Extracto
El cáncer de próstata es una enfermedad clínicamente heterogénea, que van desde la enfermedad asintomática indolentes para metastásico muy agresivo y potencialmente mortal formas de la enfermedad. metástasis a distancia representa la causa principal letal de cáncer de próstata. El reto clínico más importante en el manejo de los pacientes es la identificación de aquellos individuos en riesgo de desarrollar la enfermedad metastásica. Para comprender los mecanismos moleculares de la metástasis del cáncer de próstata y de identificar marcadores con potencial metastásico, hemos analizado la expresión de proteínas en dos células de cáncer de próstata líneas singénicos PC3-N2 y PC3-ML2 utilizando etiquetas isobáricas para el etiquetado relativa y absoluta cuantificación y la identificación de proteínas multidimensional tecnología de matriz de cromatografía líquida de ionización por desorción láser asistida espectrometría de masas. PC3-N2 es metastásico humilde mientras PC3-ML2 altamente metastásico. Un total de 1,756 proteínas se identificaron en los análisis con 130 proteínas que muestran diferentes niveles de expresión (p & lt; 0,01) en las dos líneas celulares. De estos, se encontraron 68 proteínas a ser significativamente hasta reguladas, mientras que 62 son significativamente las reguladas en las células PC3-ML2 en comparación con las células PC3-N2. La regulación al alza de plectina y vimentina, que fueron los más significativamente expresadas diferencialmente fueron validados por Western blot y su relevancia funcional con respecto a la invasión y la migración se determinó mediante siRNA silenciamiento de los genes. A nuestro entender, este estudio es el primero en demostrar que la regulación de la expresión de vimentina y plectina se correlaciona positivamente con la invasión y la metástasis de PCA independiente de andrógenos
Visto:. Burch TC, Watson MT, Nyalwidhe JO ( 2013) variable metastásico Potenciales correlacionan con diferencial plectina y expresión de vimentina en células de cáncer de próstata independientes de andrógenos Singenéico. PLoS ONE 8 (5): e65005. doi: 10.1371 /journal.pone.0065005
Editor: Gnanasekar Munirathinam, Universidad de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Septiembre, 2012; Aceptado: April 24, 2013; Publicado: 22 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Burch et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los fondos de puesta en marcha de la Escuela de Medicina de Virginia Oriental (EVMS) al Dr. Julius O. Nyalwidhe. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En Europa y en los EE.UU., el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más frecuente entre los hombres y la tercera causa más común de cáncer en las muertes relacionadas. En 2011 había un estimado de 240,890 nuevos casos y 33.720 muertes por la enfermedad en los EE.UU. [1]. Para las últimas 2 décadas, la detección precoz y el diagnóstico del CaP se ha basado principalmente en la detección del antígeno prostático específico (PSA) en suero, además de un examen rectal digital (DRE), y la evaluación histológica de la ecografía transrectal (ETR) de material de biopsia guiada [2]. Aunque la mayoría de los casos se detectan en una etapa temprana, la enfermedad es clínicamente heterogéneos, que van desde la enfermedad asintomática indolente a muy agresivo metastásico y potencialmente mortal formas de la enfermedad. Más del 7% de los casos detectados el tiempo la enfermedad metastásica distante [3]. El pronóstico de estos hombres es pobre y tienen una supervivencia media de 24 a 48 meses [3]. El reto clínico más crítico para el manejo de enfermedades CaP es determinar cuál de estas dos diversas formas de la enfermedad de un paciente desarrolla. El sitio más común para la metástasis del CP es el hueso; ~ 90% de los pacientes con CP avanzado tienen metástasis ósea [4]. Hueso metástasis CaP es virtualmente incurable y se asocia con una morbilidad severa antes de la muerte, estos incluyen dolor óseo, fracturas patológicas, síndromes de compresión nerviosa, y la hipercalcemia [4]. En la actualidad, las opciones de tratamiento disponibles para los pacientes con enfermedad metastásica son paliativos. El pronóstico /diagnóstico de las lesiones metastásicas óseas se determina actualmente por la formación de imágenes mediante gammagrafía ósea isotópica, la tomografía computarizada (TC), resonancia magnética (RM) o biopsia de médula. La identificación de la biopsia de próstata o biomarcador base de suero (s) para predecir la susceptibilidad de los hombres de desarrollar metástasis potencialmente mejor discriminar las formas metastásicas más agresivas de la enfermedad y así proporcionar un mejor tratamiento y oportunidades de manejo clínico de la enfermedad.
