Extracto
células epiteliales neoplásicas generan los tipos más agresivos de cáncer, como los situados en el pulmón, mama, colon, próstata y ovario. Durante las etapas avanzadas de cáncer de próstata, las células epiteliales se asocian a la aparición de los tumores independientes de andrógenos, un fenotipo apoptótico resistente que finalmente crece en exceso y promueve eventos metastásicos. Anteriormente hemos identificado y caracterizado una novela electrofisiológica Ca
2 + canal -permeable activado durante la apoptosis en la línea celular de cáncer epitelial de próstata independiente de andrógenos, LNCaP. Además, se informó por primera vez la clonación y caracterización de esta molécula similar a un canal llamado apoptosis regulada de proteínas 2 (ARP2) asociado a una afluencia letal de Ca
2 + en
Xenopus
ovocitos. En el presente estudio, las células LNCaP y las células de ovario de hámster chino (línea celular CHO) transfectadas con
arp2-
cDNA son inducidas a experimentar apoptosis que muestra un impacto importante en la viabilidad celular y la activación de las caspasas 3 y 7, en comparación con privadas de suero células cultivadas y ionomicina células tratadas. La localización subcelular de ARP2 en células CHO sometidas a la apoptosis se estudió mediante microscopía confocal. Mientras que progresa la apoptosis, ARP2 inicialmente localizada en la región peri-nuclear de las células migra con el tiempo hacia la región de la membrana plasmática. Basándose en los presentes resultados y los de nuestros estudios anteriores, se admite el hecho de que ARP2 constituye un nuevo canal de cationes. Por lo tanto, ARP2 convierte en un objetivo valioso para modular la afluencia y la concentración de calcio en el citoplasma de las células cancerosas epiteliales que muestran un fenotipo apoptótico resistente durante el inicio de un evento apoptótico
Visto:. Mas-Oliva J, Navarro -Vidal e, Tapia-Vieyra JV (2014) ARP2, una nueva proteína pro-apoptótica expresa en las células epiteliales de la próstata LNCaP y cáncer epitelial de ovario de células transformadas CHO. PLoS ONE 9 (1): e86089. doi: 10.1371 /journal.pone.0086089
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia |
Recibido: 15 Marzo, 2013; Aceptado 11 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Mas-Oliva et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el CONACyT (Grant 141.588) y DGAPA-UNAM (Grant eN-205711/2) otorgó a Jaime Mas-Oliva. Enrique Navarro-Vidal fue apoyado por becas de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, (CONACyT) (251,040). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los carcinomas que tienen su origen en las células epiteliales son el tipo más común de cáncer en adultos y completar hasta el 80-90% de todos los cánceres, incluidos los ubicados en el pulmón, mama, próstata, ovario y colon. Las células epiteliales entre otras localizaciones, se alinean las cavidades internas y forman el revestimiento de los tejidos glandulares. La glándula de la próstata se compone principalmente de células epiteliales y células estromales intersticiales que se comunican entre ellos y control, no sólo el desarrollo normal de la glándula, sino también la aparición de crecimiento neoplásico [1]. El cáncer de próstata es uno de los cánceres no cutáneos más frecuentemente diagnosticados. Las etapas iniciales de la progresión del cáncer de próstata depende de los andrógenos que aumentan la proliferación e inhiben la apoptosis. Por lo tanto, la terapia de privación de andrógenos ha sido el curso principal del tratamiento en el cáncer de próstata recurrente o metastásica. células epiteliales de próstata que son principalmente luminal incluyen una mezcla de varios tipos de células incluyendo las células basales y neuroendocrinos [2], [3], mientras que las células estromales adyacentes, compuestas de una mezcla de fibroblastos, los nervios y las células musculares lisas [2], [ ,,,0],4], [5], intervenir en el desarrollo de las células cancerosas epiteliales y afectar a su respuesta a las hormonas [6]. Durante el proceso de la carcinogénesis, aunque el número de células neuroendocrinas aumenta en las etapas más avanzadas del cáncer de próstata, las células epiteliales que representan el tipo de célula del tumor principal se encuentran en la mayor medida responsables de la proliferación celular andrógeno-insensible [7]. Estas células presentan un fenotipo resistente a la apoptosis, no sufren apoptosis en respuesta a estímulos fisiológicos [8], [9], y por lo tanto son insensibles a los agentes quimioterapéuticos convencionales [10] - [13].
