Extracto
Antecedentes
El tratamiento para los pacientes con cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células (CPNM) es a menudo determinado por la presencia de biomarcadores que predicen la respuesta a fármacos dirigidos a las vías moleculares específicas. Las demandas para el análisis multiplex de los genes implicados en la patogénesis de NSCLC están aumentando.
Métodos
Hemos validado el sistema de Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) utilizando el Panel hotspot cáncer Ion AmpliSeq y se compararon los resultados con los obtenidos mediante los métodos estándar de oro, secuenciación Sanger y PCR convencional. El método de PCR cycleave se utilizó para verificar los resultados.
Resultados y Conclusiones
El Ion Torrent PGM resultó en un nivel similar de precisión en la identificación de múltiples mutaciones genéticas en paralelo, en comparación con la PCR convencional y secuenciación de Sanger; sin embargo, el Ion Torrent PGM fue superior a los otros métodos de secuenciación en términos de una mayor facilidad de uso, incluso cuando se tiene en cuenta la pequeña cantidad de ADN que se obtuvo de parafina fijado con formalina incorporado (FFPE) muestras de biopsia.
Visto: S Fujita, Masago K, J Takeshita, Okuda C, K Otsuka, Hata A, et al. (2015) Validación de una plataforma de secuenciación Ion Torrent para la detección de mutaciones genéticas en especímenes de biopsia de pacientes con no pequeñas de pulmón de células. PLoS ONE 10 (6): e0130219. doi: 10.1371 /journal.pone.0130219
Editor Académico: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
Recibido: 28 Diciembre, 2014; Aceptado: 17-may de 2015; Publicado: 15 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Fujita et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:.. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que existen conflictos de intereses.
Introducción
el tratamiento para los pacientes con cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células (NSCLC) se determina a menudo, como es el caso de otros cánceres humanos, por la presencia de biomarcadores que predicen la respuesta a los agentes dirigidos vías moleculares específicas en las células malignas. La respuesta favorable a la tirosina quinasa (TK) inhibidores de la diana es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), en los casos de NSCLC en los que las mutaciones están presentes en el gen EGFR, ilustran la importancia de la identificación de biomarcadores moleculares, y varias de estas alteraciones oncogénicas ha sido reportado hasta la fecha [1-3]. Estas alteraciones moleculares se pueden dividir en dos categorías; reordenamientos genéticos que requieren análisis y /o de fluorescencia basada en ARN de hibridación in situ para su identificación, y las mutaciones del gen (incluyendo pequeños eventos de inserción o supresión) que se investigó mediante análisis basado en el ADN. Las mutaciones se han descubierto en varios genes, además de
EGFR Windows que están involucrados en la patogénesis de NSCLC (es decir,
KRAS
,
ANR
,
HER2
,
AKT1
,
BRAF
,
PIC3CA
) y la demanda de análisis multiplex de estos genes es cada vez mayor.
las únicas muestras de tejido que son por lo general disponibles para el análisis mutacional en el ámbito clínico son muestras de biopsias obtenidas transbronquialmente o transcutánea. Estas muestras tienden a ser pequeños y se someten al proceso de formalina fijación. La detección de mutaciones mediante la realización de PCR y secuenciación de Sanger en paralelo es mucho tiempo y requiere una cantidad sustancial de DNA, que a menudo no está disponible debido al tamaño pequeño de la muestra. Una técnica recientemente desarrollada, masivamente paralelo secuenciación del ADN, permite la detección rápida, sensible y altamente específico de mutaciones de genes en un solo ensayo, a un costo razonable.
A continuación, se utilizó el sistema de Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) (Thermo Fisher Scientific) en conjunto con el Grupo AmpliSeq hotspot cáncer Ion, versión 2 y compararon los resultados con los obtenidos por los métodos estándar de oro para el análisis mutacional, la secuenciación de Sanger y PCR convencional. Además, un método de PCR de alta sensibilidad, el método de PCR cycleave, se empleó, centrándose en EGFR y KRAS mutaciones de genes específicamente, para verificar los resultados obtenidos tanto por PCR convencional y el sistema de Ion Torrent PGM.
Métodos
Ética
Este estudio fue aprobado por el Instituto de Investigación Biomédica y Junta de Revisión Institucional de Innovación del hospital. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito. El estudio se realizó de conformidad con los principios éticos de la Declaración de Helsinki.
