Extracto
inmunoterapia activa para el cáncer es una estrategia prometedora novela, con el basado en células primera vacuna de células dendríticas (DC) lograr la aprobación regulatoria para el uso clínico del año pasado. Manufacturero sigue siendo difícil, especialmente para las vacunas de CD, y la posibilidad de utilizar la inmunoterapia basada en células en el tratamiento adyuvante o en combinación con la quimioterapia sigue siendo en gran medida sin probar. Aquí, se utilizó un enfoque de oncología comparativa para poner a prueba la seguridad y la eficacia potencial de, células B CD40 activado ARN cargado tumorales en los perros de propiedad privada que se presentan con linfoma no Hodgkin (NHL), un escenario clínico que representa no sólo un problema importante en la medicina veterinaria, sino también un modelo animal espontánea de buena fe de la condición humana. Cuando se administra a los perros de la NHL en remisión después de la quimioterapia de inducción, las células CD40-B a electroporación
ex vivo con el ARN del tumor autólogo estimuló la inmunidad segura
in vivo
. A pesar de que la quimioterapia más la vacunación CD40-B no mejoró el tiempo hasta la progresión o la supervivencia específicamente para detectar linfomas en comparación con los perros tratados con quimioterapia sola, la vacunación potenció los efectos de la terapia de rescate y mejoró la tasa de segundas remisiones duraderas, así como la posterior-linfoma específica la supervivencia después de la terapia de rescate. Varios de estos perros recaído ahora son sobrevivientes a largo plazo y libres de enfermedad durante más de un año. En general, estos resultados clínicos e inmunológicos sugieren que la vacunación del cáncer CD40 basado en células es seguro y sinergia con la quimioterapia para mejorar el resultado clínico en canino NHL. En términos más generales, nuestros resultados ponen de relieve el valor único de las investigaciones clínicas en animales de compañía portadores de tumores
Visto:. Sorenmo KU, Krick E, Coughlin CM, Overley B, Gregor TP, Vonderheide RH, et al. Vacuna contra el cáncer Activado-CD40 (2011) B celular Mejora la segunda remisión clínica y la supervivencia en los perros de propiedad privada con linfoma no Hodgkin. PLoS ONE 6 (8): e24167. doi: 10.1371 /journal.pone.0024167
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Abril, 2011; Aceptado: August 1, 2011; Publicado: 31 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Sorenmo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Alianza para el Cancer gene Therapy (RHV), la Fundación Onyx y Ventoso (MUS), el Barry y Memorial Fund caniche Savannah y el comparativo Centro de Oncología Mari Lowe (MNJ), el Programa de Inmunobiología del Centro de cáncer Abramson de la Universidad de Pensilvania (NIH subvención P30 CA016520, RHV), y el Fondo de Investigación Oncológica en el hospital veterinario de la Universidad de Pensilvania (MUS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
con la reciente aprobación de la FDA de la vacuna de células dendríticas sipuleucel-T para el tratamiento del cáncer de próstata avanzado [1], no se ha renovado esfuerzos para optimizar aún más las terapias basadas en células de segunda generación destinadas a estimular la lucha contra la inmunidad tumoral para el tratamiento del cáncer [2] - [3]. Debido a que el uso de células presentadoras de antígenos inactivados de reposo o (APC) en realidad puede desencadenar la tolerancia de células T específicas de antígeno y por lo tanto ser altamente contraproducente si se administra a los pacientes, es fundamental para desarrollar y formulaciones de APC de las pruebas que se han diseñado expresamente para activar APC o bien
in vivo
o
ex vivo. Un enfoque que ha surgido es reticulación farmacológica de CD40 expresado en la superficie de [4] APC con el fin de regular por incremento de MHC y moléculas co-estimuladoras, estimular la secreción de citoquinas inflamatorias tales como IL-12, y hasta de regular anti-apoptótica moléculas - un proceso conocido colectivamente como "concesión de licencias APC" que permite el cebado de ingenuo CD4 + y células T CD8 + e impulsando robustas respuestas de células T de memoria [5]. reactivos clínicos que activan CD40 se han desarrollado para uso sistémico y han mostrado promesa clínica [6] - [8], pero estos agentes no necesariamente conducen respuestas de células T
