Extracto
XB130, una nueva proteína adaptador, promueve el crecimiento celular mediante el control de expresión de muchos genes relacionados. Los microARN (miARN), que son con frecuencia mis-expresadas en células de cáncer, regulan la expresión de genes específicos. En el presente estudio, que tuvo como objetivo explorar el mecanismo oncogénico de XB130 través de la regulación de miRNAs. Se analizó la expresión de los genes miARN en XB130 corto horquilla RNA (shRNA) las células del cáncer de tiroides WRO transfectadas de forma estable mediante un ensayo de matriz miARN, y 16 miRNAs fueron reguladas y 22 miRNAs se redujeron reguladas de manera significativa en estas células, en comparación con las no transfectadas o control negativo shRNA células transfectadas. Elegimos tres de los miRNAs hasta reguladas (miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p) y les validado por tiempo real QRT-PCR. sobreexpresión ectópica de XB130 suprimió estos 3 miRNAs en células de MRO, una línea celular con muy baja expresión de XB130. Por otra parte, transfectadas imita miR de estos 3 miRNAs en células WRO. Ellos regulan negativamente la expresión de oncogenes (miR-33a: MYC, miR-149: FOSL1, miR-193a-3p: SLC7A5), apuntando a su región no traducida 3 ', y redujeron el crecimiento celular. Nuestros resultados sugieren que XB130 podría promover el crecimiento de las células cancerosas mediante la regulación de la expresión de miRNAs supresores tumorales y sus genes diana
Visto:. Takeshita H, Shiozaki A, Bai XH, Iitaka D, Kim H, Yang BB, et Alabama. (2013) XB130, una proteína Nuevo adaptador, regula la expresión de un tumor supresor microARN en células de cáncer. PLoS ONE 8 (3): e59057. doi: 10.1371 /journal.pone.0059057
Editor: Laszlo Buday, Academia de Ciencias de Hungría, Hungría
Recibido: 6 Octubre 2012; Aceptado 11 de febrero de 2013; Publicado: 19 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Takeshita et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (CIHR) subvenciones de funcionamiento RP-13270, RP-42546 y RP-119514. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
proteína asociada de filamentos de actina (AFAP) es una pequeña familia de proteínas adaptadoras implicadas en la transducción intracelular de la señal, la organización del citoesqueleto, la motilidad celular y otras funciones celulares. Incluye AFAP [1], AFAP1L1 (filamento de actina asociado proteína 1 como 1) [2], y XB130 (también conocida como proteína asociada a filamentos de actina 1-como 2, AFAP1L2) [3]. Ellos han demostrado para participar en la regulación de diversas vías de señalización mediante la formación de la proteína-proteína y /o complejos de proteínas-lípidos [1], [4], y, en determinadas circunstancias, estas proteínas adaptadoras pueden estar implicados en la tumorigénesis [5], [ ,,,0],. 6]
XB130 es un sustrato de tirosina quinasa, que puede ser fosforilada en tirosina por Src y otras tirosina quinasas [7] - [9], e interactuar con Src SH2 a través de su N-terminal y motivos de unión a dominio SH3 , y media la transactivación Src relacionadas de SRE y AP-1 [7]. La N-terminal de XB130 también contiene un motivo YxxM que puede unirse a la subunidad p85 de fosfatidil inositol 3-quinasa (PI3K) a través de sus dominios SH2, y posteriormente activar Akt [2], [8]. XB130 media la supervivencia y la proliferación celular a través de múltiples señales corriente abajo de Akt [9]. XB130 en células de cáncer de tiroides humanos regula el crecimiento del tumor como se muestra en un modelo animal con ratones desnudos, mediante la promoción de la proliferación celular y la inhibición de la apoptosis. Por otra parte, desmontables de XB130 reduce la expresión de muchos genes relacionados con la proliferación celular y /o la supervivencia [10]. XB130 también está implicado en la regulación de la migración celular [11]. Alteración de la expresión XB130 se ha observado en el cáncer humano de tiroides [10], cáncer de esófago [12], y el cáncer gástrico [13]. Por lo tanto, estos estudios requieren un examen más detenido de la función de XB130 en la tumorigénesis.
Los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes (aproximadamente 22 longitudes de nucleótidos), que puede interactuar específicamente con la región 3 'no traducida (3'UTR) de los ARNm específicos, inhibir la traducción de ARNm, o dar lugar a la escisión del mRNA y la degradación [14]. El número de miRNAs humanos reportados excede 2000 (miRBase, versión 18 en el Instituto Sanger), y miRNAs juegan un papel importante en el control de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación, el metabolismo y la proliferación [15] - [18]. Algunos miRNAs son frecuentemente mis-expresadas en células de cáncer, y recientemente se han identificado como nuevos factores relacionados con la oncogénesis y la progresión del tumor [19] - [22]. Varios estudios recientes se centran en la regulación de la expresión y función de los genes miARN en el cáncer [23] - [26], incluyendo el cáncer de tiroides [27] - [29].