Mientras tanto, cáncer epitelial de ovario se ha encontrado para ser el sexto cáncer más común en las mujeres con las tasas más altas se observa en los países del norte de Europa y los EE.UU., mientras que las tasas más bajas se encuentran en el mundo en desarrollo. Debido al hecho de que la patogénesis de cáncer de ovario epitelial es poco conocida, la detección temprana ha sido principalmente éxito y nueva terapéutica enfoques escasos. Desde también se han encontrado células de cáncer de ovario epiteliales para mostrar un fenotipo apoptosis resistente debido a la sobreexpresión de genes anti-apoptóticos tales como Bcl-2, Bcl-XL y survivina [14], el descubrimiento y la activación de nuevas vías pro-apoptóticos ha sido un enfoque importante para controlar la proliferación y el crecimiento de este tipo celular transformado [15]
apoptosis, un tipo de muerte celular programada [16] - [20]., ha demostrado ser de importancia crítica en homeostasis celular, el desarrollo embrionario y varias enfermedades tales como el cáncer [21], [22]. La apoptosis es activada por mecanismos específicos de tipo celular [16], [22], y se produce en varias etapas [19], [21], [23], [24]. La primera etapa está relacionada con los estímulos internos o externos, mientras que el segundo incluye mecanismos de transducción de señales. La tercera etapa está constituida por mecanismos de ejecución que implican la actividad proteolítica de las caspasas, una base bioquímica para el fenotipo de apoptosis [25] - [28], y por último, la cuarta etapa que corresponde a la condensación de la cromatina nuclear, la fragmentación nuclear y la fagocitosis de cuerpos apoptóticos por las células o los macrófagos [24], [29] vecina. En general, un aumento sostenido de la [Ca
2 +] i se ha demostrado que activa una serie de mecanismos citotóxicos asociados con la apoptosis en diferentes tipos de células [30], [31]. Desde apoptosis se ha propuesto como un mecanismo que regula el crecimiento de tumores, la modulación de la activación de los mecanismos de apoptosis, por tanto, ha sido considerado como un objetivo valioso para controlar la proliferación y el crecimiento de las células cancerosas epiteliales [32] - [36]. A este respecto, dependiendo de la condición de la membrana plasmática de las células transformadas y la cantidad de calcio extracelular que entra en el citoplasma, se consigue un buen equilibrio entre la aparición de un evento de apoptosis y /o la activación de una vía de la muerte necrótica [37 ], [38]
En respuesta a dos inductores diferentes de la apoptosis.; ionomicina y la privación de suero, que han demostrado previamente basado en hallazgos electrofisiológicos, la activación de un Ca
2 + canal de cationes permeables, no selectiva en las células epiteliales de la próstata LNCaP [15]. Para investigar más a fondo estos resultados, una serie de Ca
2 + se analizaron los canales -permeable expresadas durante la apoptosis [15], [39] - [41]. Durante el transcurso de estos estudios, dos ADNc,
ARP1
y
arp2
, que corresponden a dos moléculas sintetizadas durante la apoptosis inducida por privación de suero, fueron clonados. Cuando
arp2
ARNm se inyectó en
Xenopus laevis
ovocitos, la expresión se indujo ARP2 seguidos por un influjo de Ca
2 + a través de la membrana celular y la inducción de la apoptosis [40].
Teniendo en cuenta que la mayoría de las células epiteliales comparten características de organización del tejido, así como mecanismos implicados en la tumorigénesis [42], el presente estudio muestra que
arp2
cDNA transfección llevó a cabo utilizando las células de cáncer de próstata epitelial originales (línea celular LNCaP) desde el que se describe el canal de calcio pro-apoptóticos, promueve la muerte celular a través de un proceso apoptótico cuando se miden la viabilidad celular y la activación de las caspasas. Con el fin de poner en evidencia que los mecanismos de iniciación y nivel de apoptosis son compartidos por diversas células epiteliales, nuestro estudio se ha extendido a la transfección con
arp2
ADNc de células de ovario transformado epiteliales (línea celular CHO). Los resultados mostrados en el presente estudio apoyan nuestros hallazgos anteriores y sostienen la idea de que ARP2, un canal de calcio novela colocado en la membrana plasmática de las células durante un evento que pudiera comprometer la viabilidad celular y daría lugar a la apoptosis, se podría considerar como una nueva y valiosa objetivo de controlar el crecimiento de los tipos de células epiteliales del cáncer más agresivos.