a través de los años la utilidad de PSA como un biomarcador para el cáncer de próstata ha sido polémica con respecto a su incapacidad para distinguir indolente de formas agresivas de la enfermedad [5], [6]. PSA también se asocia con altas tasas de resultados falsos positivos y falsos negativos, como los niveles pueden estar elevados en condiciones no cancerosas de la próstata, incluyendo hiperplasia prostática benigna (BPH) y prostatitis [7] - [10]. Recientemente, el Grupo de Trabajo de Servicios Preventivos de EE.UU. (USPSTF) recomienda contra el cribado basado en PSA para CaP en todos los grupos de edad que indican que los beneficios no compensan los daños de la detección y el tratamiento [11]. Esta incapacidad para predecir con exactitud la agresividad del cáncer de próstata basada únicamente en las características clínico-patológicas estándar subraya claramente la necesidad de explorar la capacidad de los biomarcadores tumorales basados en para mejorar la predicción de resultados en la biopsia y para entender las bases moleculares de la metástasis del cáncer de próstata. Por lo tanto, se necesitan con urgencia biomarcadores adicionales para mejorar la especificidad de diagnóstico de PSA y predecir el potencial de progresión de la enfermedad.
Para entender mejor los mecanismos moleculares de la metástasis del cáncer de próstata, es crucial para identificar los marcadores que se asocian con metástasis. Proteómica ha demostrado ser un método útil y exitoso en el tumor y las metástasis de cribado marcadores de proteínas [12] relacionados. Existen varias tecnologías proteómicas que se han aplicado en la detección y la identificación de posibles marcadores de cáncer. Los 'isobáricas Etiquetas para la cuantificación relativa y absoluta' (iTRAQ) plataforma tiene las ventajas de ser relativamente de alto rendimiento y puede ser multiplexada para proporcionar información sobre péptido /cuantificación de proteínas y la identificación, según lo informado en estudios anteriores [13], [14] . En este enfoque se reducen múltiples muestras de diferentes proteomas, alquilado y proteolíticamente digeridos para generar péptidos. Los péptidos se etiquetan con un conjunto de reactivos iTRAQ (en un formato de 4 o 8-plex), se reunieron y se fraccionó por intercambio catiónico fuerte (SCX). Las fracciones se analizaron entonces mediante cromatografía líquida espectrometría de masas tándem (LC-MS /MS), con los espectros de masas resultantes proporcionan información de la secuencia (a partir de los fragmentos de péptidos), y la cuantificación relativa (de los iones grupo informador).
En un esfuerzo por identificar nuevas proteínas que se asocian con la progresión metastásica de cáncer de próstata humano, hemos realizado un análisis iTRAQ 4-plex usando dos líneas de células de cáncer de próstata PC3 singénicos-N2 y PC3-ML2 que tienen diferentes potenciales metastáticos. PC3-N2 es metastásico humilde mientras PC3-ML2 es altamente metastásico. Tras el análisis comparativo de los datos cuantitativos, se encontró un número de candidatos a ser significativamente expresadas diferencialmente en células PC3-ML2 en comparación con las células PC3-N2. Dos de los candidatos identificados como significativamente hasta reguladas en PC3-ML2 son plectina y vimentina. Estas proteínas se investigaron más por Western blot y siRNA desmontables. Los niveles de expresión correlacionada con inmunohistoquímica imágenes de muestras normales y de próstata adenocarcinoma de tejido. Las proteínas reguladas diferencialmente identificados en el estudio, incluyendo plectina y vimentina, se discuten en el contexto de su importancia para la progresión del cáncer de próstata.