Aunque XB130 puede regular la expresión de muchos genes relacionados con la célula la proliferación [10], y promueve la proliferación celular y la supervivencia a través de PI3K /Akt [9], se sabe poco sobre los mecanismos que subyacen a su regulación de la expresión génica. En el presente estudio, hemos tratado de determinar si XB130 podría regular la expresión de algunos de estos genes a través de la baja regulación de miRNAs supresores de tumores. Se examinó el nivel de expresión de los genes miARN utilizando XB130 corto horquilla RNA (shRNA) las células del cáncer de tiroides WRO transfectadas de forma estable, en comparación con las células no transfectadas o células transfectadas de forma estable con el control negativo shRNA. Por otro lado, transfectadas las células de cáncer de MRO que tienen muy baja expresión de XB130 con el plásmido XB130 para mejorar su expresión. Se identificaron tres miRNAs supresores tumorales y estudiar más a fondo, en cuanto a la expresión de sus genes diana, la proliferación celular y la apoptosis.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
tiroides humana carcinoma de células y células WRO MRO fueron del Dr. S. Asa (Universidad de Toronto, Toronto, Canadá) [30], que obtuvo estas células del Dr. J. Fagin (Centro de cáncer Memorial Sloan-Kettering, Nueva York, Nueva York, EE.UU. ). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de FBS, aminoácidos no esenciales (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) 1 mmol /L de piruvato y, y 1% de penicilina-estreptomicina. Hemos establecido con anterioridad células WRO que están transfectadas establemente con plásmidos shRNA para XB130. (C3-1 y C3-4 se establecieron a partir vector C3; C4-3 y C4-11 se establecieron a partir C4 vector) y control negativo shRNA plásmido (NC1, NC9 y NC12) se establecieron previamente [10]. Se añadió G418 (0,25 mg /ml) al medio de cultivo de las células transfectadas para mantener la selección. Las células se cultivaron en un incubador humidificado estándar a 37 ° C con 5% de CO
2.
Estudios de proteínas y Western Blotting
Western blot se realizó de acuerdo a los procedimientos como se describe anteriormente [ ,,,0],31], [32]. En resumen, las células se lisaron con tampón de ensayo de precipitación radioinmune modificado (50 mmol /L de Tris-HCl, pH 7,5; 150 mmol /l de NaCl; 2 mmol /L EGTA; 2 mmol /l de EDTA, y 1% de Triton X-100) que contiene 10 g /ml cada uno de aprotinina, leupeptina, pepstatina, 1 mmol /L fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mmol /L Na
3Vo
4 y 10 mmol /L NaF. Las concentraciones de proteína se midieron por Pierce® BCA kit de ensayo de proteínas (Thermo, Rockford, IL, EE.UU.).
Los lisados celulares que contienen la misma cantidad de proteínas totales fueron separados por SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron sondadas con los anticuerpos indicados. Las proteínas fueron reveladas por SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato (Thermo). Las intensidades de las bandas de proteína se cuantificaron utilizando el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Se generaron anticuerpos
monoclonal XB130 como se describe anteriormente [7]. Los anticuerpos para β-actina, MYC, CEBPG, FOSL1, SCL7A5, DECR1, SETD8 fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.). El anticuerpo anti-PCNA vino de Abcam (Toronto, ON, Canadá). Anti-Ki-67 (clon Ki-S5) vino de Cedarlane (Burlington, ON, Canadá).
Microscopia y Análisis de inmunofluorescencia
Para la tinción de inmunofluorescencia, las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio pre tratados con 50 mg /ml de poli-L-lisina. Después de la adhesión, las células se fijaron rápidamente por 4% de paraformaldehído durante 20 min y se lavaron con PBS. Las células se permeabilizaron con 0,1% Triton-X-100 durante 10 min y se bloquearon con 1% de BSA durante 1 h. Los cubreobjetos se incubaron a continuación con el anticuerpo primario contra XB130 durante 2 h, seguido por lavado e incubación con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) durante 1 h. Los cubreobjetos se tiñeron también para la F-actina con Oregon Green 488 faloidina (Invitrogen) durante 1 h y de núcleo con colorante Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 10 min. Los cubreobjetos se lavaron con PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando Dako montaje de fluorescencia media (Dako, Mississauga, ON, Canadá). La tinción se visualizó usando un microscopio Olympus IX81.