Materiales y Métodos
Materiales
la línea celular de cáncer de próstata andrógeno-insensible humano, LNCaP, y el línea celular de ovario de hámster chino, CHO (
Cricetulus griseus
), se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.), en el que se verifica periódicamente mediante pruebas genotípicas y fenotípicas. líneas celulares LNCaP originales recibidos de ATCC incluyeron células andrógeno-insensible sensible a andrógenos y. Durante el transcurso de su utilización a lo largo de los años, se han presentado respuestas diferenciadas para el crecimiento en función de la presencia o la ausencia de los análogos de andrógenos. Todos los reactivos para los medios de cultivo celular se obtuvieron de Gibco BRL (Gaithersburg, MD, EE.UU.). Los vectores que se utilizaron fueron: pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), pcDNA3.1 /V5-His-TOPO
lacZ Gráficos vectoriales (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU. ), y el vector pEGFP-N1 (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.). Lipofectamina y Fura-2 /AM se recibieron de Invitrogen /Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, EE.UU.). Bis-acrilamida, Nonidet-P40, bromuro de etidio, aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), benzamidina, dimetil sulfóxido (DMSO), ionomicina y ditiotreitol (DTT) se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). r
Tth ADN polimerasa
XL se obtuvo de Roche Molecular de Sistemas (Branchburg, NJ, EE.UU.) y dNTPs desoxirribonucleótidos se obtuvieron de Boehringer Mannheim-GmbH (Mannheim, Alemania).
Construcción de plásmidos para ARP2 expresión
para la amplificación de
arp2
cDNA, 20 picomolar de un cebador sentido (5'-TGACAGTGATGCGGGAGAAGG-3 ') y un cebador degenerado antisentido que corresponde a una región conservada de la familia de Trp se utilizaron proteínas (5'-TGY-TCK-MGC-AAA-YTT-CCA-YTC-3 ') [40], [43] - [45]. Las reacciones de PCR también incluyeron 10 ng /mL linealizado pCR-TOPO-4Blunt ARP2 plásmido, 10 x tampón, MgCl 25 mM
2, y dNTPs 10 mM. Se realizaron los siguientes ciclos: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 45 s, 65 ° C durante 45 s, 72 ° C durante 2 min, y un ciclo final a 72 ° C durante 10 min. productos de PCR se separaron y se visualizaron en 1% w /v de geles de agarosa que contienen bromuro de etidio, y las bandas se escindieron y purificaron usando un sistema de extracción de gel Concert (Gibco, Gaithersburg Maryland). Los productos de PCR se clonaron en el vector de 3,1 /V5-His-TOPO pcDNA entonces propagado en
E. coli DH5a
células competentes (American Type Culture Collection, Manassas VA, EE.UU.). El plásmido obtenido se denominó pcDNA3.1 ARP2 V5-His. El ADNc que codifica para la proteína verde fluorescente (
eGFP
) se inserta a continuación, entre el
XhoI
y
XbaI
sitios de pcDNA3.1 ARP2 V5-His plásmido, generando de este modo el pcDNA3.1 ARP2-eGFP V5-His plásmido.