in vivo
debido a las características restrictivas del microambiente del tumor [8]. A continuación, se estudia un
ex vivo de las licencias de APC. Aunque las células dendríticas en la mayoría de los modelos son las células principales responsables de las células T fisiológica de cebado
in vivo
, las células B pueden también actuar como APC y también puede obtener licencia por la activación de CD40 [9] - [10]. células B CD40 activados (CD40-B), como DC, pueden primos ingenuas respuestas de células T contra neoantígenos
ex vivo
y pueden aumentar las respuestas de células T de memoria [9] - [11], lo que sugiere que el antígeno cargado , CD40-B puede representar una alternativa viable a la DC en las estrategias de vacunación basadas en células. En agudo contraste con DC, sin embargo, las células B se pueden ampliar fácilmente
in vitro usando
CD40 ligadura, la eliminación de la necesidad de gran leucaféresis volumen (como se requiere para la fabricación de sipuleucel-T) para obtener un número suficiente de APC para vacunas recurrentes [9] - [10], [12]. Aunque CD40-B puede aumentar las respuestas de células T efectoras específicas de antígeno
in vitro
contra los antígenos virales y tumorales asociados, poco se sabe si estos APC alternativa puede estimular las respuestas inmunitarias antitumorales eficaces
in vivo
.
Para abordar esta cuestión, hemos realizado un ensayo clínico de una vacuna CD40-B en los perros de propiedad privada (mascotas) con linfoma no Hodgkin (LNH). Canino NHL representa un problema de salud importante en los perros y acciones similares clínica, conductuales, genéticas y las características citogenéticas a la NHL en los seres humanos. Ahora es ampliamente aceptado como un sistema modelo clínicamente relevante en el que para evaluar la seguridad y eficacia de nuevos agentes terapéuticos antes de su traducción en ensayos clínicos humanos [13]. Al igual que en los pacientes humanos con linfoma no Hodgkin, el estándar de cuidado para el tratamiento inicial de la NHL canina consiste en protocolos de quimioterapia de combinación. Aunque la quimioterapia de inducción es muy efectivo y el 60% -85% de los perros tratados lograr la remisión clínica completa después de la terapia de inducción, casi todos los perros sufren una recaída dentro de un año con la enfermedad resistente a los medicamentos y mueren de linfoma [14] - [15]. Las tasas de curación de la NHL canina no han cambiado sustancialmente en las últimas décadas a pesar del uso de protocolos más intensa de la dosis.
En este estudio, hemos probado clínicamente una plataforma terapéutica que hemos descrito anteriormente en los estudios preclínicos [12 ] en la que se expanden las células B de los perros NHL
in vitro usando
CD40L transfectaron células K562 (KtCD40L) y después se cargó con RNA tumor autólogo para generar una vacuna basada en células. ARN-cargado CD40-B derivado de células B de sangre periférica, caninos estimular respuestas de células T específicas de antígeno funcionales
in vitro En venta perros sanos y de perros con aparición espontánea de la NHL [12]. El uso de RNA tumor conjunto como la carga útil antigénico permite un enfoque antígeno completo HLA-independiente que tiene por objeto promover una respuesta de células T anti-tumor policlonal. Aquí, se presenta el primer ensayo clínico en cualquier especie de una vacuna contra el cáncer cargado CD40-B ARN del tumor, realizadas en el contexto de la enfermedad residual mínima. Nuestros resultados demuestran que CD40-B puede estimular la respuesta inmune
in vivo
que impactan segunda remisión y la supervivencia en un modelo grande espontánea, animal de linfoma no Hodgkin. Estos resultados sugieren que el antígeno tumoral cargado CD40-B puede servir como una alternativa práctica a la DC en las estrategias de vacunas basadas en células para perros y humanos con cáncer.
