Extracto
Aplicaciones
La inestabilidad microsatélite (MSI) se utiliza para detectar el cáncer colorrectal (CRC) para el síndrome de Lynch, y predecir la evolución y respuesta al tratamiento. La técnica actual para la medición de MSI requiere que el ADN de tejidos normales y neoplásicas, y no identifica con tumores específicos de reparación de ADN no coinciden defectos (MMR). Hemos probado un panel de cinco cuasi-monomorfas marcadores de repetición de mononucleótidos amplificados en una sola reacción de PCR múltiple (Pentaplex PCR) para detectar MSI.
Diseño Experimental
Se investigó una cohorte de 213 pacientes con CRC, compuesto por 114 MMR-deficiente y 99 tumores MMR-dominio. El análisis inmunohistoquímico (IHC) evaluó la expresión de MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2. estado de MSI se definió por las diferencias en el rango de variación cuasi monomórfica (QMVR) de un grupo de muestras de ADN normales, y la medición de las diferencias en las longitudes de los alelos en el ADN tumoral.
Resultados
La amplificación de 426 alelos normales permite la optimización de la QMVR en cada marcador, y eliminan el requisito de ADN de referencia adaptado para definir MSI en cada muestra. El uso de ≥2 /5 marcadores inestables como los criterios para MSI dieron como resultado una sensibilidad del 95,6% (IC del 95% = 90,1-98,1%) y un valor predictivo positivo del 100% (IC del 95% = 96,6% -100%). La detección de MSH6-deficiencia se limita el uso de todas las técnicas. Análisis de los datos con un panel de tres marcadores (BAT26, NR21 y NR27) fue comparable en sensibilidad (97,4%) y el valor predictivo positivo (96,5%) al panel de cinco marcadores. Ambos enfoques fueron superiores al enfoque estándar para la medición de MSI.
Conclusiones
Un Pentaplex optimizado (o triplex) PCR ofrece un robusto muy barato, muy sensible y específica ensayo fácil, por la identificación de MSI en el CCR
Visto:. Goel a, Nagasaka T, R Hamelin, Boland CR (2010) Un Pentaplex PCR optimizado para los cánceres de Detección de ADN reparación de apareamientos erróneos-deficiente colorrectales. PLoS ONE 5 (2): e9393. doi: 10.1371 /journal.pone.0009393
Editor: José Najbauer, City of Hope National Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Noviembre 2009; Aceptó 3 de febrero de 2010; Publicado: 24 Febrero 2010
Derechos de Autor © 2010 Goel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente trabajo fue apoyado por becas RO1 CA 72851 (a CRB) y SR1 CA 129286 (a AG y CRB) del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud, y los fondos del Instituto de Investigación de Baylor. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
inestabilidad de microsatélites (MSI), que se define como la acumulación de mutaciones de inserción-deleción en las secuencias de ADN repetitivas cortas (o '' microsatélites) es un rasgo característico de las células cancerosas con desajuste de reparación del ADN (MMR), la deficiencia [ ,,,0],1]. La inactivación de cualquiera de varios genes MMR, incluyendo
MLH1
,
MSH2
,
MSH6
y
PMS2
, puede dar lugar a MSI. Originalmente, MSI fue mostrado correlación con defectos de la línea germinal en los genes MMR en pacientes con síndrome de Lynch (LS), donde & gt; 90% del cáncer colorrectal (CCR) de los pacientes exhiben MSI [2], [3]. Más tarde se reconoció que MSI también se produce en ~ 12% de los CCR esporádicos que se producen en los pacientes que carecen de mutaciones de la línea germinal MMR, y MSI en estos pacientes es debido a silenciamiento promotor metilación inducida de la
MLH1
expresión de genes [4 ]. Determinación del estado de MSI en el CCR tiene uso clínico para la identificación de pacientes con defectos de la línea germinal que predisponen a la MMR-deficiencia. Además, el estado de MSI tiene implicaciones pronósticas y terapéuticas, porque MSI CRC típicamente tienen un mejor pronóstico, y estos cánceres son menos sensibles a la quimioterapia adyuvante basada en 5FU
Desde su descubrimiento inicial hace [5].
Más de una década , los métodos y criterios para la determinación de MSI en el CCR han evolucionado constantemente. Sin embargo, todavía hay una falta de consenso sobre la utilización de diversos análisis de MSI que son más robustos, de bajo costo y resultarían en MSI analiza que mejor representa MMR-deficiencia en los laboratorios de todo el mundo [6]. En un esfuerzo por unificar el análisis de MSI en el CCR, en 1997 un Instituto Nacional del Cáncer (NCI) taller recomendó el uso de un panel de referencia de cinco marcadores de MSI que constaba de 2 marcadores de repetición de mononucleótido (BAT26 y BAT25) y 3 marcadores de repetición del dinucleótido (D2S123, D5S346 y D17S250) [7]. En un taller NCI de seguimiento, el panel reconoció algunas de las limitaciones de los marcadores originales, debido principalmente a la inclusión de los 3 marcadores de dinucleótidos [8]. En primer lugar, se reconoció que los marcadores de repetición del dinucleótido eran más adecuados para la identificación de los tumores MSI-L, mientras que los marcadores de repetición de mononucleótidos fueron más específico y sensible para la determinación de MSI (o MSI-H) CRC [9]. En segundo lugar, debido a la naturaleza polimórfica de los marcadores dinucleótidos, estos requieren la disponibilidad de no sólo tumor pero búsqueda de ADN normal de cada individuo para interpretar los resultados de MSI. Se ha demostrado que un panel de cinco marcadores de cuasi-monomórficos de repetición de mononucleótidos en una PCR pentaplex elimina la necesidad de ADN normal de cada paciente CRC, y puede ofrecer una mejor especificidad y la sensibilidad de los marcadores de NCI de pantalla [10].