cultivo de células y transfecciones para la expresión transitoria
andrógenos insensible a las células LNCaP y las células CHO se cultivaron en RPMI 1640 y DMEM /F -12 medio, respectivamente. Estos medios de cultivo también se complementaron con 10% v /v de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 0,2% w /v de bicarbonato de sodio, y 1% v /v de penicilina-estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2 hasta que las células alcanzaron un 60-70% de confluencia. La apoptosis se indujo mediante la incubación de las células con medio de cultivo privado de FBS para diferentes períodos de tiempo. Ionomicina se preparó como soluciones madre 5 mM en DMSO. Ionomicina a una concentración final de 10 mM se aplicó a CHO y células LNCaP culturas y se incubó durante diferentes períodos de tiempo. Ambas líneas celulares fueron transfectadas con pcDNA3.1 arp2 V5-His (eficacia de transfección: TE /LNCaP 32%; TE /CHO 46%) y pcDNA3.1 /V5-His-TOPO
lacZ
plásmidos (TE /LNCaP 43%; TE /CHO 54%) para inducir la expresión transitoria de ARP2-V5 y β galactosidasa-V5, respectivamente. Para la normalización de los ensayos de viabilidad celular, las dos líneas celulares también fueron transfectadas con el plásmido pcDNA3.1 V5-His (sin
arp2
cDNA) (TE /LNCaP 68%; TE /CHO 80%). Las células CHO fueron transfectadas con pEGFP-N1 (TE 82%) y pcDNA3.1 ARP2-eGFP V5-His plásmidos (TE 50%) para obtener eGFP y expresión ARP2-eGFP, respectivamente. Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamine 2000 como se describe en el pcDNA3.1 /V5-His TOPO TA Kit de Expresión de inserción de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.).
[Ca
2 +] i en toda mediciones suspensiones de células con Fura-2
andrógenos insensible a las células LNCaP y las células CHO se cultivaron como se ha descrito anteriormente, tamponada con HEPES fueron retirados de las placas de cultivo usando tampón que contiene 10 mM cosecha 0,9% de solución salina más 0,05 de EDTA, pH 7,4 según Hirst et al. [46]. Las células se colocan en suspensión, y se basan en el mismo método sedimentado en 500 ×
g
en una centrífuga de baja velocidad durante 3-5 minutos y se lavaron dos veces con tampón HEPES Krebs que contiene 140 mM de Na
+, 4,7 mM de K
+, Mg 1,3 mM
2 +, Cl 125 mM
-, HCO 25 mm
3, 1,2 mM H
2 PO
de 4, 1,2 mM SO
4
2-, glucosa 10 mM, EGTA 0,1 mM y HEPES 10 mM, pH 7,4. Se retiraron los sobrenadantes y los pellets se resuspendieron con tampón de Krebs HEPES. Un tiempo de carga Fura-2 /AM (3 M) de 30 min se llevó a cabo usando tampón de Krebs HEPES a 37 ° C en la oscuridad. Después de completar este procedimiento, se sedimentaron las células a 500 ×
g
, se resuspendieron en tampón HEPES Krebs y además se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente para permitir la de-esterificación de Fura-2 /AM.
Después del tratamiento, las células se sedimentaron dos veces en 500 ×
g
durante 3 minutos y se resuspendieron en HEPES Krebs-Ca
2 + tampón (EGTA omitiendo y ha añadido mM de Ca 2,5
2 + ). Fura-2 /AM se preparó como una solución madre (1 mM) disolviendo en dimetilsulfóxido y partes alícuotas (10 l) almacenadas a -20 ° C hasta su utilización.
Las suspensiones celulares se mantuvieron en hielo y para cada experimento colocado en cubetas de cuarzo y se incubó durante 2 min a 37 ° C antes de las mediciones se llevaron a cabo. Se empleó un espectrofluorómetro SLM-Aminco (Rochester, NY) usando una relación de excitación de 340/380 valores de emisión de fluorescencia fura-2 nm y un máximo a 510 nm. La calibración de fluorescencia se llevó a cabo mediante la adición de 0,1% de Triton X-100 para producir la lisis celular liberando fura-2 en el Ca
2 + o EGTA medios que contienen. los valores máximos y mínimos de fluorescencia se sustituyen en la Grynkiewicz, Poenie & amp; ecuación para calcular Tsien [Ca
2 +] i [47].
