Extracto
Antecedentes
El virus de la eritroblastosis E26 transformación de secuencias (
ETS
) la familia de factores de transcripción consiste en un grupo altamente conservada de los genes que juegan un papel importante en la proliferación celular, la diferenciación, la migración y la invasión. translocaciones cromosómicas fusión factores ETS a los promotores de genes sensibles a los andrógenos se han encontrado en cánceres de la próstata, incluyendo las formas clínicamente más agresivos. ERG y ETV1 son las proteínas ETS más comúnmente trasladadas. La sobreexpresión de estas proteínas en células de cáncer de próstata resultados en un fenotipo más agresivo. La inhibición de la actividad de ETS por los inhibidores de molécula pequeña puede proporcionar un nuevo método para el tratamiento de cáncer de próstata.
métodos y las conclusiones
Recientemente hemos demostrado que la pequeña molécula de YK-4-279 inhibe la actividad biológica de ETV1 en células de cáncer de próstata de fusión-positivas que conducen a la disminución de la motilidad y la invasión
in vitro
. A continuación, se presentan los datos de un
in vivo-
modelo de xenoinjerto de ratón. Los ratones SCID-amarillento se implantaron subcutáneamente con la fusión positivo LNCaP-luc-M6 y tumores PC-3M-luc-C6-fusión negativo. Los animales fueron tratados con YK-4-279, y se evaluaron sus efectos sobre el crecimiento del tumor primario y la metástasis de pulmón. tratamiento YK-4-279 generado una disminución en el crecimiento del tumor primario sólo en LNCaP-luc-M6 cohorte. Cuando los tumores primarios se hicieron crecer hasta tamaños comparables, YK-4-279 metástasis tumoral inhibido a los pulmones. La expresión de genes diana ETV1 MMP7, FKBP10 y GLYATL2 se redujeron en YK-4-279 animales tratados. ETS de fusión-negativas xenoinjertos PC-3M-luc-C6 no respondieron al compuesto. Además, YK-4-279 es una molécula quiral que existe como una mezcla racémica de enantiómeros R y S. Hemos establecido que (S) -YK-4-279 es el enantiómero activo en células de cáncer de próstata.
Conclusión
Nuestros resultados demuestran que YK-4-279 es un potente inhibidor de ETV1 y inhibe tanto el crecimiento del tumor primario y la metástasis de fusión xenoinjertos de cáncer de próstata positiva. Por lo tanto, YK-4-279 o compuestos similares pueden evaluarse como una herramienta terapéutica potencial para el tratamiento de cáncer de próstata humano en diferentes etapas
Visto:. Rahim S, T Minas, Hong SH, Justvig S, H Çelik , Kont YS, et al. (2014) Una pequeña molécula inhibidora de ETV1, YK-4-279, previene el crecimiento del cáncer de próstata y metástasis en un modelo de xenoinjerto de ratón. PLoS ONE 9 (12): e114260. doi: 10.1371 /journal.pone.0114260
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de mayo de 2014; Aceptado: 5 Noviembre 2014; Publicado: 5 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Rahim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Estos experimentos fueron apoyados principalmente por una subvención del Departamento de Defensa del Programa de Investigación Dirigido por el Congreso Médico (PC111510, PI: Aykut Uren, http: //cdmrp.army.mil/). Los experimentos farmacocinéticos fueron apoyados por la analítica Farmacología Núcleo del Centro de Cáncer Sidney Kimmel en Johns Hopkins Integral (NIH subvenciones P30 CA006973 y UL1 RR025005, y el Instrumento compartido Grant (1S10RR026824-01), http://grants.nih.gov/subvenciones /oer.htm). Biacore experimentos se realizaron a la Genómica y Epigenómica compartido de recursos, que es apoyado por CA051008-16 CCSG de Grant P30 (Lou Weiner, PI), http://cancercenters.cancer.gov/grants_funding/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y los autores de este manuscrito han de competir el siguiente intereses: USPTO premiado por YK-4-279 de la Universidad de Georgetown, inventores incluyen. Y.K., M. B., J. T. y a.u. Un acuerdo de licencia se ha ejecutado entre la Universidad de Georgetown y Tokalas Inc por estas patentes, en el que J. T. es un accionista fundador. Universidad de Georgetown ha presentado solicitudes de patente sobre la YK-4279, así como compuestos relacionados y derivados de aquellas moléculas. A continuación se muestra un resumen de las solicitudes de patentes emitidas y pendientes relacionados con estos compuestos. I. "Orientación de EWS-FLI como terapia antitumoral" (GU Referencia#2006-041) 1. Solicitud Provisional de Estados Unidos (60 /877.856), presentada el 29 de diciembre de 2006. 