Resultados
protocolo de perro propiedad privada
Treinta perros de propiedad privada con LNH se matricularon en la presentación de la enfermedad en este ensayo de viabilidad pre-clínica y se sometió a quimioterapia de inducción (Grupo 1; intención de tratar). Características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Diecinueve perros (63%) fueron confirmados para estar en citológico y la remisión clínica completa al final de la quimioterapia y por lo tanto fueron elegibles para la vacunación con células B CD40 activado autólogas (cada dos semanas durante tres inyecciones intradérmicas en el flanco) que había sido cargada con ARN total aislado previamente a partir de células de linfoma autólogas (Métodos y materiales y métodos suplementarios) (Grupo 2). se inyectó un número igual de autólogo CD40-B cargado con virus del moquillo canino hemaglutinina mRNA en el flanco opuesto como un control inmunológico. Sesenta y cuatro perros con NHL fueron seleccionados de un grupo de 130 perros como controles para el grupo no vacunado (Grupo 3). Estos perros fueron seleccionados en base a el hecho de que fueron tratados con el mismo régimen de quimioterapia de inducción como el grupo vacunado (Grupo 2) y se confirmaron en remisión clínica y citológica completa al final del protocolo de quimioterapia, pero que no reciben CD40 vacunas de células -B. No hubo incentivos para perros en cualquier grupo para recibir quimioterapia, evitando así cualquier sesgo en el método de tratamiento o la intensidad de la terapia. Aunque el número de perros en el grupo de control (Grupo 3) era más grande que el grupo perro vacunado (Grupo 2), no hubo diferencias estadísticamente significativas en los factores de pronóstico, incluyendo inmunofenotipo entre los grupos 2 y 3 (Tabla 1).
Toxicidad
la vacunación con ARN cargado CD40-B fue muy bien tolerado. Un perro exhibió síntomas de una reacción sistémica aguda, incluyendo debilidad, hipotensión, vómitos y dentro de unas pocas horas de haber recibido la primera vacuna. El tratamiento con líquidos intravenosos, difenhidramina y antieméticos dio como resultado una recuperación sin complicaciones. Este perro particular, se trató previamente con difenhidramina inmediatamente antes de las 2 vacunaciones posteriores, y no se produjeron reacciones sistémicas más. Leves reacciones en el sitio de inyección, incluyendo el eritema y la inflamación ocurrieron en varios perros. No hubo alteraciones significativas en la química sanguínea completa durante o después de la vacunación en ninguno de los perros. Por otra parte, se identificaron clínicamente complicaciones a largo plazo de la vacunación como la autoinmunidad, clínicopatológicamente (supervisado por CBC serie) o en la necropsia.
Los resultados clínicos
La mediana del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) fue 236 días (95% intervalo de confianza [IC], 158-314 días) en el grupo 1 (intención de tratar), 366 días (IC del 95%, 349-383 días) en el Grupo 2 (perros vacunados) y 327 días (95 IC%, 223-431) en el Grupo 3 (perros no vacunados). No hubo diferencias estadísticamente significativas en la TTP entre los grupos 1 y 3 (p = 0,16) o Grupos 2 y 3 (p = 0,34). Las curvas de Kaplan Meier para la TTP se muestran en las Figs. 1A y 2A. linfoma mediana de supervivencia específica (LSS) fue de 489 días en el grupo 1 (IC del 95%, 309-669 días), 809 días en el grupo 2 (IC del 95%, 289-1335 días), y 594 días en el Grupo 3 (95% CI, 536-652 días). Las curvas de Kaplan Meier para LSS se muestran en las Figs. 1B y 2B. Aunque había una mejora del 36% en la mediana LSS en el grupo vacunado 2 en comparación con el grupo de control no vacunado 3, la diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,18). Del mismo modo, no hubo diferencia estadísticamente significativa en la mediana de LLS entre el Grupo 1 y Grupo 3 (p = 0,37). La tasa de supervivencia global en el Grupo 2 y Grupo 3 perros en 1 año fue del 89,5% y 74,1%, respectivamente, y en el año 2 fue 41,4% y 25,4%, respectivamente. No hubo diferencia estadísticamente significativa en la supervivencia global, lo que indica que la vacunación no aumentó la mortalidad.