análisis de transferencia de Western
La expresión transitoria de ARP2 y β-Gal se logró en las células LNCaP y células CHO mediante transfección con
arp2
ADNc y
lacZ
ADNc, respectivamente. Estas proteínas se expresaron como proteínas de fusión con el epítopo V5 en el terminal carboxilo de cada uno (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células se cultivaron durante 16, 24, 48, y 72 h, después se recogieron y se lisaron con el siguiente tampón: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 1 mg /ml de aprotinina, PMSF 1 mM y benzamidina 5 mM. La cuantificación de proteínas se realizó utilizando un método de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.), y 20 g de proteína total se sometieron a electroforesis en geles al 10% de SDS-PAGE. Las proteínas se sometieron a electrotransferencia posteriormente a 0,45 micras membranas de nitrocelulosa (Trans-Blot Transferencia medio de Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), y luego bloqueadas durante 1 hora a 37 ° C con una solución de "saturación" [solución salina tamponada con Tris (TBS) ( pH 7,6), 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 100 mM, 0,1% v /v de Tween-20, y 2,5% w /v de leche desnatada]. anticuerpo monoclonal anti-V5 primaria (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se diluyó en la misma solución de saturación (1:5000) y se incubaron con las membranas durante 12 horas a 4 ° C. Después las membranas se lavaron tres veces con solución de saturación a 37 ° C (15 min cada lavado), las membranas se incubaron a 37 ° C durante 2 h con anti-anticuerpo secundario del ratón (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) diluido en solución de saturación ( 1:5000). a continuación, la membrana se lavaron con TBS /0,1% v /v de Tween-20 tres veces durante 15 min a 37 ° C, seguido por un cuarto lavado con TBS a 37 ° C. La igualdad de carga fue verificada mediante la incubación de las membranas con el anticuerpo anti β-actina (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.). La visualización de la unión del anticuerpo se logró mediante un aumento de quimioluminiscencia (ECL) kit de detección (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) y la exposición de las membranas a películas radiográficas (Kodak, Rochester, NY, EE.UU.).
3- ( 4,5-dimetiltiazol-2-il) bromuro de tetrazolio -2,5-difenil (MTT) ensayo de
se mantuvieron células no tratadas en medio de cultivo suplementado con suero (control negativo), mientras que las células apoptóticas se obtuvieron por el suero privación (control positivo). Las células (2 × 10
4 /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se mantuvieron en cultivo durante 16, 24, 48 y 72 h. Después, se añadieron 30 l de solución de MTT de stock (Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.) a cada pocillo para una concentración final de 0,5 mg /ml de reactivo. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 4 h para permitir el crecimiento de cristales de formazano, que se solubilizaron posteriormente con la adición de tampón de lisis [20% de SDS, 50% de N, N-dimetilformamida (pH 3,7)]. Las placas se incubaron durante 12 h, y los valores de absorbancia se midieron a 570 nm utilizando un lector de microplacas. La viabilidad de las células transfectadas con el plásmido pcDNA3.1-V5-His se consideró para la normalización de los resultados de la viabilidad de pcDNA3.1 arp2-V5 Sus células transfectadas. Cada experimento se repitió tres veces (n). El de Student de dos colas
se utilizó t-
prueba para determinar la significación estadística de las diferencias con respecto a los controles. Los datos se expresan como media ± SEM X y
p & lt; 0,05
fue considerado significativo. Símbolos denotan:
#
p Hotel & lt; 0,05, *
p Hotel & lt; 0,01,
¶
p Hotel & lt; 0,001
Trypan azul viabilidad de las células de ensayo
células LNCaP se incubaron durante 16, 24, 48, 72, 96, y 120 h, mientras que las células CHO se incubaron durante 16, 24, 48, y 72 h. Las células se tiñeron con 0,1% v v tripano /colorante azul después se colocaron en cámaras de Neubauer. Un total de 300 células fueron contadas para cada muestra usando un microscopio óptico de campo claro Motic. La viabilidad de las células transfectadas con el plásmido pcDNA3.1-V5-His se consideró para la normalización de pcDNA3.1 ARP2 V5-His células transfectadas. Cada experimento se repitió al menos tres veces (n). El de Student de dos colas
se utilizó t-