Procedimientos Experimentales
Materiales
modificado por Dulbecco de eagle media (DMEM) y suero bovino fetal (FBS), antibióticos antimicóticos, 4-12% de geles de NuPAGE® Bis-Tris y 2 x tampón de Laemmli eran de Invitrogen (Carlsbad, CA). inhibidores de la proteasa Complete ™ se compraron de Ciencias Aplicadas Roche (Indianápolis, IN), la tripsina de grado de secuenciación era de Promega (Madison, WI), y la membrana Immobilon-FL PDVF era de Millipore (Billerica, MA). kit de ensayo de la concentración de proteína BCA y el tampón de bloqueo libre de proteínas eran de Thermo Scientific (Rockford, IL). Los anticuerpos primarios para vimentina (ab20346), plectina (ab83497) eran de Abcam (Boston, MA), y plectina (sc-7572), GAPDH (sc-25778), pERK medio (Thr 202 /Tyr 204) SC- 16982, ERK 1/2 (MK1) sc-135900, y CDC2 p34 (SC 53) eran de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). CDC2 (Cat#9112) de anticuerpos fue de Señalización Celular Tecnología. IRDye anticuerpos conjugados secundarios (de cabra anti-ratón IR680 Cat.#926-3220, de cabra anti conejo IR800CW Cat.#926 a 32.211, de cabra anti-conejo IR680 (Cat.#926 a 32.221), burro anti-cabra IR680 (Cat.#926-32224), de cabra anti-ratón IR800CW (Cat.#926-3220) eran de Li-COR Biosciences (Lincoln, PA) y Alexa Fluor anticuerpos secundarios para la microscopía confocal de inmunofluorescencia fueron de Invitrogen (Carlsbad, CA). control de siRNA- A (SC-37007), vimentina (h) (SC-29522) y plectina siRNA (h) (SC-29453) eran de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).
Líneas celulares y Cell Cultura y
PC3 parental se obtuvieron originalmente de una metástasis ósea en un paciente con adenocarcinoma de próstata primario. Los dos sublíneas PC3 y PC3-N2-ML2 fueron amablemente donadas a nosotros por el grupo del Dr. Stearns en la Universidad de Drexel y se desarrollaron según lo descrito por Wang y Stearn [15]. las líneas celulares fueron desarrollados sobre la base de su capacidad invasiva
in vitro Opiniones y potencial metastásico
in vivo
. Tanto las células eran tumorigénicas por vía subcutánea cuando se inyecta en ratones SCID. Sin embargo, las células N2 fueron incapaces de migrar a través de una membrana de Matrigel recubierto de
in vitro
, así como provocar metástasis en ratones SCID, mientras que las células eran altamente invasiva ML2
in vitro
y se inducen en las metástasis óseas más de 80% de los casos [15] - [17]. células PC3-N2 y PC3-ML2 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de antibióticos a 37 ° C con 5% de CO
2. Después, las células se disociaron de la superficie de plástico usando EDTA 5 mM en PBS. El tampón de disociación no enzimática conserva moléculas de superficie celular y la viabilidad celular.
Protein Extraction Digestión y ITRAQ Labeling
Para el conjunto de experimentos de lisado de células PC3-N2 y células PC3-ML2 se cultivaron en completa medio de crecimiento hasta 80% de confluencia. Células separadas utilizando mM EDTA 5 en PBS y se lavó con PBS y el sedimento se resuspendió en tampón de disolución que contiene 160 l 100 mM NH
4HC0
3 y TFE (/v 01:01 v). Las muestras se sometieron a ultrasonidos durante 20 segundos tres veces y se incubaron a 60 ° C durante 1 h. Los lisados se centrifugaron para eliminar los restos celulares y células sin romper antes de recoger el sobrenadante. La concentración de proteína se determinó por ensayo BCA y normalizado para cada muestra. 100 mg de alícuotas de las muestras se secaron en un SpeedVac y se sometieron a digestión con tripsina y etiquetado péptido con reactivos iTRAQ acuerdo con las instrucciones del fabricante (iTRAQ Reactivos Multiplex Kit; ABSciex, Foster City, CA). Brevemente, 100 g de proteínas se y se resuspendió en 20 l de tampón de disolución y 1 l de desnaturalizante a TA seca al vacío. Las muestras se redujeron, y se trataron con tripsina alquilada con 5 mg de tripsina de grado modificado la secuencia (Promega, Madison, WI, EE.UU.) durante 18 horas a 37 ° C. muestras digeridas tripsina se marcaron con cuatro reactivos iTRAQ diferentes disueltos en 70 l de etanol a temperatura ambiente durante 1 h. Las reacciones se inactivaron con glicina 10 mM. Las muestras eran como sigue: muestras de células PC3-N2 con 114 y 115 etiquetas y muestras PC3-ML2 con 116 y 117 etiquetas. Esta estrategia proporciona técnicos repeticiones internas para los dos tipos de muestras. Todas las cuatro muestras marcadas se agruparon, (SCX) columna utilizando un fuerte intercambio de cationes se secó al vacío y se fraccionó.