Quince de los 19 (79%) perros vacunados del grupo 2, con el tiempo, pero con recaída 4 perros (21 %) no lo hizo y logró una duradera (& gt; 16 meses) la primera remisión después de la quimioterapia y CD40-B de la vacunación. Uno de estos cuatro perros murieron de causas no relacionadas a 492 días, sin evidencia de linfoma confirmado por la autopsia. Los otros 3 perros están vivos sin evidencia de linfoma en 959, 1103 y 1287 días después del inicio de la quimioterapia (con seguimiento clínico en curso). Diez de los perros vacunados (52,6%) han muerto debido a un linfoma; seis permanecen vivos en durable primera o segunda remisión, y 3 fueron sacrificados debido a otras causas. Dos de los tres perros sacrificados tenían hemangiosarcoma, sin evidencia de linfoma, y el otro perro fue sacrificado debido al "deterioro de la salud." Limited elaboración se dejó en este perro, pero la autopsia no encontró evidencia de linfoma. La causa del deterioro de la salud no fue identificado; sin embargo, no había pruebas de la autoinmunidad y todos los linajes de células con la maduración completa estuvieron presentes en la médula ósea. Un total de 7 perros sometió necropsias cuando murieron o fueron sacrificados. Con la excepción de los 3 perros discutidos anteriormente, todos los otros perros (4 perros) fueron sacrificados debido al linfoma etapa avanzada y no tenía ninguna evidencia de finales de los efectos tóxicos de la vacuna. Cuatro de los 64 perros en el grupo de control (grupo 3) se perdieron durante el seguimiento después de la nueva puesta en escena, y la información de resultado no estaba disponible. De los 60 perros restantes, 46 (76,7%) recayeron y 14 (23,3%) no lo hicieron. No hubo diferencia significativa en la tasa de recaída entre los grupos 2 y 3 (p = 1,0).
La terapia de rescate y la causa de la muerte
Diez de los 15 perros vacunados (66,7%) en el grupo 2 recaída que fueron tratados con ciclofosfamida, vincristina y prednisona (COP) como terapia de rescate y cuatro de estos perros (40%) logra segunda remisión clínica duradera (& gt; 22 meses) y no recaída. Los otros 5 perros vacunados que tuvieron una recidiva fueron tratados con prednisona como agente único como terapia de rescate, uno de los cuales logran una segunda remisión duradera y no recaída. Tres de estos cuatro perros vacunados con una segunda remisión duradera inducida por la quimioterapia siguen vivos sin evidencia de linfoma en 689, 1209, y 1216 días después del inicio de la quimioterapia inicial. Los otros dos perros (uno tratado con quimioterapia y COP 1 tratados con prednisona sola) se sacrificaron a los 722 y 958 días, respectivamente; como se ha señalado anteriormente, la primera perro tenía hemangiosarcoma y el segundo perro fue sacrificado debido a la "disminución de la salud." Ni perro había evidencia de linfoma en la necropsia. Los otros diez perros recaída durante el tratamiento de rescate y fueron sacrificados debido a su linfoma
En el grupo no vacunado 3, 39 de 46 perros (84%) que recayeron fueron tratados con quimioterapia de rescate y un perro recibió prednisona sola.; Sin embargo, sólo 3 (7,7%) de los perros en el grupo 3 que recibieron terapia de rescate logre una segunda remisión duradera, en comparación con el 40% de los perros vacunados que alcanzaron una segunda remisión duradera a la terapia de rescate, una diferencia que fue estadísticamente significativa (p = 0,025). Esta diferencia resultó en una mejoría estadísticamente significativa en la supervivencia después de la terapia de rescate para la recaída del Grupo 2 perros que recibieron la terapia de rescate en comparación con recaída Grupo 3 perros que recibieron la terapia de rescate (p = 0,038) (Fig. 3). Es importante destacar que no hubo diferencia significativa en el uso de la terapia de rescate entre los perros que recayeron en el Grupo 2 (66,7%) y el Grupo 3 (84%), (p = 0,15).
