteriores [37]; Sin embargo, los péptidos procesados adicionales de PTHrP también pueden ser mediadores importantes de esta acción. Orientación de todas las isoformas de la PTHrP para la terapia contra el cáncer pueden necesaria, aunque la orientación de la isoforma 1-141 puede ser de vital importancia, ya que representa la mayor parte de la expresión de PTHrP en los seres humanos.
Downstream objetivos que se activan por PTHrP incluyen Snail, AP-1, CREB, ERK1 /2, VEGF, PI3K /Akt y ciclina D1 [20], [38] - [45]. Caracol promueve la EMT a través de la represión de la transcripción directa de E-cadherina [15]. CREB aumenta la expresión de VEGF que a su vez promueve la EMT, la invasión y la angiogénesis [46], [47]. La vía PI3K /Akt es un regulador clave de la proliferación celular y también se ha demostrado que induce la EMT en una variedad de tipos de cáncer [48]. AP-1 se demostró estar implicado en EMT inducida por TGF-β [49]. La sobreexpresión de la ciclina D1 se ha demostrado que induce la invasión glioma mediante el aumento de la actividad de metaloproteinasa y la motilidad celular [50]. estudios predominantes muestran que PTHrP, TGF-β, EGF, y VEGF cooperar a través de la activación de ERK1 /2 para inducir EMT durante la fibrogénesis renal [19], y que Snail es un objetivo inmediato temprano de PTHrP en la formación endodermo parietal murino [20]. Uno o una combinación de estas vías es probable para explicar la inducción de EMT y la invasión que se observaron en nuestros experimentos, en los que se confirmó la inducción de Snail por PTHrP. Aunque se ha demostrado anteriormente que la PTHrP es capaz de regular por incremento Snail la transcripción en ausencia de la síntesis de novo de proteínas [20], no está claro si este efecto es a través de la unión directa al promotor del caracol o través de la activación de vías de señalización tales como Akt que se sabe que regulan Caracol. De cualquier manera, se necesitan más estudios para confirmar el mecanismo de la EMT inducida por la PTHrP en el cáncer de próstata.
Es posible que varias otras rutas dependen de la PTHrP para promover la EMT, la invasión y la metástasis. TGF-β, un potente inductor de EMT, se ha demostrado en el cáncer de mama para promover la expresión de PTHrP que resulta en la destrucción ósea [21]. Varias oncoproteínas Ras incluyendo, TPR-Met, Src han sido demostrado que el objetivo PTHrP y también han demostrado papeles en EMT, invasión y metástasis [51] - [53]. De particular interés sería Indian hedgehog, que se sabe que regulan la PTHrP durante temprana del hueso y el cartílago de crecimiento [54], [55]. Los miembros de la familia hedgehog son activadas de manera aberrante en una variedad de cánceres, incluyendo cáncer de próstata, se ha demostrado que promover indirectamente EMT, y se teorizado que tienen un papel en la transformación de las células madre adultas en células madre del cáncer [56] - [59] . Sería interesante determinar si Ihh se basa en el PTHrP para la inducción de la EMT y otras propiedades malignas en el cáncer.
La investigación en curso continúa para reforzar la teoría de que las células madre del cáncer son los principales impulsores de la progresión del cáncer y los determinantes clave de la respuesta terapéutica [60]. Por lo tanto, una cuestión importante a considerar es si la PTHrP puede regular las células madre del cáncer de próstata a través de una vía de EMT mediada. Como EMT se ha demostrado previamente para inducir propiedades de células madre del cáncer [18], se deduce que PTHrP debe ser potencialmente capaces de regular propiedades de células madre en el cáncer de próstata y por lo tanto puede ser una diana terapéutica valiosa para prevenir la recurrencia y la metástasis. Las células madre del cáncer de próstata han sido previamente aislado y caracterizado por un CD44
+ /CD133
+ /α2β1
hi fenotipo [61]. El trabajo futuro debe centrarse en la capacidad de PTHrP para regular este compartimiento en el cáncer de próstata.
El hallazgo de que PTHrP induce EMT mientras que promueve la invasión y el crecimiento del tumor sugiere que los tratamientos que se dirigen a PTHrP pueden ser usados en conjunción con los tratamientos convencionales para inhibir la invasión y la metástasis en el cáncer de próstata, especialmente para tumores recurrentes. Hemos proyectado previamente una biblioteca de compuestos e identificado varios que son capaces de inhibir la expresión de PTHrP y el crecimiento celular en el cáncer de pulmón [62]. Sería de gran interés clínico para extender estos resultados a cáncer de próstata y para determinar si dichos fármacos también son capaces de bloquear EMT y la invasión PTHrP inducida. Mientras tanto, los esfuerzos para caracterizar las vías implicadas en la EMT PTHrP inducida pueden conducir al esclarecimiento de un papel de la PTHrP en el desarrollo de las células madre del cáncer y para nuevas terapias que podrían mejorar significativamente el pronóstico del cáncer de próstata metastásico (1, 57).