2. PCT /US07 /089.118 presentada el 28 de diciembre de 2007 . 3. En la solicitud provisional de Estados Unidos (61 /177.932) presentada el 13 de mayo de 2009. 4. estadounidense no provisional 12 /494.191, presentada el 29 de junio de, 2009 ((CIP) que reivindica la prioridad tanto para el PCT y solicitudes provisionales de Estados Unidos; entrada en la fase nacional de PCT); expedida como Patente de Estados Unidos 8.232.310. 5. estadounidense no provisional 12 /720.616, presentada el 9 de marzo de del 2010 (CONT). 6. Europa 07.872.364,0 presentada el 28 de DICIEMBRE DE 2007 (entrada en la fase nacional del PCT). 7. Canadá 2.711.003 presentada el 28 de DICIEMBRE DE 2007 (entrada en la fase nacional del PCT). 8. Australia 2007341977 presentada el 28 de DICIEMBRE DE 2007 (entrada en la fase nacional del PCT). 9. provisional de Estados Unidos 61 /405.170, presentada el 20 de octubre de del 2010 (contiene datos adicionales). 10. Europa divisional de 13.186.704,6 07.872.364,0 Europa prioridad al 28 de diciembre de 2007. II. "Métodos y composiciones para tratar el sarcoma de Ewings familia de tumores" (GU Referencia#2012-019) 1. EE.UU. solicitud de patente provisional 61 /623.349 presentada el 12 de abril de 2012. 2. Patente del Tratado de Cooperación solicitud PCT /US2013 /036234, presentada el 11 de abril de 2013. III. "Métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer" (GU Referencia#2014-012) 1. EE.UU. solicitud de patente provisional 61 /895.308 presentada el 24 de octubre de 2013. Todos los datos en el manuscrito son de libre disposición. Los autores reconocen y siguen todas PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
reordenamiento cromosómico es un mecanismo común oncogénesis conduciendo en sarcomas y tumores hematológicos malignos [1]. Recientemente, las fusiones que implican las secuencias E26 de transformación del virus de la eritroblastosis (
ETS
) la familia de factores de transcripción se han descubierto en los tumores de cáncer de próstata [2]. El
ETS
familia de factores de transcripción es un grupo altamente conservadas de los genes que consta de 27 miembros, muchos de los cuales se ha demostrado que desempeñan un papel importante en el inicio de la enfermedad, la progresión, la diferenciación, la migración, la invasión y la angiogénesis [3] , [4]. proteínas ETS comparten una homología significativa entre sí y contienen un C-terminal
ETS
dominio que está implicado en la unión al ADN y un dominio de PNT N-terminal implicado en las interacciones proteína [5]. reordenamientos cromosómicos que implican factores de ETS en las células de cáncer de próstata que coloquen bajo la regulación directa de andrógenos promotores de genes de respuesta, activando de esta manera su expresión en respuesta a los andrógenos. A diferencia de los productos de proteína de translocaciones cromosómicas en leucemias y sarcomas, reordenamientos del gen en el cáncer de próstata no crean proteínas de fusión quiméricas. En cambio, la mayoría de las translocaciones cromosómicas y reordenamientos del gen que implican factores de ETS en consecuencia el cáncer de próstata en la expresión de una longitud completa o casi proteínas de la familia ETS de larga duración.
Los desplazamientos que implican ERG y ETV1 constituyen la mayoría de los reordenamientos del ETS se encuentran en el cáncer de próstata . Considerando ERG se fusiona predominantemente a promotor TMPRSS2, ETV1 puede reordenarse con la región 5 'de varios genes, tales como TMPRSS2, SLC45A3 y HNRPA2B1 [2], [6].
Resultados ETV1
translocación en la expresión de larga duración o ETV1 truncada N-terminal [7]. La sobreexpresión de la ETV1 en líneas celulares epiteliales resultados benigna de próstata de la inducción de un subconjunto de genes implicados en la migración y la invasión [6]. ETV1 también aumenta la expresión de los genes diana AR, así como genes implicados en la biosíntesis de esteroides y el metabolismo. La cooperación con otros eventos oncogénicos, como la pérdida de PTEN, predispone a las células prostáticas ETV1 expresar a evolucionar hacia un fenotipo más agresivo de la enfermedad [8], [9]. Los estudios en modelos murinos sugieren que la expresión ETV1 es una causa subyacente de la iniciación del cáncer de próstata. ratones transgénicos ETV1 desarrollar neoplasia intraepitelial prostática. Además, la combinación de Etv1 expresión genómica con lesiones pre-existentes, tales como la pérdida de PTEN, se traduce en el desarrollo de adenocarcinoma invasivo [10], [11].