2D-LC separaciones
En la primera dimensión, las separaciones SCX se realizaron en una sistema de HPLC Waters 600E pasivado, utilizando una columna de polisulfoetil mm aspartamida 4. × 250 (PolyLC, Columbia, MD) a una velocidad de flujo de 1 ml /min. Tampón A contenía formiato de amonio 10 mM, pH 2,7, en 20% de acetonitrilo /80% de agua. Tampón B contenía formiato de amonio 666 mM, pH 2,7, en 20% de acetonitrilo /80% de agua. El gradiente era tampón A a 100% (0-22 minutos después de la inyección de la muestra), 0% → 40% de tampón B (16 a 48 min), 40% → 100% de tampón B (48 a 49 min), a continuación, isocrático 100% tampón B (49 a 56 min), luego a 56 min cambió de nuevo a 100% de a a volver a equilibrar para la siguiente inyección. Los primeros 26 ml de eluyente (que contiene todo el flujo a través de las fracciones) se combinan en una sola fracción, a continuación, se recogieron 14 fracciones adicionales de 2 ml. Todos los 15 de estas fracciones de SCX se secaron por completo para reducir el volumen y para eliminar las sales de formiato de amonio volátiles, a continuación, se resuspendieron en 9 l de 2% (v /v) de acetonitrilo, 0,1% (v /v) de ácido trifluoroacético y se filtró antes de la de fase inversa C18 separación nanoflujo-LC. Para la segunda dimensión de la separación por inversa nanoflujo fase LC, cada fracción SCX se inyectó de forma automática en una columna Chromolith CapRod (150 x 0,1 mm, Merck) utilizando un circuito de inyección 5 l en un sistema MALDI Spotting Tempo LC (ABI-SMD /Sciex) . Tampón C era 2% de acetonitrilo, 0,1% de ácido trifluoroacético, y el Tampón D era 98% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético al 0,1%. El gradiente de elución fue de 95% C /D 5% (2 l por minuto caudal 0-3 min, luego 2,5 l por minuto de 3-8.1 min), 5% de D → D 38% (8,1 a 40 min), 38% D 80% → D (41-44 min), el 80% de D → D 5% (44-49 min) (condiciones iniciales). velocidad de flujo fue de 2,5 l /min durante el gradiente, y un flujo igual de solución de matriz de MALDI se añadió post-columna (7 mg /ml CHCA recristalizado (α-ciano-hidroxicinámico), 2 mg /fosfato de amonio ml, 0,1% trifluoroacético ácido, 80% de acetonitrilo). El eluyente combinado fue descubierto de forma automática en una placa de acero inoxidable de MALDI objetivo cada 6 segundos (0,6 l por punto), para un total de 370 puntos por fracción SCX originales.