prueba para determinar la significación estadística de las diferencias con respecto a los controles. Los datos se expresan como media ± SEM X y
p & lt; 0,05
fue considerado significativo. Símbolos denotan:
#
p Hotel & lt; 0,05, *
p Hotel & lt; 0,01,
¶
p Hotel & lt; 0,001
medir la actividad de las caspasas 3 y 7
células
CHO y LNCaP (3 × 10
5 /pocillo) se sembraron y cultivaron durante 16, 24, 48 y 72 h. Las células se lavaron con PBS, se recogieron y se sometieron a cuatro ciclos de congelación-descongelación en un tampón de lisis (HEPES 10 mM (pH 7,0), 40 mM b-glicerofosfato, NaCl 50 mM, MgCl 2 mM
2). Las muestras se centrifugaron durante 30 min a 15 800
x
g. La concentración de proteína de los sobrenadantes recogidos se determinaron utilizando el método BCA (Pierce, Rockford, IL). Las muestras (proteínas totales, 20 g) se diluyeron en tampón de ensayo (HEPES 50 mM, 10% de sacarosa, 0,1% de CHAPS, DTT 10 mM) hasta un volumen final de 1000 mL. El tampón de ensayo también se complementó con Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluorometilcumarina (Z-DEVD-AFC), un sustrato fluorogénico de las caspasas 3 y 7, y las muestras se incubaron durante 10 min a 30 DO. La fluorescencia se midió de acuerdo con un protocolo de Molecular Probes usando un espectrómetro de luminiscencia. La longitud de onda de excitación era de 365 nm y la longitud de onda de emisión fue 505 nm. Se encontró que la longitud de onda de máxima absorción, siendo 488 nm. Se midió la fluorescencia en las muestras en blanco de extracto libre de células con el fin de detectar la relación señal-ruido de las muestras. Cada experimento se repitió al menos tres veces (n). El de Student de dos colas
se utilizó t-
prueba para determinar la significación estadística de las diferencias con respecto a los controles. Los datos se expresan como media ± SEM y X
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado como significativo. Símbolos denotan:
#
p Hotel & lt; 0,05, *
p Hotel & lt; 0,01,
¶
p Hotel & lt; 0,001
la microscopía confocal y microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC)
confocal imágenes se obtuvieron usando un sistema láser de 1000 confocal de barrido espectral FV Fluoview (Olympus Corporation, Tokio, Japón) unido /interfaz con una Olympus IX81 microscopio invertido de luz con 10 × 40 × y objetivos de inmersión en aceite. eGFP se excitó a 488 nm utilizando una línea de kriptón /argón láser y fluorescencia emitida detectada entre 515 nm y 540 nm utilizando un filtro de paso de banda. el funcionamiento del láser se realizó a baja potencia (97-99% de atenuación) que redujo sustancialmente photobleaching y fotodaño a los especímenes. Imágenes de microscopía DIC se obtuvieron usando un microscopio Olympus IX81 y un condensador IX2-LWUCD con 10 × 40 × y objetivos. Confocal y DIC imágenes se visualizaron, se procesan y convierten a formato TIFF imágenes utilizando el software FV10-ASW 6.1 (Olympus).
Resultados
ARP2 expresión y la viabilidad celular en las células LNCaP
los ensayos de Western blot muestran la expresión de ARP2-V5 en las células LNCaP observada por primera vez 16 horas después de la transfección, con los más altos niveles de expresión detectados 72 h después de la transfección (Figura 1A). Este ensayo muestra bandas con pesos moleculares más bajos que el de la proteína de fusión ARP2-V5 (54 kDa) detectado 24, 48, y 72 h después de la transfección. Estas bandas son más probablemente relacionados con los productos de degradación de ARP2-V5 generados durante la apoptosis.
(A) Las transferencias Western detectó la expresión de β-gal-V5 (112 kDa) y ARP2-V5 (54 kDa) en total lisados celulares. (B) Normalizado viabilidad celular% de los controles se evaluó mediante ensayos de MTT con 2 × 10
4 células cultivadas en ausencia de suero o transfectadas con
arp2
cDNA. La viabilidad de estos dos grupos de tratamiento fueron ensayados a los 16, 24, 48 y 72 h los puntos de tiempo. (C) la viabilidad celular Normalizado% de los controles ensayó usando un método de exclusión con azul de tripano. Las células se cultivaron en ausencia de suero o transfectadas con
arp2
cDNA y se ensayaron a los 16, 24, 48, 72, 96, y 120 h puntos de tiempo. Se presentan los valores medios (n = 3, X ± SEM),
#
p Hotel & lt; 0,05, *
p Hotel & lt; 0,01,
¶
p
& lt;. 0.001 en comparación con grupos de control
Normalized viabilidad celular% de los controles de células LNCaP cultivadas en ausencia de suero, así como las células LNCaP transfectadas con
arp2