Nos informó recientemente de que YK-4-279, un inhibidor de EWS-FLI1 oncoproteína en el sarcoma de Ewings, también inhibe la actividad de ERG y ETV1 en células de cáncer de próstata
in vitro
, lo cual reduce los fenotipos migratorias e invasivas [12], [13]. Sobre la base de nuestra anterior
in vitro
investigaciones, hemos probado la capacidad anti-metastática de YK-4-279 en un modelo de xenoinjerto de ratón. Los animales tratados con YK-4-279 habían reducido el crecimiento del tumor y la metástasis del tumor en el sitio primario a los pulmones reducida. También demuestran que los efectos de YK-4-279 en ETV1 y líneas celulares de cáncer de próstata son enantioespecıfica y enantiómero (S) -YK-4-279 es el componente activo que confirma hallazgos similares en otros modelos de tumores [14].
resultados y Discusión
YK-4-279 es una pequeña molécula antagonista de ETV1
inicialmente nos centramos en la evaluación de los efectos de YK-4-279 sobre la metástasis tumoral
In -vivo
, ya que nuestra
in-vitro
experimentos con líneas celulares de cáncer de próstata sugirieron que inhibe principalmente motilidad y la invasión [13]. Para probar la eficacia de YK-4-279
in vivo
, se utilizó un modelo de xenoinjerto de ratón [15], [16]. líneas LNCaP-luc-M6 y celulares de cáncer de próstata PC-3M-luc-C6 se generan mediante transfección estable de los padres y LNCaP células PC-3 con un vector que expresa el gen de la luciferasa. Las células se inyectaron por vía subcutánea debajo de la flanco dorsal en 8-10 semanas /ratones macho de color beige de edad SCID. Las metástasis pulmonares puede observarse tan pronto como 6-7 semanas después de la implantación del tumor en estos animales [15], [16].
previamente demostrado que la inhibición de la actividad biológica ETV1 en LNCaP células se traduce en una disminución de la invasión y la migración sin afectar el crecimiento en cultivo [13]. Las líneas celulares utilizadas en el estudio actual se adquirieron comercialmente de una fuente diferente de nuestro trabajo anterior y se sometieron a una presión selectiva para obtener luciferasa expresando clones estables. Primer lugar, validado el efecto de YK-4-279 de estas células antes de proceder a
in vivo y modelos. células LNCaP contienen una translocación genética donde se inserta todo el locus ETV1 en el último intrón de la región MIPOL1 específico de la próstata en el cromosoma 14. Se verificó la presencia de ETV1 translocación en las células LNCaP-luc-M6 por genómico PCR de ADN usando cebadores que flanquean el sitio de recombinación (Fig. 1a). ETV1 reordenación era exclusivo de las células LNCaP-M6-luc y no está presente en las células PC-3M-luc-C6. Por lo tanto, la línea celular PC-3M-luc-C6 fue seleccionado como control negativo para nuestros estudios. Se analizó
a) ADN genómico a partir de células de la próstata para el estado de ETS reordenamiento mediante la realización de PCR utilizando cebadores específicos de reordenamiento. células LNCaP-M6-luc albergaban ETV1 reordenamiento mientras que las células PC-3M-luc-C6 eran fusión-negativo. b) las células LNCaP-luc-M6 fueron tratados con 1 micra YK-4-279 durante 48 horas y ETV1 niveles de genes diana fueron evaluados por PCR en tiempo real cuantitativa. tratamiento YK-4-279 generado una disminución en la expresión de genes de MMP7, MMP13, GLYATL2 y FKBP10 sin una reducción significativa en los niveles de ETV1. *; p & lt; 0,01, n.s .; no significativo, la prueba t de Student para datos independientes. c) LNCaP-luc-M6 y PC-3M-luc-C6 fueron pre-tratadas con 1 mM YK-4-279 durante 48 horas. Un ensayo de quimiotaxis basado impedancia eléctrica se utiliza para controlar la migración de células en presencia de YK-4-279 hacia la cámara inferior con 10% de gradiente de FBS. YK-4-279 inhibe la migración de LNCaP-luc-M6 pero no las células PC-3M-luc-C6. *; p & lt; 0,005, n.s .; no significativo, la prueba t de Student para datos independientes. d) motilidades de células al final del período de 24 horas se calcularon con base en sus valores de índice de celda relativas. *; p & lt; 0,01, n.s .; no significativo, la prueba t de Student para datos independientes.