Análisis de Espectrometría de Masas
La manchas de muestras se secaron y se añaden puntos de calibrador (ABI 4700 Mix) a cada placa de forma manual. Las placas diana de MALDI (15) se analizaron de una manera dependiente de datos en un ABI 5800 MALDI TOF-TOF después de la calibración. La espectrometría de masas (MS) espectros fueron adquiridos de cada punto de la muestra utilizando la calibración por defecto recién actualizado, usando 500 disparos de láser por punto. Una interpretación de toda la placa se realiza de forma automática para elegir el pico más alto de cada valor m /z observado para su posterior análisis tándem MS /MS. Hasta 2500 disparos de láser a una potencia del láser de 4200, con el aire de gas (CID) disociación inducida por colisión en el 1,2 a 1,3 x 10
-6 Torr se acumularon para cada MS /MS espectro. Después de la adquisición de MS y MS /MS, los espectros de las 15 placas de la muestra se utiliza para la identificación y cuantificación de proteínas usando el algoritmo de Paragon como se aplica en el software de proteínas Piloto 4.0 (ABI-Sciex) [18]. Los espectros se realizaron búsquedas en contra del subgrupo humano (más contaminantes comunes) de la base de datos NCBI no redundante concatenado con un "señuelo" invertido versión de la misma base de datos utilizando la última de estas bases de datos FASTA, obtenidos a partir de http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/entrez?db=Taxonomy & amp; cmd = Search & amp; = plazo. . (base de datos Ref Sec humano 20120204 secuencias que contienen 29766 secuencias de proteínas, además de 389 contaminantes de laboratorio común Los parámetros de búsqueda de proteínas piloto fueron: methanethiosulfonate de metilo (MMTS) residuos de cisteína alquilados, modificación iTRAQ 4-plex de lisina y N-terminal con una identificación centrarse en modificaciones biológicas y sustituciones de aminoácidos utilizando el esfuerzo de búsqueda exhaustiva. la estimación Tasa de Falso Descubrimiento (FDR) se determinó mediante la búsqueda en la base de datos de forma simultánea señuelo concatenada [19].
Pathway Analysis
los datos generados a partir el análisis de espectrometría de masas proteómica se analizaron mediante análisis Ingenuity Pathway (IAP; Sistema de Ingenio, ciudad de Redwood, CA, www.ingenuity.com) se utilizó la herramienta Ingenuity Knowledge Base para identificar las funciones biológicas y las vías canónicas que incluyen la intervención de las proteínas reguladas diferencialmente.. IPA es una base de datos actualizada periódicamente que utiliza el conocimiento actual disponible en los genes, las proteínas, los procesos celulares normales y patológicos, señalización y vías metabólicas, necesaria para la construcción de la vía.
Preparación de proteína para la Validación
la células PC3-N2 y PC3-ML2 fueron cultivadas a 80% de confluencia y separado usando EDTA 5 mM en PBS. Para la extracción de proteínas, las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron en modificado tampón RIPA [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 1% X-100, 0,25% de desoxicolato de sodio Triton] que contiene una proteasa cóctel inhibidor (Complete, Mini, Roche) a 4 ° C durante 15 min. Las muestras se sonicaron durante 1 min y se centrifugaron a 14.000 g durante 15 min a 4 ° C, y se recogió el sobrenadante. Cantidades iguales de proteína (proteína BCA kit de ensayo, Pierce) de cada muestra fueron separados en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico 4-12% Tris-glicina por electroforesis (SDS-PAGE), seguido de la transferencia Western blot para PVDF. Para el análisis Western, las proteínas a electroforesis se transfirieron a membrana de PVDF, se bloquearon con tampón de bloqueo Odyssey (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA), se sondearon con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Después del lavado, las membranas se incubaron con el conjugado respectivo IRDye anticuerpos secundarios y se visualizaron usando un sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey (Li-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska).
la transfección y silenciamiento de plectina y vimentina de siRNA
ARNsi dúplex se utilizaron para silenciar y plectina La expresión de vimentina. A no director 20-25 siRNA duplex se utilizó como control negativo. ARNsi dúplex se transfectaron en las líneas celulares PC3 con reactivo de transfección de ARNsi de acuerdo con las instrucciones del fabricante Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Después de la transfección durante 72 h, las células se sometieron a Western blot y análisis de inmunofluorescencia para detectar la eficacia de la vimentina y desmontables plectina y para determinar los efectos de la caída sobre la migración y las propiedades invasivas de las células.
Microscopía Confocal análisis
células PC3 y PC3-N2-ML2 fueron sembradas en placas de 6 pocillos que contienen cubreobjetos de vidrio y se cultivaron en un 10% de FBS /DMEM durante 2 días. Las células se lavaron con PBS enfriado en hielo, se fijaron con metanol enfriado con hielo durante 5 min. Posteriormente, las células fijadas se lavaron con PBS y se tiñeron con anticuerpos primarios contra plectina, vimentina, y CDK2 durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios se retiraron y las células se lavaron con PBS enfriado en hielo antes de la tinción con Alexa Fluor anticuerpos secundarios conjugados durante 1 hora a temperatura ambiente. TOPRO mancha se incluyó con los anticuerpos secundarios para la tinción nuclear. Los anticuerpos secundarios y manchas nucleares fueron lavados y las hojas de la cubierta montados a los portaobjetos con medio Vector Shield contiene la tinción DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA), y se sellaron con esmalte de uñas. Fluorescente imágenes fueron examinados y capturados utilizando un microscopio confocal (Carl Zeiss, Thornwood, NY).