cDNA , se midió usando ensayos de MTT. Se observó la viabilidad de la célula para disminuir notablemente después de 16 h, y una disminución adicional se observó a las 72 h (Figura 1B). Una disminución ~63% en la viabilidad celular se observó en
arp2
células transfectadas con cDNA a las 72 h, lo cual es mayor en comparación con una disminución de ~ 23% en la viabilidad de las células LNCaP cultivadas en ausencia de suero. Por lo tanto, es muy probable que las células LNCaP andrógeno-insensible en ausencia de suero activan los mecanismos apoptóticos tardíamente con respecto a
Arp2
células transfectadas con cDNA. Normalizado viabilidad celular% de los controles también se evaluó mediante el método de exclusión con azul de tripano. Una leve disminución de la viabilidad se detectó en las primeras 24 h para las dos condiciones experimentales (Figura 1C). La viabilidad celular se redujo aún más para el suero privados y
arp2
células transfectadas de ADNc hasta 120 h, con una disminución de ~44% y ~42% de la viabilidad celular, respectivamente
expresión ARP2. y la viabilidad celular en las células CHO
ensayos de Western blot muestran la expresión de ARP2-V5 en células CHO detectó por primera vez en 16 horas después de la transfección, alcanzando los niveles más altos de 72 h después de la transfección. La degradación de ARP2-V5 (54 kDa) se muestra por una banda de peso molecular más bajo detectado entre 48 y 72 h después de la transfección, sugiere que el evento apoptótico también está teniendo lugar en este tipo de células de la misma manera como se indica anteriormente para las células LNCaP (Figura 2A). Es interesante señalar que el retraso en la aparición de estos productos de degradación cuando las células CHO se comparan con las células LNCaP, podría estar relacionado con el hecho de que las células CHO constituyen un modelo excelente para la expresión de proteínas heterólogas desde la degradación de proteínas se mantiene a un mínimo.
(a) transferencias de Western detectó la expresión de β-gal-V5 (112 kDa) y ARP2-V5 (54 kDa) en los lisados celulares totales. (B) Normalizado viabilidad celular% de los controles se evaluó mediante ensayos de MTT con 2 × 10
4 células cultivadas en ausencia de suero o transfectadas con
arp2
cDNA. La viabilidad de estos dos grupos de tratamiento fueron ensayados a los 16, 24, 48 y 72 h los puntos de tiempo. (C) células Normalized viabilidad% de los controles se evaluó utilizando un método de exclusión con azul de tripano. Las células se cultivaron en ausencia de suero o transfectada con
arp2
cDNA y se analizó a los 16, 24, 48, y 72 h puntos de tiempo. Se presentan los valores medios (n = 3, X ± SEM),
#
p Hotel & lt; 0,05, *
p Hotel & lt; 0,01,
¶
p
& lt;. 0.001, en comparación con grupos de control
durante ensayos de viabilidad celular que emplean la reducción de MTT, se observó una disminución constante en la viabilidad de células CHO entre 16 h y 72 h de cultivo. A las 72 h, la viabilidad disminuyó por ~44% para las células privadas de suero, mientras que la viabilidad de
arp2
células transfectadas de ADNc disminuyeron en ~51% (Figura 2B). Tripano ensayos de viabilidad celular azul no muestran cambios significativos en las células CHO observadas hasta 48 h después de la privación de suero. Sin embargo, se detectó una disminución drástica en la viabilidad después de 72 h de incubación, lo que sugiere que hasta este momento en que el evento apoptótico comenzó a afectar a la integridad de la membrana plasmática. Para
Arp2
células transfectadas con ADNc, se observó una disminución gradual en la viabilidad entre 16 y 72 h después de la transfección. Los porcentajes de células viables para ambos grupos a las 72 h fueron muy similares, con ~51% de viabilidad observada para las células privadas de suero y ~53% de viabilidad observados para
Arp2
células transfectadas con ADNc (Figura 2C). Por lo tanto, similares a las células LNCaP, el índice de muerte de las células para células CHO parece ser dependiente del nivel de expresión ARP2-V5. Es interesante señalar que en el caso de
Arp2
células transfectadas con cDNA en comparación con el suero células privadas, las diferencias obtenidas entre los dos ensayos utilizados para evaluar la viabilidad celular son probables relacionadas con el hecho de que las vías metabólicas críticos asociada a una sobrecarga de calcio intracelular y la pérdida de integridad orgánulo intracelular se ven afectados principalmente, antes de la membrana de la célula se daña.