evaluación inmunológica
Para determinar si las células CD40-B de ARN cargado tumorales inducen respuestas de células T específicas de tumor funcionales
in vivo
, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas en el momento del diagnóstico y 3 semanas después de la última vacuna se analizaron para la presencia de IFN-γ producción, las células T específicas de tumor por ELISPOT. análisis de IFN-γ ELISPOT estaba disponible para 9 perros en el Grupo 2 (Fig. 4). Una respuesta positiva IFN-γ a la terapia se definió como & gt; 50% de aumento en el número de células de citocinas después de la vacunación en comparación con la línea de base y con un valor de p & lt secretoras; 0,05. Se observaron respuestas positivas inmunes a CDV HA en 4 de 9 perros vacunados; una respuesta inmune IFN-γ positiva al antígeno tumoral autólogo también se observó en 1 perro y una tendencia hacia la significación (p & lt; 0,1) se observó en otros 2 perros. En otras 2 perros (perros 1 y perro 16) no era & gt; 50% de aumento en el número de citoquinas que secretan las células en respuesta al antígeno de tumor autólogo después de la vacunación en comparación con la línea de base, pero la significación estadística no pudo ser asignado debido a la duplicación en lugar de por triplicado análisis. No hubo correlación entre la respuesta inmunológica y el número medio de células CD40-B administradas a cada perro en el transcurso de las tres vacunas. Debido a que sólo 9 perros fueron capaces de analizar (debido a la insuficiente disponibilidad de PBMC en todos los puntos), no hemos podido detectar una correlación estadísticamente significativa entre la respuesta inmunológica y el resultado clínico.
PBMCs se obtuvieron de perros en el momento del diagnóstico (pre) y 3 semanas después de la vacunación (post) y las respuestas inmunes específicas de antígeno dirigidos contra antígenos tumorales nodo (A) CDV-HA y (B) la linfa se determinaron por IFN-gamma ELISPOT. * P & lt; 0,1, ** p & lt;. 0,05
Discusión
El objetivo de este estudio fue determinar si las células B CD40 activado transfectadas con ARN del tumor podrían inducir de forma segura anti- inmunidad tumoral y al impacto de la historia natural de la NHL espontánea en perros después de la inducción de la remisión con quimioterapia. En un ensayo clínico de perros de propiedad privada, las células CD40-B autólogas de ARN-cargado administrados por vía intradérmica en el contexto de la enfermedad mínima funcionado como APC
in vivo
y estimulados con IFN-γ células secretoras. Aunque nuestro enfoque de vacunación no tuvo un impacto TTP o LSS en comparación con un grupo de control de los perros tratados con quimioterapia sola, se observó una mejoría estadísticamente significativa en el grupo vacunado de la tasa de segundas remisiones duraderas, así como la supervivencia linfoma específico posterior en recaída perros tras el tratamiento con la terapia de rescate. Este hallazgo es particularmente interesante debido a que el tratamiento de rescate utilizado incluyó sólo los medicamentos que ya se habían utilizado en el régimen de quimioterapia inicial. Durante mucho tiempo se ha apreciado que la gran mayoría de los perros con NHL que la recaída después de la remisión inicial sufren la progresión del tumor rápido y mueren a pesar de tratamientos de rescate [15]. Como una ilustración de esto, en el (sin vacuna) grupo de quimioterapia en este estudio, segunda remisión duradera se logró en sólo el 7,7% de los perros. Por el contrario, para los perros que recayeron después de recibir quimioterapia más CD40-B de la vacunación, el 40% de los perros logra una segunda remisión, durable. Por otra parte, la supervivencia linfoma específica fue mayor en los perros con recaída que habían sido vacunados previamente que aquellos perros que no tenían (con clínica seguimiento activo en curso). Aunque el número de perros en el grupo vacunado es pequeño, los hallazgos clínicos en este estudio de factibilidad son alentadores y justifican más pruebas en un ensayo más grande, doble ciego, aleatorizado clínica. En general, nuestros resultados clínicos e inmunológicos sugieren que la vacunación contra el cáncer de células CD40 basado en sinergia con la quimioterapia para mejorar el resultado clínico de esta enfermedad.
La estrategia de vacuna empleada en este estudio se basa en nuestro trabajo preclínico anterior [10], [ ,,,0],12] lo que demuestra que CD40-B se puede utilizar como una alternativa a la DC en las estrategias de vacuna contra el cáncer, con el beneficio añadido de
ex vivo
expansión celular que permite que varias vacunas para generar a partir de un pequeño volumen de sangre periférica. Nuestros resultados confirman que el uso de células CD40-B transfectadas conjunto de ARN tumor como una alternativa a la vacunación DC es factible y bien tolerada
in vivo
. En este estudio se utilizó RNA tumor conjunto como la carga útil antigénico que suministra tanto tumorales /antígenos específicos de linfoma mutadas y no mutadas autoantígenos.