Ensayo de proliferación celular
células PC3 y PC3-N2-ML2 en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10
4 células y transfectada con no focalización y plectina /siRNA específico vimentina a una concentración final de 20 nM. Ambos unidos y se recogieron las células flotantes después de centrifugación a baja velocidad y tripsinización. Las células se tiñeron con azul de tripano, y el número de células de azul de tripano-positivas fueron contados los días 2, 4, 6 después de la transfección.
Ensayo de Scratch /Curación de Heridas Invasión Ensayo
La migración capacidad de las dos líneas celulares se evaluó por un ensayo de cicatrización de heridas. Brevemente, las células PC3-N2 y PC3-ML2 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10
5 células y se transfectaron con los no-focalización y plectina /siRNA específico vimentina a una concentración final de 20 nM para 72 horas. Una herida artificial fue creado cuidadosamente a 0 h usando una punta de pipeta 200 l rayar la monocapa de células confluentes por triplicado para cada condición. Las células se lavaron con PBS y se cultivaron en 10% de FBS-DMEM a 5% de CO2 y 37 ° C. Una fotomicrografía fue tomada inmediatamente después del rascado (tiempo 0 h) y 24 h más tarde bajo 10 × lente objetivo utilizando un Zeiss invertido AxioObserver.A1 de contraste de fase microscopio (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Las distancias de migración en los pocillos por triplicado y se midieron los valores de media y el error estándar de comparación entre el control y el plectina y las células vimentina desmontables.
Trans-así los ensayos de migración
Para investigar la capacidad de invasión de las las dos líneas celulares, se utilizó un sistema de cultivo de invasión de membrana como sigue. Las células que tratados previamente con ARNsi de control o vimentina y siRNAs plectina se mueren de inanición durante la noche en medio DMEM con 0,5% de FBS, a continuación, se trataron con tripsina y se resuspendieron en DMEM que contenía 0,5% de albúmina de suero bovino. Las células (1 × 10
5) se añadieron a las cámaras superiores de placas de 24 pocillos Transwell (Corning, 8 micras de tamaño de poro), y DMEM con 10% de SFB y se añadió LPS a las cámaras inferiores. cámaras inferiores se rellenaron con medio de cultivo que contenía 0,5% de FBS como un control o con un contenido 10% LPS como un atrayente. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 24 horas. Al final del período de incubación, la superficie superior de la membrana se limpió con un aplicador de punta de algodón para eliminar las células no migratorias. Las células que migraron a lado inferior de la membrana se fijaron y se tiñeron con hematoxilina para visualizar los núcleos. Las células se cuantificó contando cinco campos de alta potencia por debajo de 100 × magnificación, y los medios para cada cámara se determinaron por triplicado. invasión porcentual se representa como media del número de células que migran a través de la membrana para el plectina y células vimentina silenciado en relación con el siRNA no la focalización.
Correlación de plectina y vimentina expresión usando proteoma humano Atlas
la base de datos Human Protein Atlas muestra los patrones de expresión y localización de las proteínas en una gran parte de los tejidos y órganos humanos con énfasis en las estrategias para la validación basada inmunohistoquímica patrones de expresión de proteínas para los proyectos de investigación del cáncer. Los objetivos finales del proyecto incluyen la creación de una base de datos de información de los patrones de expresión de proteínas en tejidos humanos normales, en las células y en el cáncer, y la utilización de anticuerpos generados y los datos de expresión de la proteína como herramientas para identificar biomarcadores de utilidad clínica [20], [21] .La base de datos contiene imágenes de alta resolución, con apuntes sobre un patólogos certificados. Human Protein Atlas se utilizó para la detección de la expresión de vimentina plectina y centrándose en inmunohistoquímica de tejidos normales y cancerosas de la próstata. Estos análisis comparativos en combinación con los datos obtenidos en el presente estudio serán la base de las futuras investigaciones de hipótesis impulsada sobre el papel de estas proteínas en la progresión de la enfermedad del cáncer de próstata.