tratadas las células LNCaP-luc-M6 con una dosis sub letales (1 M) de YK-4-279 durante 48 horas y de expresión evaluada endógena ETV1 genes diana por PCR en tiempo real cuantitativa. Nos hemos centrado en objetivos conocidos ETV1 que están implicados en la patogénesis de próstata [17] - [19]. La exposición de células LNCaP-luc-M6 a 1 M YK-4-279 resultó en significativamente reducidos niveles de mRNA de varios genes diana ETV1, incluyendo MMP7, MMP13, FKBP10 y GLYATL2, sin afectar a la expresión de ETV1 (Fig. 1b).
a continuación, se realizó un ensayo de quimiotaxis basados en la impedancia eléctrica para determinar los efectos de YK-4-279 sobre la motilidad de las células LNCaP-luc-M6 y PC-3M-luc-C6. Esta técnica implica el uso de una configuración de Boyden Cámara-como con sensores microelectrónicos integradas bajo una membrana de tereftalato de polietileno microporosa (PET). Los sensores registran impedancia eléctrica como las células migran desde la cámara superior, a través de la membrana, y en la cámara inferior en respuesta a un quimioatrayente. Esta técnica permite la supervisión en tiempo real de la migración de células como el aumento de la impedancia eléctrica se correlacionan con el aumento de número de células que migraron a la cámara inferior. YK-4-279 tratamiento de las células LNCaP-luc-M6 resultó en una disminución significativa en la migración celular, mientras que se observó ningún efecto sobre la motilidad del control de línea celular negativa, PC-3M-luc-C6 (Fig. 1c y 1d). Estos resultados confirman que las células LNCaP-luc-M6 y PC-3M-luc-C6 disponibles en el mercado tienen los mismos fenotipos y YK-4-279 perfiles de respuesta como LNCaP y células PC-3 que utilizamos en nuestros estudios anteriores.
YK-4-279 inhibe el crecimiento tumoral
in vivo
YK-4-279 tratamiento experimentos se realizaron en dos formatos diferentes: 1) Los experimentos de tratamiento precoz, donde YK-4 -279 administración se inició el día después de la implantación del xenoinjerto. 2) los experimentos de tratamiento tardío, donde la administración YK-4-279 iniciada después del xenoinjertos de tumores primarios llegado a un tamaño palpable (~ 200 mm
3). Estos dos enfoques permitieron evaluar los efectos de YK-4-279 en tumores de hasta tomamos, el crecimiento y la metástasis de pulmón, tanto antes de la formación de tumores bien establecidos, así como después de la formación de tumores palpables.
establecieron próstata xenoinjertos por inyección subcutánea de células LNCaP-luc-M6 o PC-3M-luc-C6 en el flanco dorsal de ratones SCID de color beige /. En el estudio de tratamiento temprano, empezamos el tratamiento farmacológico intraperitoneal con 75 mg /kg YK-4-279 o vehículo de control el día después de la inyección de las células tumorales. Los animales fueron tratados 3 veces por semana y los volúmenes tumorales midieron semanalmente. El estudio se terminó después de 14 semanas para el grupo de LNCaP-luc-M6 y 6 semanas para el grupo PC-3M-luc-C6, debido a la tasa de crecimiento relativamente rápido de las células PC-3M-luc-C6. Mientras que sólo 4 de los 13 ratones que fueron inyectados con células por vía subcutánea LNCaP-luc-M6 y tratados con YK-4-279 desarrollaron tumores, en marcado contraste, 9 de los 13 animales en el grupo de control de vehículo tumores desarrollado. No existe tal diferencia estaba presente en la cohorte de PC-3M-luc-C6 fusión-negativo (Fig. 2). En los animales que desarrollaron tumores, hubo una reducción significativa en el tamaño del tumor en YK-4-279 grupo tratado en comparación con el control de DMSO. La reducción en el tamaño del tumor sólo estaba presente en el grupo-M6 LNCaP-luc y no observada con xenoinjertos de PC-3M-luc-C6 (Fig. 3a). Nuestra antes
in vitro
investigaciones revelaron que la inhibición ETV1 por YK-4-279 conduce a la reducción de la motilidad y la invasión sin afectar el crecimiento celular y la supervivencia. Por lo tanto, no esperábamos ver una diferencia en la captación tumoral o la tasa de crecimiento del tumor primario en estos animales. El experimento tratamiento precoz fue diseñado para medir la metástasis de pulmón, y todos los animales fueron sacrificados en el punto final predeterminado (6 semanas para PC-3M-luc-C6 y 14 semanas para LNCaP-luc-M6) para cosechar los tejidos para su posterior análisis.