por desgracia, a pesar de sus evidentes ventajas, el enfoque MSI Pentaplex ha ganado una aceptación limitada para el cribado basado en MSI de CRC. Puede haber varias razones para esto, incluyendo la falta de comprensión clara de los aspectos técnicos y validación independiente de este ensayo. Este estudio aborda esta cuestión mediante la validación de la exactitud de los marcadores de pantalla Pentaplex en una gran serie de CRC MMR-deficientes y no deficientes mediante el análisis de los perfiles de la PCR-amplificación de cada marcador en ambos tumor y cotejo de ADN normal. En este documento, se demuestra un ensayo de PCR pentaplex altamente sensible y específica que requiere la optimización de una sola vez de cuasi monomórfica rango de variación (QMVR) para cada marcador en el ADN normal. Ofrecemos pruebas de que un optimizado Pentaplex ensayo de PCR debe ser el método preferido para la evaluación de MSI en los laboratorios clínicos y de investigación, ya que es rápido, económico, altamente sensible y específico para la detección de CRC MMR-deficientes y evita la necesidad de ADN normal de referencia.
consentimiento Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los pacientes dieron informado por escrito y el estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad de Baylor Medical Center, Dallas, EE.UU.; Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania; y el Hospital de la Universidad de Okayama, Okayama, Japón
muestras de tejido
Se recogió el ADN tumoral y la línea germinal de contrapartida de 213 pacientes diagnosticados con CRC en tres instituciones diferentes:. 1) Baylor University Medical Center, Dallas , TX, EE.UU. 2) Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania y 3) hospital de la Universidad de Okayama, Okayama, Japón. Entre esta cohorte, 114 tumores eran deficientes de MMR, e incluyeron 50 CRC con pérdida de MLH1, 48 con pérdida de MSH2 y 8 casos cada uno con la pérdida exclusiva de proteínas PMS2 o MSH6. Los 99 casos restantes eran MMR-competente.
Proteína MMR inmunohistoquímica
Se examinó la expresión de proteínas de MLH1, MSH2, PMS2, MSH6 y en 213 tejidos tumorales mediante inmunohistoquímica (IHC) tinción utilizando Dako Envision sistema-HRP kit de sistema de polímero (Dako Cytomation Inc., Carpinteria, CA). Las secciones de tejido se probaron con diluciones apropiadas de anticuerpos monoclonales de ratón contra MLH1 (clon 13271A, BD Pharmingen, San Diego, CA), MSH2 (clon FE11, Research Products Oncogene, Boston, MA), PMS2 (A37 clon, BD Pharmingen San Diego, CA), y la proteína MSH6 (clon 44, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY). Las células tumorales se puntuaron negativo para la expresión de proteínas MMR sólo si las células epiteliales en el tejido tumoral carecían de tinción nuclear, mientras que las células del estroma que rodean todavía mostraron tinción positiva.
microdisección y amplificación de ADN
Las secciones seriadas (5 m) de los tejidos normales y tumorales embebidos en parafina emparejado fijados con formalina se tiñeron de manera rutinaria, y las regiones normales y tumorales representativas fueron identificados por examen microscópico. ADN genómico se aisló de los tejidos incluidos en parafina utilizando el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) después de la separación del tumor y el tejido normal mediante microdisección manual.
Pentaplex PCR y Cuasi-monomorfa rango de variación (QMVR ) Definición
análisis
MSI se llevó a cabo utilizando los objetivos de repetición de microsatélites de cinco mononucleótidos (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 y NR-27) en un sistema de PCR pentaplex [10]. Las secuencias de cebador se han descrito anteriormente, y cada cebador sentido fue marcado con extremo con uno de los marcadores fluorescentes: FAM, HEX o NED [11]. Pentaplex PCR se realizó en un MJ Research DNA 200 multicycler (Biorad, Hercules, CA). Las condiciones de la PCR consistieron en una etapa de desnaturalización 15 min a 95 ° C, seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s, con una extensión final a 72 ° C por 10 min. Los productos de PCR amplificados se diluyeron con formamida, y se ejecutan en un capilar automatizado secuenciador de ADN Applied Biosystems 3100 electroforesis Avant. tamaños alélicas para cada uno de los marcadores se estimaron usando el software GeneMapper 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Para la determinación y validación del rango de variación cuasi monomórfica (QMVR) para cada uno de los cinco MSI marcadores, perfiles de amplificación de PCR se obtuvieron de forma individual, y se determinó el tamaño de ambos alelos para cada marcador y para cada tumor individual como se describe anteriormente [11]. A efectos de cálculo, debido a la naturaleza monomórfica de estos marcadores, se calculó el tamaño de cada alelo dos veces en muestras de homocigotos.
Determinación de las variaciones alélicas en el ADN tumoral en comparación con el ADN normal
A continuación, se investigó si la disponibilidad de hacer coincidir el ADN normal de un paciente CRC mejoraría el rendimiento de detección de la PCR en Pentaplex MMR CRC deficientes. Se calcularon las diferencias en las longitudes alélicas entre el tumor y el ADN normal para cada paciente y cada marcador MSI. En cada caso, se consideraba al alelo más corto presentes en el tumor o el ADN normal para fines de cálculo utilizando la siguiente fórmula:
(diferencia de longitud alelo) =