Análisis estadístico
Cada una de estos experimentos se realizó por triplicado. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (S.E.M.). El análisis estadístico se realizó mediante el SPSS 13,0 software estadístico (SPSS, Inc. Chicago, IL, EE.UU.).
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Identificación de proteínas expresadas diferencialmente en PC3 y PC3-N2-ML2 líneas celulares utilizando iTRAQ Etiquetado y 2D CL-EM /MS
Hemos analizado el proteoma de la célula de cáncer de próstata PC3 singénico-N2 y PC3-ML2 por 2D LC-MS /MS utilizando iTRAQ, para generar datos de proteínas expresadas diferencialmente. El flujo de trabajo experimental en general se muestra en la Figura complementario S1. Un total de 1756 no redundante proteínas se identificaron en varias ocasiones por duplicado iTRAQ etiquetado y análisis 2D LC-MS /MS, el 95% de los cuales fueron identificados con & gt; 2 partidos de péptidos. La tasa de falso descubrimiento (FDR) para la identificación de proteínas basada en la búsqueda contra una base de datos invertido fue de 1%. La información detallada, incluyendo la información de secuencias de péptidos, proteínas fecha de la cuantificación, la relación media iTRAQ y péptidos distintos y comunes con un grupo de proteínas de estas proteínas identificadas se muestra en la Tabla S1. Para identificar las proteínas expresadas diferencialmente en PC3-N2 y PC3-ML2 que puede estar relacionado con la invasión y la metástasis, se compararon los perfiles de expresión de proteínas entre las dos líneas celulares. Las proteínas que cumplían los siguientes criterios fueron considerados con confianza como proteínas expresadas diferencialmente: (i) las proteínas se identificaron en varias ocasiones por los experimentos por duplicado; (Ii) las proteínas fueron identificadas con base on≥2 péptidos; (Iii) las proteínas mostraron una or≤0.667 change≥1.5 relación de veces promedio en los experimentos duplicados entre las dos líneas celulares (
t
prueba,
p
& lt; 0,05). Utilizando estos criterios, se encontró que 130 proteínas que se expresó diferencialmente en PC3-N2 y células PC3-ML2. De estas proteínas, 62 resultaron ser regulada hasta-68, mientras que se redujeron reguladas. Los nombres de estos 130 proteínas y sus niveles de expresión se muestran en la Tabla S1. Algunos de los espectros MS /MS se utiliza para la identificación y cuantificación de PLEC1 y VIM con significativamente elevados cambios de relación de veces en las células PC3-ML2 comparación con las líneas PC3-N2 se muestran en las figuras 2A y S S 2B. El espectro de MS /MS para GAPDH, que no tienen cambios veces en las dos líneas celulares se muestra en la Figura 2C S. EphA2 es un ejemplo de una proteína que es el regulado en el PC3-ML2 vs PC3-N2 y esto se muestra en la Figura 2D S. Se observó una alta concordancia entre las dos intensidades de iones reportero de un péptido dado para prácticamente todos los péptidos identificados. El factor de cambio promedio para una proteína se obtuvo mediante el uso de todos los péptidos que identifican esa proteína. Por lo tanto nuestras identificaciones de proteínas y cuantificación son consistentes y de alta confianza. Este subconjunto de 130 proteínas reguladas diferencialmente se utilizó para todos los posteriores análisis de la bioinformática, las anotaciones biológicas e interpretación.