xenoinjertos de próstata fueron establecidos por inyección subcutánea de células por debajo del flanco dorsal en ratones machos de 8-10 semanas de edad SCID /color beige. Los animales fueron tratados con un peso de 75 mg /kg de peso corporal YK-4-279 tres veces por semana, comenzando el día después de las inyecciones de xenoinjertos. animales-M6 LNCaP-luc tratados con el compuesto que se muestra disminuyeron la formación de tumores (4/13) en comparación con el control del vehículo (9/13). animales PC-3M-luc-C6 no mostraron diferencias significativas en la formación de tumores tratados entre el compuesto (12/13) y el control del vehículo (13/13) los animales. *; p & lt; 0,05, n.s .; no significativo, la prueba t de Student para datos independientes.
a) /SCID ratones de color beige se inyectaron por vía subcutánea con células LNCaP-luc-M6 o PC-3M-luc-C6 debajo del flanco dorsal. En el grupo de los primeros estudios de tratamiento, los animales fueron inyectados con 75 mg /kg YK-4-279 a partir del día después de la inyección de xenoinjertos. b) Otro grupo de animales comenzó a recibir tratamiento YK-4-279 vez que los tumores eran palpables (~ 200 mm
3). Estos animales se dividieron en 2 cohortes separados: un grupo se trató tres veces a la semana con 75 mg /kg YK-4-279 (tratamiento tardío estudio de baja dosis). c) Otro grupo se trató 5 veces por semana con 150 mg /kg de compuesto (tratamiento tardío estudio de alta dosis). Los volúmenes tumorales se midieron semanalmente. YK-4-279 redujo el crecimiento del tumor en los animales-M6 LNCaP-luc, pero no en animales PC-3M-luc-C6. *; p & lt; 0,01, **; p & lt; 0,001, ***; p & lt; 0,0001, n.s .; no significativo.
Los estudios de tratamiento finales comenzaron con la implantación de xenoinjerto y seguimiento cercano. Cuando los animales mostraron un tumor palpable (~ 200 mm
3), se asignaron al azar a los grupos YK-4-279 y el vehículo de control (DMSO). El punto final para el estudio de tratamiento tardío fue seleccionado como el tamaño del tumor primario llegar a 2 cm
3 en todos los grupos, de modo que la carga metastásica entre los grupos podría ser evaluado con el tamaño del tumor primario con igualdad en todos los grupos. Por otra parte, el estudio de tratamiento tardío se repitió dos veces con dos diferentes YK-4-279 dosis; 75 mg /kg YK-4-279 tres veces a la semana y 150 mg /kg YK-4-279 cinco veces a la semana.
El tumor primario de crecimiento se redujo significativamente a fines de estudio de tratamiento, así (Fig. 3b ). Esta diferencia fue mayor cuando la dosis del fármaco y la frecuencia se incrementaron (Fig. 3c). En el grupo de dosis alta, sin embargo, los animales comenzaron a mostrar signos de hiperventilación y letargo, lo que provocó una reducción de la dosis a 150 mg /kg administrada 4 días a la semana después de la semana 4 y 3 días a la semana después de la semana 8. El tratamiento farmacológico no afectó el crecimiento tasa de xenoinjertos de PC-3M-luc-C6-fusión negativa en cualquiera de las dosis.
Un grupo de muestras de tumores primarios también se evaluaron para los parámetros histopatológicos (Fig. S1). Las áreas de necrosis tumoral fueron identificados en H & amp; E manchadas diapositivas. Cantidad de la proliferación celular se determinó por inmunohistoquímica Ki67 y la cantidad de apoptosis se determinó por tinción de TUNEL. tumores LNCaP en general mostraron un aumento en la necrosis en respuesta al tratamiento YK-4-279 en el grupo de dosis alta (150 mg /kg). Del mismo modo se observó una reducción en la tinción de Ki67 en tumores LNCaP en el grupo de tratamiento. Sin embargo, estas diferencias en los tumores LNCaP no fueron estadísticamente significativas (Fig S2). No hubo una diferencia apreciable en los tumores PC3 para ninguno de los ensayos.