In vitro
, RNA-transfectadas CD40-B puede estimular las respuestas de células T citotóxicas frente a antígenos tumorales que son comparables con las respuestas inducidas por DC cargadas con antígeno [10], [16]. Aquí, hemos traducido estos resultados en el ámbito clínico y demostrar que, al igual que con carga de antígenos DC, CD40-B puede inducir respuestas inmunes cuando se administra
in vivo
. Es importante el descubrimiento de que el ARN cargado autólogo CD40-B podría administrarse de forma segura a los perros con reacciones en el lugar de la inyección sólo ocasionales y leves señaladas como eventos adversos agudos. Un perro tenía una sola reacción anafiláctica similar a la primera vacunación que no ocurrió después de la segunda o tercera vacunación. No hay complicaciones a largo plazo de la vacunación incluyendo autoinmunidad fueron identificados clínicamente o en la necropsia en cualquiera de los perros. Por otra parte, también se evaluó la supervivencia global entre el grupo vacunado y el grupo control y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas, lo que indica que la vacunación no aumentó la mortalidad.
Nuestras observaciones que antes de la vacunación CD40-B un impacto positivo en la tasa de segundo remisión y posterior supervivencia en perros tratados con recaída hallazgos paralelos terapia de salvamento que están saliendo de los trabajos recientes en los ensayos de vacunas humanas; a saber, la mediana de supervivencia global prolongada [1] o una alta tasa de respuesta inesperada a la terapia de rescate [17], sin necesariamente mejorar la supervivencia libre de progresión en pacientes humanos vacunados con DC cargadas con antígeno. Estos estudios humanos documentaron una asociación entre principios de la respuesta inmune a la vacunación y respuestas inesperadas y duraderas a la quimioterapia más tarde, y sugieren una compleja interacción entre la quimioterapia y la inmunoterapia que pueden ser terapéuticamente aprovechable. Aunque los mecanismos subyacentes detrás de estas observaciones no se conocen con exactitud, se plantea la hipótesis de que el uso de la quimioterapia citotóxica en pacientes cuyos sistemas inmunes han sido cebados apropiada para reconocer antígenos tumorales a través de la vacunación del cáncer puede aumentar la inmunidad anti-tumoral [18] - [19] . Los agentes citotóxicos, tales como las antraciclinas pueden inducir la muerte de células tumorales "inmunógeno" y la liberación de moléculas proinflamatorias potentes que promueven la activación de DC y el procesamiento y presentación de antígenos [20]. Por otra parte, los efectos citotóxicos de la terapia de rescate pueden producir un efecto de refuerzo anti-tumor inmunológica por romper las células tumorales y liberando de este modo los antígenos tumorales para la presentación [21]. Datos muy recientes también sugieren que la quimioterapia puede sensibilizar dianas tumorales para la destrucción por las células T específicas inducidas por la vacunación [22]. Los agentes citotóxicos tales como ciclofosfamida también pueden mejorar la inmunidad anti-tumor mediante la inhibición de las células T reguladoras [23] y por la modulación de la balanza de subconjuntos de células dendríticas en los órganos linfoides [24]. Por lo tanto, en nuestro estudio, es posible que la terapia de rescate sirvió para aumentar las respuestas inmunológicas contra los tumores que habían sido sensibilizados por la vacunación apropiada CD40-B antes, lo que lleva a los tiempos de la segunda remisión duradera y la supervivencia global prolongada.