Información al paciente
Las muestras tumorales utilizados en el estudio fueron recogidos por el Instituto de Investigación Biomédica del Hospital y la Innovación, Japón. De acuerdo con las directrices actuales, todas las muestras tumorales FFPE de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas con genotipo desconocido (
EGFR
y
KRAS
) se analizaron por secuenciación Sanger y PCR convencional para determinar tratamiento adicional. Como comparación, un total de 21 muestras de tumor se analizó con el sistema de Ion PGM y el método de PCR cycleave
genes analizados
EGFR
:. Exon 19 deleción (incluyendo E746 -A750), el exón 21 L858R, el exón 21 L861Q
KRAS
: Exon 2 g12x
muestras de tejidos y ADN aislamientos
Sólo las muestras de biopsia que reveló NSCLC patológicamente se analizaron. En todos los casos, broncoscópico biopsia o una aguja de biopsia de núcleo se realizó (Fig 1A y 1B). Una aguja de calibre 21 dedicado se utilizó para obtener núcleo histológico. núcleos histológicos se fijaron con formalina y se utilizan para el diagnóstico patológico. Después del diagnóstico histopatológico, las muestras FFPE (de 1 a 3 muestras de sección de 5 micras de espesor) se deparaffinized utilizando xileno. ADN fue aislado de las secciones utilizando el Kit QIAamp DNA Mini (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. Se midió la concentración de ADN con NanoDrop Lite espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific).
embebidos en parafina de muestras fijadas con formalina (A). (B) Una muestra de sección de 5 micras de espesor.
Convencional PCR y secuenciación de Sanger
Los exones 18 a 21 fueron amplificados por PCR y se analizaron. Los cebadores y las condiciones de los ciclos para la amplificación PCR se modificaron a partir de los métodos publicados anteriormente [4]. Las reacciones de secuenciación se sometieron a electroforesis en un ABI PRISM 3100 (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación directa de los productos de la PCR se llevó a cabo en ambas direcciones sentido y antisentido.
El método PCR cycleave
Se utilizó una sonda de RNA-DNA quimérica de DNA marcado con un colorante fluorescente y el extintor en cada extremo [5]. Una secuencia de ARN de las sondas corresponde a la de la de tipo salvaje y mutación puntual (exón 21 L858R, el exón 21 L861Q) marcado con FMA y ROX, respectivamente. Cuando las moléculas mutantes están presentes en la muestra y el ADN amplificado por PCR genera un híbrido completo con la parte de ARN de la sonda mutante, RNasa H digiere la sonda en el heterodúplex de ARN-ADN en dos piezas, lo que lleva a un aumento significativo en la intensidad de fluorescencia por la separación del colorante fluorescente de la extintor.
Para detectar la deleción en el exón 19 del gen EGFR, se utilizó el análisis fragmento común. Muestra de ADN se amplificó con un conjunto de cebadores marcado con FAM y los productos de PCR se sometieron a electroforesis. Amplificado por PCR del segmento corto de ADN, la creación de un nuevo pico en un electroferograma cuando una mutación por deleción estaba presente [5].
Ion Torrent PGM Biblioteca Preparación y secuenciación
Un Ion Torrent ligado al adaptador biblioteca se generó tras Ion AmpliSeq biblioteca Kit 2.0 protocolo del fabricante (Thermo Fisher Scientific, Rev. 5; MAN0006735). En pocas palabras, a 50 ng amplicones agrupados fueron reparados final, y Ion Torrent adaptadores P1 y A se ligaron con ADN ligasa. Después de la purificación del grano AMPure (Beckman Coulter), la concentración y el tamaño de la biblioteca se determinaron utilizando el sistema de Life Technologies StepOne (Thermo Fisher Scientific) y Ion Library TaqMan cuantificación Assay Kit (Thermo Fisher Scientific).
emulsión Muestra PCR, rotura de la emulsión, y el enriquecimiento se realizaron utilizando el Kit Ion PGM IC 200 (Thermo Fisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, una concentración de entrada de una copia de plantilla de ADN /se añadió Ion Esfera Partículas (ISPs) a la emulsión de la mezcla de PCR master y la emulsión se ha generado utilizando la Chef Ion (Thermo Fisher Scientific). Plantilla ISP-positivas fueron enriquecidas y secuenciación se llevó a cabo utilizando los chips 314 BC en el Ion Torrent PGM durante 65 ciclos y códigos de barras se realizó utilizando el kit de ADN Ion códigos de barras (Thermo Fisher Scientific).