YK-4-279 inhibe la metástasis de pulmón en animales de xenoinjerto LNCaP-M6-luc
Hemos desarrollado un ensayo basado en células total de lisado que se aprovecharon de la expresión de la proteína luciferasa de cuantificar con precisión la metástasis de las células de cáncer de próstata a los pulmones. El ensayo implica la extracción de los lisados de proteínas de los pulmones, seguido por mediciones de luciferasa. La metástasis de las células LNCaP-luc-M6 y PC-3M-luc-C6 a los resultados pulmones puede ser demostrada en H & amp; E secciones de pulmón teñidas cuando son lo suficientemente grandes (Fig 4a.). Sin embargo, este enfoque no es cuantitativo y puede perderse micro metástasis especialmente en porciones unsectioned del órgano izquierda en el bloque de parafina. Es crucial tener un ensayo suficientemente sensible para detectar la presencia de incluso el pequeño número de células de tumor de próstata en los pulmones. Hemos construido una curva estándar mediante la combinación de diluciones en serie de luciferasa que expresan las células de cáncer de próstata que crecen en cultivo con los tejidos de pulmón de ratones sanos (Fig. 4b). Utilizando este ensayo, hemos sido capaces de detectar cantidades tan pequeñas como 1 célula por miligramo de tejido pulmonar. Considerando una masa pulmonar media de 140 mg, este ensayo tiene un límite inferior de detección de 140 células de cáncer de próstata por pulmón [20]. Dado que la expresión de la luciferasa es el principal método utilizado para cuantificar la metástasis del tumor, se realizó un
in vitro
ensayo de luciferasa, utilizando dosis de YK-4-279 que suprimen la invasión, para demostrar que el tratamiento con el compuesto de la dosis no afecta a la expresión de luciferasa en células LNCaP-luc-C6 o PC-3M-luc-C6. También se midió la expresión de luciferasa en tumores primarios extraídos de animales tratados con la dosis más alta de YK-4-279 o vehículo control. tratamiento con el compuesto no afectó la expresión de luciferasa o bien
in vitro
o
in vivo gratis (Figura S3.)
a) H & amp;. E secciones de pulmón teñidas mostrando un micro lesión -metastatic en DMSO animales tratados LNCaP-luc-M6. b) Una curva estándar fue construido para medir el límite de detección del ensayo de luciferasa. El ensayo es muy sensible, permitiendo la detección de una sola célula de cáncer de próstata por el tejido miligramo de pulmón. c) Los pulmones se recogieron de los animales de xenoinjerto de 15 minutos después de la última compuesto o tratamiento con vehículo. lisados de proteínas se obtuvieron a partir de los tejidos y se usan para llevar a cabo un ensayo de luciferasa. Los resultados fueron normalizados a peso de tejido. Compuestos tratados los animales de xenoinjertos de LNCaP-luc-M6 muestra reducida de forma significativa la metástasis de pulmón en comparación con los controles del vehículo. PC-3M-luc-C6 metástasis de pulmón no se vio afectada por el tratamiento compuesto. *; p & lt; 0,05, **; p & lt; 0,005, ***; p & lt; 0,0001, n.s .; no significativo, la prueba t de Student para datos independientes.
A continuación realizó el mismo ensayo de luciferasa en los pulmones de los animales tratados con xenoinjertos llevar YK-4-279 o vehículo de control. En los 3 experimentos (estudio de tratamiento temprano, dosis baja tarde estudio de tratamiento, la dosis alta finales de estudio de tratamiento), el tratamiento compuesto resultó en una reducción significativa en la metástasis de pulmón en LNCaP-luc-M6 animales de xenoinjerto, pero no en PC-3M-LUC- animales C6 (Fig. 4c). También usamos un ensayo basado en PCR para cuantificar la metástasis de pulmón en los fines de estudio de tratamiento de dosis alta cohorte utilizando cebadores específicos humanos para la ribonucleasa P RNA componente H1 (RPPH1) y cebadores de ratón específicos que detectan el gen del receptor de la transferrina (TFRC). Este ensayo confirmó nuestras observaciones anteriores revelando reducido significativamente la metástasis de pulmón en el YK-4-279 grupo tratado LNCaP-luc-M6 (Fig. S4) y se valida que la medición de la luciferasa en el tejido pulmonar era un método fiable. En dos experimentos (estudio de tratamiento temprano y alta dosis tarde estudio de tratamiento), los pulmones se recogieron de LNCaP-luc-M6 animales xenoinjertos que muestra reducida de tamaños de los tumores primarios en el grupo de tratamiento en el momento de la adquisición de tejidos (Fig. 3a y Fig. 3c ). Por lo tanto, es posible que las diferencias en la metástasis de pulmón pueden ser un resultado directo de volúmenes de los tumores más pequeños en grupos de tratamiento. Sin embargo, el grupo de baja dosis tarde estudio de tratamiento tenía volúmenes de los tumores primarios similares (2 cm
3) cuando los tejidos se recogieron de los animales (Fig. 3b). YK-4-279 reduce la metástasis de pulmón en estos animales, así, lo que sugiere que el tratamiento de drogas afecta a la metástasis de tumores mediante la inhibición de la actividad ETV1, independiente del tamaño del tumor primario.