Pathway Analysis
Usando el software Ingenuity las proteínas reguladas diferencialmente se les asignó una localización subcelular, molecular y funciones celulares, y su posible implicación en enfermedades y trastornos. Las figuras 1A, B y C muestran su localización subcelular, sus funciones celulares y moleculares, así como las principales enfermedades y trastornos que representan, respectivamente. Tablas S2 y S3 se resumen las diferentes categorías funcionales y sus valores de p. Nuestros resultados indican que las proteínas reguladas diferencialmente entre las dos líneas celulares de cáncer de próstata singénicas son principalmente involucrados en el cáncer, las enfermedades dermatológicas, trastornos genéticos, enfermedad gastrointestinal, y la enfermedad inmunológica. Con la herramienta de base de conocimientos IPA, hemos identificado las principales redes y vías canónicas que sugieren posibles las principales funciones de las proteínas que se expresan diferencialmente en las dos líneas celulares. Como se indica en la Tabla S4 y S3 figura, la red superior es la morfología celular, el desarrollo y la función del tejido conectivo, y el movimiento celular.
funciones se utilizó el análisis de la base de conocimiento de Ingenuity para determinar la localización subcelular, moleculares y biológicos y los procesos de enfermedades que están asociadas con las proteínas que son regulados diferencialmente entre células PC3-ML2 PC3-N2 y. El número de proteínas se muestran en el eje X y en los cuadros S2 y S3.
Validación de los expresados diferencialmente las proteínas identificadas por Proteómica
Entre las 130 proteínas con expresión alterada, nos centrado en dos proteínas plectina y vimentina, que fueron regulados al alza muy significativa en PC3-ML2 vs PC3-N2. Además, sus niveles de expresión no han sido bien estudiados en el cáncer de próstata. Western Blot se realiza para detectar los niveles expressional de las dos proteínas en los experimentos por triplicado. Como se muestra en la Figura 2, y los niveles de expresión PLEC1 VIM se incrementan significativamente en PC3-ML2 vs PC3-N2, que es coherente con los datos de análisis de EM. Los niveles relativos de expresión de vimentina plectina normalizada y con un nivel de GAPDH se indican al lado de la imagen de Western Blot. En los análisis complementarios, ensayos de inmunofluorescencia verificar eficiente derribando de la plectina y más validan los datos de espectrometría de masas tal como se muestra en la Figura 3 panel A, donde se muestra la intensidad de la tinción plectina ser significativamente altamente expresado en PC3-ML2 comparación con PC3-N2. Lo mismo se observó para las células vimentina desmontables (Figura S4)
Un total de lisados celulares (40 microgramos) de células N2 y ML2 se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas separadas se analizaron mediante análisis de transferencia Western para detectar plectina y vimentina como se describe. detección de GAPDH se incluyó como control de carga.
Las células fueron tratadas con el control de siRNA o siRNA específico del gen plectina durante 3 días y después se fijaron, se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-plectina y monoclonal de ratón anti-CDK2 primaria anticuerpos antes de "manchas" con Alexa Fluor burro conjugado anti-conejo anticuerpos secundarios (verde), de cabra anti-ratón de anticuerpos secundarios (rojo) y la tinción nuclear TOPRO (azul). El panel A muestra las imágenes de las células transfectadas control de siRNA y el Panel B muestra las células transfectadas plectina siRNA.
plectina y vimentina derribo inhibe la proliferación de PC3-ML2 Líneas Celulares
Hemos examinado si plectina y vimentina contribuyen a la proliferación celular en el cáncer de próstata utilizando la técnica de RNAi. Después de la introducción de plectina y vimentina siRNA en células PC3-ML2 durante 72 h, la supresión de plectina y vimentina fueron confirmados por Western Blot, mientras que el siRNA de control no la orientación no tuvo ningún efecto significativo sobre plectina endógena y la expresión de vimentina (Figura 4). La expresión de vimentina plectina y se redujeron en 72% y 99,9%, respectivamente, en comparación con los controles (
p
& lt; 0,05). La expresión relativa de GAPDH en los controles y plectina /vimentina dirigida caídas siRNA son idénticos. La proliferación de células PC3-ML2 fue examinado por recuento de células de 2-6 días después del tratamiento siRNA. Nuestros datos muestran que la proliferación celular se redujo significativamente por tanto plectina y desmontables vimentina (Figura 5). Los datos de los ensayos complementarios no muestran diferencias significativas en la viabilidad de las dos líneas celulares (Figura S5).
Las células fueron tratadas con el control de siRNA, plectina o gen vimentina siRNA. Los lisados de células totales (40 g) de células ML2 se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas separadas se analizaron mediante análisis de transferencia Western para detectar plectina y vimentina como se describe. También se agradece a los Dres.