los datos usados en los perros tratados con el mismo protocolo de quimioterapia en la misma institución como el control de la población en el TTP analiza /LSS. Lo ideal sería que la población de control habría consistido en perros asignados al azar para recibir quimioterapia sola, y las comparaciones realizadas sobre la base de intención de tratar; Sin embargo, hasta el 40% de los perros que presentan a nuestra institución con LNH falle la quimioterapia de inducción y por lo tanto no sería elegible para la vacunación o la inclusión en la población control. El tamaño de muestra necesario para tener la potencia adecuada para un estudio de este tipo sería bastante grande y por lo tanto no es práctico para un estudio de viabilidad. Como alternativa, se seleccionaron los perros con la misma enfermedad, tratada con el mismo régimen de quimioterapia de 20 semanas que dio lugar a una remisión completa de un grupo más grande de los perros con linfoma no Hodgkin como un grupo de control no vacunado. Es importante destacar que, mediante el análisis de los factores pronósticos negativos previamente documentadas entre los grupos 2 y 3 (Tabla 1), se confirmó que no hubo diferencia estadística en estos factores entre los grupos 2 y 3. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de la población de los grupos 2 y la diversidad de variables es posible que las diferencias en los factores pronósticos negativos entre los grupos pueden haber existido.
Finalmente, nuestros resultados ponen de relieve el valor de un enfoque oncología comparada [13], [25] en el que los perros de propiedad privada con LNH representan no sólo un problema clínico importante en la medicina veterinaria, sino también un modelo animal espontánea de la condición humana. El ensayo de nuevas terapias inmunes en el alto riesgo pero configuración enfermedad mínima residual en perros es apropiado y ético, y que puede ser decisivo para el éxito del desarrollo de enfoques inmunológicos que de otro modo se suprime por gran carga tumoral. Aquí, en lugar de implementar esfuerzos terapéuticos complejos para abordar las cuestiones de la inmunosupresión en el microambiente tumoral, que utilizó por primera quimioterapia estándar para disminuir enormemente la carga tumoral antes de la terapia inmune. En la gran mayoría de los ensayos clínicos de fase I que evalúan las terapias inmunes en seres humanos, los pacientes tienen la carga tumoral significativa, enfermedad avanzada, y han sufrido los efectos inmunosupresores de múltiples rondas de quimioterapia y otros tratamientos. El estudio de los perros con linfoma no Hodgkin espontánea ofrece una oportunidad única para evaluar la eficacia terapéutica de las terapias inmunes en el contexto de la enfermedad residual mínima. Los resultados de este estudio sugieren que los efectos sinérgicos entre la quimioterapia y la inmunoterapia se producen y que la combinación óptima de estas modalidades pueden conducir a respuestas terapéuticas significativas. Otros estudios en perros de propiedad privada con cánceres de origen natural pueden proporcionar una oportunidad para comprender los mecanismos subyacentes a este efecto y para determinar la combinación óptima y la secuencia de quimio-inmunoterapia para el éxito terapéutico. Este enfoque puede acelerar la traducción de tales combinaciones a pacientes humanos.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de nuestra universidad ( Protocolo 800.900) y el Comité de propiedad privada Protocolo Animal de la Universidad de la Escuela de Medicina Veterinaria de Pennsylvania (Protocolo POAP-197).
población de estudio Protocolo, criterios de selección y diseño del estudio
los perros con nueva diagnosticada, tratada NHL multicéntrico que pesaba más de 5 kg se hacen pruebas de elegibilidad para participar en este estudio. En el momento del diagnóstico, la estadificación completa, incluyendo CBC, el perfil químico del suero, análisis de orina, radiografías torácicas, ultrasonido abdominal, inmunofenotipo, aspirados de médula ósea, aspirados y biopsias de ganglios linfáticos, se realizó. Los criterios de elegibilidad incluyeron hayan presentado enfermedades graves, menos del 30% de linfoblastos aspirados de médula ósea, raras para linfoblastos ausentes detectados en la sangre periférica opinión frotis y el consentimiento informado por escrito del propietario.
Antes de la quimioterapia de inducción una sola, ganglio linfático periférico se extirpó quirúrgicamente y se recogió sangre periférica para la generación de vacunas y la línea de base estudios de la función inmune. La quimioterapia de inducción consistió en un 20-semanas protocolo corto, la quimioterapia de combinación incluyendo ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, L-asparaginasa, y prednisona, como se describe anteriormente [14]. El mismo protocolo de quimioterapia de inducción se utiliza para perros en los grupos 2 y 3. Todos los perros fueron sometidos a una reclasificación completa, incluyendo aspirados con aguja fina y la evaluación citológica de un ganglio linfático periférico, dos semanas después de la finalización del protocolo. Sólo los perros que fueron confirmados para estar en remisión completa fueron elegibles para la vacunación y sólo estos perros fueron sometidos a más extracciones de sangre para la recolección de CMSP.