también se evaluó la expresión de genes objetivo ETV1 en tumores primarios en tratamiento YK-4-279. ETV1 inhibición por YK-4-279 resultó en una reducción de la MMP-7, FKBP10 y GLYATL2 expresión, sin afectar a los niveles de expresión ETV1 (Fig. 5a y Fig. 5b). Para determinar si las diferencias en la respuesta al fármaco entre LNCaP-luc-M6 y animales PC-3M-luc-C6 es un factor de penetración en el tumor diferencial del compuesto entre las dos cohortes, se midió la concentración de YK-4-279 en el plasma y los tumores de los animales después de la última dosis de YK-4-279. ratones-M6 LNCaP-luc muestran una concentración media de 106,9 ± 64,1 mg /ml YK-4-279 en el plasma y 27,8 ± 14,5 mg /g en el tumor de un tumor: relación de plasma de 0,30 ± 0,20. animales PC-3M-luc-C6 demostraron 174,8 ± 53,5 mg /ml YK-4-279 en el plasma y 23,3 ± 12,3 mg /g en el tumor de un tumor: relación de plasma de 0,15 ± 0,10. No hubo diferencia estadísticamente significativa en la penetración de YK-4-279 entre los dos grupos cuando se compara con una prueba de chi-cuadrado.
a) Se extrajo ARN de tumores del compuesto y el vehículo tratados LNCaP-LUC- animales M6 (tratamiento tardío estudio de dosis baja) y 15 minutos después de la última inyección. niveles de expresión génica se determinó por cuantitativa en tiempo real PCR. Los resultados se normalizaron a la expresión del ARNr 18s. Los experimentos se realizaron por triplicado con 5 ratones analizados por grupo. tratamiento YK-4-279 generado una disminución en la expresión de genes de MMP7, GLYATL2 y FKBP10 sin una reducción significativa en los niveles de ETV1. *; p & lt; 0,05, n.s .; no significativo, la prueba t de Student para datos independientes. b) los niveles de expresión del gen diana en ETV1 grupo de dosis alta finales de estudio de tratamiento. *; p & lt; 0,05, n.s .; no significativo, la prueba t de Student para datos independientes.
enantioespecıfica efectos de YK-4-279
YK-4-279 tiene un centro quiral y el compuesto racémico se puede separar en su constituyente enantiómeros R y S por cromatografía líquida de alta presión (HPLC), o cada enantiómero se pueden sintetizar de forma individual. En los modelos de sarcoma de Ewing, el enantiómero S se ha establecido como el componente activo que inhibe EWS-FLI1, mientras que el enantiómero R no tiene prácticamente ninguna actividad específica [14], [21]. Hemos probado si el mismo fenómeno es cierto para la inhibición de la ETV1 en células de cáncer de próstata. Se llevaron a cabo resonancia de plasmón superficial (SPR) experimentos para determinar la unión de YK-4-279 racémico y cada enantiómero individual a ETV1. Los compuestos se inyectaron sobre una superficie de chip de Biacore que contiene ETV1 recombinante. Racémica YK-4-279 y el enantiómero S unido a ETV1 mientras que el enantiómero R mostraron una débil unión a ETV1 (Fig. 6a). A continuación, evaluaron YK-4-279 por su efecto sobre la actividad transcripcional ETV1 utilizando un constructo indicador de luciferasa transfectadas transitoriamente, que contiene una región promotora mínima Id2 con dos sitios de unión para ETV1. La co-transfección de ETV1 y reportero Id2 en células COS-7 dio lugar a un aumento en la actividad de luciferasa. La actividad del promotor se redujo mediante el tratamiento de las células con YK-4-279 racémica y (S) -YK-4-279. Sin embargo, (R) -YK-4-279 no inhibió la actividad transcripcional ETV1 (Fig. 6b).
a) racémico YK-4-279, (R) -YK-4-279 y (S ) -YK-4-279 se inyectaron sobre una superficie de chip de Biacore que contiene ETV1 recombinante. Racémica YK-4-279 y el enantiómero S unido a ETV1 mientras que el enantiómero R tenían una afinidad de unión inferior a ETV1. b) Un ensayo de luciferasa se realizó en células COS-7 transfectadas con co-ETV1 y un constructo informador de luciferasa Id-2. Id-2 la actividad del promotor se redujo tras el tratamiento con YK-4-279 racémica y (S) -YK-4-279. *; p & lt; 0,0005, n.s .; no significativo, la prueba t de Student para datos independientes.
discriminación quiral entre enantiómeros es una característica importante de muchas drogas como las moléculas, como enantiómeros individuales activas pueden proporcionar una mayor selectividad por sus dianas biológicas, mejorar el índice terapéutico, y mostrar mejor farmacocinética que la mezcla racémica [22]. También puede reducir la dosis total del fármaco y disminuir las interacciones medicamentosas y los efectos secundarios tóxicos. Al presentar un nuevo medicamento para su aprobación, la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA) exige a los promotores para justificar la opción de utilizar una mezcla racémica sobre las formulaciones de un solo enantiómero.