Fura-2 de medición de libre citosólico Ca
2 + en las células LNCaP y CHO
Dado que el uso de Fura-2 para medir los cambios en el calcio intracelular usando suspensiones de células enteras ha sido uno de los procedimientos más exitosos diseñados para este propósito, las suspensiones de células LNCaP y CHO se cargaron con Fura-2 y [Ca
2 +] i medidos. Como se muestra en la Tabla 1, Fura-2 células de control cargadas expuestos a ionomicina (10 mM) en presencia de un tampón que contiene calcio, producido en un corto período de tiempo que un aumento de la i [2 + Ca
]. Curiosamente, LNCaP y CHO
Arp2
células transfectadas también mostraron un aumento en [Ca
2 +] i que demuestra una permeabilidad al calcio mejorada en comparación con el control líneas celulares. Aunque también se probaron las células incubadas en ausencia de suero bovino fetal, las fugas de Fura-2 células cargadas era importante y por lo tanto, las diferencias entre los experimentos demasiado grande para ser incluido en este conjunto de resultados.
progresión Apoptosis y la activación de las caspasas 3 y 7 en las células CHO y LNCaP
Las caspasas 3 y 7 clasificado como caspasas efectoras se activan por las caspasas 8 y 9 (también conocidos como iniciadores). Las caspasas 3 y 7 también se han demostrado para contribuir durante la apoptosis a la ruptura de sustratos tales como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. La Figura 3 muestra los niveles de actividad detectados por las caspasas 3 y 7. La línea de base representa la actividad de caspasas en las células no tratadas (control), ya que el procesamiento de las muestras se llevó casi 30 min y siempre que se detecta un cierto grado de activación de la enzima. Los datos se expresan como valores porcentuales con respecto al control positivo. Para las células CHO privadas de suero, se detectó una activación gradual de las caspasas 3 y 7 entre 24 h y 48 h, con los niveles de activación más altos que se encuentran después de 72 h de activación y las tasas de 75% por encima de los controles. Mientras
arp2
células CHO transfectadas con ADNc o ionomicina (10 M) células CHO tratadas mostraron un aumento gradual en la activación de caspasas, el incremento observado entre 24 y 72 h después de la transfección o ionomicina tratamiento fue inferior a los resultados obtenidos con células CHO incubadas en ausencia de suero en los mismos puntos de tiempo (Figura 3A). Curiosamente, la activación de caspasas en células LNCaP cultivadas en ausencia de suero,
Arp2
células transfectadas de ADNc, o ionomicina células tratadas, mostró el mismo nivel de activación, los resultados que se correlacionan bien con los datos de viabilidad anteriores. Estos resultados apoyan de nuevo el hecho de que las células LNCaP parecen ser más resistentes a la aparición de un evento de apoptosis de las células CHO (Figura 3B).
actividad caspasa se determinó usando un ensayo fluorométrico empleando Z-DEVD-AFC como un sustrato. células (A) CHO cultivadas en ausencia de suero, transfectadas con
arp2
ADNc o se incubaron con 10 mM ionomicina ensayó a 16, 24, 48 y 72 h puntos de tiempo. células (B) LNCaP cultivadas en ausencia de suero, transfectadas con
arp2
cDNA (72 h) o se incubaron con 10 mM ionomicina ensayada a 16, 24, 48 y 72 h puntos de tiempo. Se presentan los valores medios (n = 3, X ± SEM),
#
p Hotel & lt; 0,05, *
p Hotel & lt; 0,01,
¶
p
. & lt; 0,001 en comparación con los grupos control
localización subcelular
con el fin de visualizar la localización subcelular de ARP2, la expresión de una proteína de fusión marcada con eGFP-ARP2 en el línea de células CHO mediante transfección con
arp2 CD -
EGFP
ADNc y
EGFP
ADNc (control) se estudió a las 24 h post-transfección usando un lente objetivo de 10 aumentos. En comparación con e
gfp
ADNc transfectaron células CHO de control (Figura 4A),
arp2-EGFP
células transfectadas-ADNc mostraron una señal fluorescente localizada alrededor de la membrana nuclear (Figura 4C). Los mismos campos se analizaron mediante microscopía DIC (Figura 4, B y D).