La vacuna autóloga consistió en células tumorales de ARN totales cargadas con CD40-B y la vacuna de control consistió en células CD40-B cargados de CDV-HA mRNA. Las vacunaciones se iniciaron 3 a 4 semanas después de la finalización de la quimioterapia. áreas vacunados fueron rasurados y asépticamente preparados antes de la vacunación. Las vacunas se administraron por vía intradérmica (tumor RNA CD40-B en un flanco; CDV-HA CD40-B en el flanco opuesto) cada 2 a 3 semanas para un total de tres vacunaciones. se recogió inmediatamente antes de cada vacunación de sangre para estudios inmunológicos y monitoreo toxicidad y 3 semanas después de la administración de la última vacuna.
Los perros que no lograron la remisión y, por tanto, no recibieron la vacuna y los perros que fueron vacunados, pero recaída después se les ofreció terapia de rescate estándar de atención de acuerdo a las recomendaciones de preferencia y veterinario de sus propietarios. Todos los perros vacunados fueron controlados por la recaída a través de exámenes mensuales para el primer año, cada dos meses para el 2
º año y cada 3 meses durante el tercer año. Las recaídas fueron confirmados por aspirados con aguja fina en todos los perros.
ARN y ARNm de preparación
detalles de fabricación para la preparación de CD40-B, el aislamiento de ARN y la electroporación se ha informado anteriormente [12]. En resumen, el ARN total fue extraído a partir de tejido de ganglio linfático maligno tomada en el momento del diagnóstico y antes de la quimioterapia usando el kit RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA). la cantidad de ARN se determinó midiendo la D.O. a 260 nm la calidad y el ARN se determinó por electroforesis en gel. ARN se almacenó a -80 ° C antes de su uso. ARNm que codifica larga duración CDV-HA o GFP se prepara a partir de plásmidos de plantilla mediante transcripción in vitro como se describe anteriormente [12]. ARN transcrito se poliadenilado en el extremo 3 'utilizando la Escherichia coli de poli (A) polimerasa I (E-PAP), se trató con DNasa para eliminar las secuencias de plásmido y se purificó por extracción con fenol ácido /cloroformo y RNeasy separación en columna (Qiagen).
Vacuna contra la fabricación
CD40-B se genera a partir de células caninas mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando células K562 transfectadas con CD40L humana (KtCD40L) como células de alimentación como se describe anteriormente [12]. 5 × 10
6 PBMCs fueron co-cultivadas con 10
6 células KtCD40L irradiados letalmente en presencia de canino recombinante de IL-4 y la ciclosporina. Después de 5-7 días, se recogieron las células B, se contaron y volvieron a estimular con células KtCD40L irradiadas en presencia de IL-4 y la ciclosporina. Las células se estimularon con células KtCD40L tres veces. Cinco días después de la última estimulación de CD40-B cosechadas, lavadas dos veces en PBS y se resuspendieron a 2 x 10
6 células por 100 ul de solución de Nucleofector B (Amaxa, Colonia, Alemania). Hasta el 5 × 10
6 células se sometieron a electroporación con 10 ug de ARN tumoral autólogo o 2 ug CDV ARNm utilizando el dispositivo Amaxa Nuceofector (programa de pulso U08). El electroporador fue diseñado y fabricado de acuerdo a las normas GMP establecidas por la FDA y está aprobado para su uso en la fabricación de vacunas humanas. Después de la electroporación, las células se lavaron una vez en los medios de células B y, a continuación dos veces en PBS. Las células electroporadas se volvieron a suspender en 300 ul de PBS y se administró por vía intradérmica sobre el flanco derecho de las células CD40-B-ARN cargado tumorales y sobre el flanco izquierdo de las células CD40-B-cargados CDV.
Preparación de la vacuna y la generación
células CD40-B y RNA tumor se generaron a partir todos los perros, aunque el número de células CD40-B producido variarse por perro.