En nuestro
in vivo
experimentos, la inhibición del crecimiento del tumor LNCaP-luc-M6 fue mayor a 150 mg /kg YK-4-279 en comparación con 75 mg /kg. Sin embargo, los animales que recibieron una dosis más alta de drogas no podían ser tratados durante más de 10-12 semanas debido a la manifestación de tumores necróticos, que requiere que los animales que ser sacrificados. Por lo tanto, además de la inhibición de la metástasis, YK-4-279 puede tener un efecto directo sobre la proliferación en células de cáncer de próstata ETS-positivo. El único inconveniente de tratamiento de animales con dosis más altas de YK-4-279 fue la aparición de síntomas de toxicidad de drogas que se inició a las 4 semanas. En este estudio, hemos conseguido los síntomas por la disminución de la frecuencia de tratamiento de drogas, lo que permite a los animales más tiempo de recuperación entre las inyecciones. Sin embargo, con el fin de mover este compuesto en la clínica, se necesita más investigación para mejorar la
vivo en-
eficacia y tratar los síntomas que se presentan en dosis más altas. Actualmente estamos explorando diversos regímenes de dosis y formulaciones para encontrar el escenario ideal de tratamiento que maximiza los efectos sobre la diana y reducir al mínimo efectos tóxicos del fármaco fuera de objetivo. Debido a su estructura hidrófoba, la biodisponibilidad de YK-4-279 es sólo el 2% -15% cuando se administra a ratones por sonda oral [14]. Además, recientes experimentos farmacocinéticos en nuestro laboratorio han demostrado que las administraciones intra-peritoneal de 75 mg /kg YK-4-279 inicialmente conduce a un fuerte aumento en las concentraciones plasmáticas, sino que se elimina sustancialmente dando lugar a ~ 1 M niveles por 2 horas [ ,,,0],14]. Las propiedades farmacocinéticas de YK-4-279, junto con la incapacidad para administrar una dosis alta sostenibles en el tiempo a través de inyecciones en bolo sugiere la necesidad de desarrollar un modelo de infusión continua para garantizar la administración de fármacos adecuados. Hemos probado este paradigma en el modelo de xenoinjerto de sarcoma de Ewing en un ratas desnudas. Estos animales reciben la infusión continua del fármaco a través de un catéter venoso central y muestran una mejor respuesta al tratamiento YK-4-279 de inyecciones diarias intra-peritoneal o intra-venosa [21]. Además la combinación de mediciones farmacocinéticas,
in vivo
modelado y estudios de laboratorio nos permitirá crear una formulación óptima de administración de fármacos que es adecuado para su uso clínico. Además, la validación exitosa de (S) -YK-4-279 como el componente activo de YK-4-279 puede permitir dosis de tratamiento reducido drásticamente
in vivo.
Un creciente de la evidencia sugiere que las fusiones ETS funcionan de forma concomitante con otras alteraciones genómicas en el inicio y mantenimiento de los tumores malignos de próstata. sobreexpresión específico de la próstata andrógeno-inducible de ETV1 en ratones transgénicos induce neoplasia intraepitelial prostática (PIN), pero no conduce a la formación de carcinoma. Cruzando estos ratones transgénicos en una PTEN
+/- de fondo o vía constitutivamente activa PI3K específico de la próstata /Akt induce carcinoma invasivo dentro de los 6 meses, lo que sugiere que las translocaciones ETS cooperan con otras lesiones genéticas para inducir el cáncer de próstata en seres humanos [10 ], [11]. Hallazgos recientes han identificado también poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), una proteína clave de reparación del ADN, para interactuar con los factores de ETS de una manera independiente del ADN [23]. PARP1 se demuestra que es importante para la función de la proteína ETS, y la inhibición de la tumorigénesis mediada PARP1 deteriora ETS y la invasión celular. Los inhibidores de PARP y la vía PI3K /Akt como olaparib, rucaparib, perifosine, y la miltefosina se encuentran en un estado avanzado de ensayos clínicos [24] - [26]. Una ventaja importante clínica de estos hallazgos es la posibilidad de combinar YK-4-279 con otros fármacos para conseguir una respuesta más robusta y sinérgica, la apertura de un amplio espectro de nuevas estrategias para tratar los factores de ETS.
Los factores de transcripción tienen **;