Variant llamando
los datos de las pistas de PGM se procesaron inicialmente utilizando el software de tubería específica de la plataforma Ion torrent, torrent suite, para generar la secuencia lee, recortar secuencias adaptadoras, filtrar y eliminar señal pobre perfil lee. variante inicial llamando a partir de los datos de secuenciación Ion AmpliSeq se generó usando v4.0 Torrent Software Suite con un plug-in '' variante del programa de llamadas ". Para eliminar la llamada base de errónea, se utilizaron tres pasos de filtrado para generar llamadas variante final. El primer filtro se fijó en una profundidad media de cobertura total de & gt; 100, una cobertura de cada variante de & gt; 20, y el valor p & lt; 0,01. El segundo filtro se emplea mediante el examen visual mutaciones usando software Integrativa Genómica Viewer (http://www.broadinstitute.org/igv) o CLC Genómica Workbench versión 7.5.1 (Qiagen), así como mediante la filtración de posibles errores de cadena específica ; es decir, se detectó una mutación única, ya sea en el '' plus "o" "menos" hebra, pero no en ambas hebras de ADN.
Resultados y Discusión
Un total de 21 muestras de tumores (10 de biopsia transbronquial broncoscopia, biopsia del tumor 6 guiada por TC y 5 central con aguja biopsia del ganglio linfático superficial) fueron analizados. Un valor de la mediana de la concentración de ADN extraído fue 115,2 ng /l (29,3 mínimo, máximo 786,1) y se utilizó una cantidad apropiada de ADN para el análisis. Como se muestra en la Tabla 1 y la figura 2, los resultados de los análisis de mutación del gen obtenidos por secuenciación Sanger eran idénticos en todos los casos a los que se derivan de los análisis utilizando el sistema de Ion PGM. Con respecto a EGFR, los resultados analíticos obtenidos por secuenciación de Sanger coincidir completamente los obtenidos por el método y el sistema de cycleave Ion PGM. Ninguno de los tumores examinados tenían mutaciones en tanto el dominio de EGFR los conocimientos tradicionales y el gen KRAS.
(A) mutación KRAS (G12V) identificado por la tecnología cycleave. (B) la mutación de EGFR (exón 19 supresión) identificado por la mutación KRAS análisis de fragmentos (C) (G12V) se detectó con la tecnología Ion PGM. se identificó C a A transversion. (D) la mutación de EGFR (exón 19 de su eliminación) se detectó con la tecnología de iones de PGM.
Una segunda mutación de EGFR en la que la metionina es sustituido por treonina en la posición 790 (T790M) se correlaciona con la resistencia adquirida a los inhibidores de tirosina quinasa de EGFR [6]. En nuestra serie, 3 pacientes fueron sometidos a una segunda biopsia después de la progresión en el tratamiento de los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR. secuencia de ADN de estas muestras de biopsia por secuenciación de Sanger convencional mostró T790M mutación en dos casos. La secuenciación usando el Ion PGM reveló T790M mutación también en dos casos. Además, entre 900 lecturas obtenidas, se observó la mutación T790M en el 53 lee (5,9%) en el tercer paciente. Aunque el número detectado de lecturas estaba por debajo del nivel de umbral, es posible que la aparición de T790M es la causa principal de la resistencia a EGFR tratamiento inhibidor de la tirosina quinasa en este caso.
A pesar del pequeño número de casos analizados, los resultados sugieren que el Ion torrent PGM es un procedimiento practicable y sensible que sería adecuado en la práctica clínica, cuando sólo una pequeña cantidad de tejido maligno está disponible y análisis multiplex de genes son necesarios para la planificación del tratamiento. Además de la investigación de mutaciones genéticas realizadas aquí, más información sobre los reordenamientos genéticos deben ser integrados en los conocimientos actuales para mejorar el tratamiento del NSCLC y facilitar un mayor estudio.