Array microARN y Análisis de Datos
Cuatro XB130 shRNA clones transfectados de manera estable (C3-1, C3-4, C4-3 y C4-11) se utilizaron como XB130 desmontables células. Se utilizaron células WRO y tres clones de control shRNA transfectadas de forma estable negativos (NC1, NC9 y NC12) para la comparación. ARN total fue extraído por medio de mirVana ™ miARN Kit de aislamiento (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). Se utilizó el número de la integridad del ARN determinado por el Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) como una medida de la calidad del RNA. de perfiles de expresión de miARN se llevó a cabo utilizando el sistema de miARN microarrays de Agilent Humanos (Agilent Technologies) con un G3 SurePrint 8 × 60 K plataforma V16 de 1.205 miRNAs humanos (miRBase liberación 16,0). En pocas palabras, 100 ng de ARN total se marcaron con Cyanine 3-PCP y hibridizada en las matrices a 55 ° C durante 20 h. Las láminas fueron escaneados con un escáner G2505C Agilent Technologies, y las imágenes escaneadas fueron analizados utilizando Agilent extracción de características versión 10.7.3. análisis de expresión diferencial y análisis de agrupamiento jerárquico se realizó a través GeneSpring GX 11.5 (Agilent Technologies).
Predicción objetivo de miRNAs
TargetScan 6,0 (http://www.targetscan.org/), microARN .org (http://www.microrna.org/), PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/), y Diana-microt v4 /TarBase 5.0 (http: //diana.cslab.ece. ntua.gr/DianaTools/) se utilizaron para la búsqueda de objetivos de predecir miRNAs.
cuantitativa en tiempo real
El ARN total se extrajo usando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia RT-PCR para XB130
, CA, EE.UU.), y se sintetizó ADNc a partir del ARN total usando el kit High Capacity cDNA RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). RT-PCR cuantitativa para XB130 se realizó utilizando el kit de SYBR Green I Maestro PCR sobre LightCycler480 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. SDHA fue utilizado como un gen de referencia interna para los análisis. Los cebadores de PCR para XB130 y SDHA son: XB130_forward 5'-AGCACAGCACTGGTGAAGAA-3 ', 5'-XB130_reverse GTTGCTTGTTGATGGTCACT-3', 5'-SDHA_forward CGGCATTCCCACCAACTAC-3 'y 5'-SDHA_reverse GGCCGGGCACAATCTG-3'. La expresión de XB130 se normalizó utilizando el método 2-ΔΔCT en relación con SDHA. El Ct se calcula restando los valores de Ct de SDHA a partir de los valores de Ct de la XB130. factor de cambio en el gen se calculó mediante la ecuación 2-Ct [33]. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. La media de la expresión de la relación XB130 /SDHA en las células WRO se establece en 1 y los resultados se expresaron como media y desviación estándar de pliegue de cambios XB130.
cuantitativa en tiempo real RT-PCR para la pri-miRNAs y miRNAs maduro
Para cuantificar la expresión de la pri-miARN y miARN maduros, el ARN total fue extraído por medio de mirVana ™ miARN Kit de aislamiento (Ambion). En cuanto a la cuantificación de la pri-miRNAs, el cDNA fue sintetizado utilizando alta capacidad de cDNA RT kit (Applied Biosystems). En tiempo real las reacciones de PCR se realizaron utilizando un TaqMan Universal Master Mix II y los TaqMan® pri-miARN ensayos específicos para la cuenta-mir-33a, tiene-mir-149 y tiene-MIR-193a-3p en un 7900 en tiempo real sistema de PCR (Applied Biosystems).
en cuanto a la cuantificación de los miRNAs maduros, un kit TaqMan RT microARN y TaqMan ® Micro RNA ensayos específicos para hsa-miR-33a, tiene-miR-149 y miR-tiene 193a-3p (Applied Biosystems) se utilizaron para reacciones de RT. En tiempo real las reacciones de PCR se realizaron usando un TaqMan® Universal Master Mix II y los ensayos TaqMan® microARN en un sistema de PCR 7900 en tiempo real (Applied Biosystems). En ambos cuantificaciones, RUN6B (U6) se evaluó como control endógeno, y los resultados se normalizó utilizando el método 2-ΔΔCT mismo que en tiempo real QRT-PCR para XB130.
Cell Transfección
Generación del plásmido de GFP-solo, GFP-etiquetados XB130 (GFP-XB130) y su N-terminal mutante de deleción (GFP-XB130ΔN) se describe anteriormente [11]. células de MRO se transfectaron transitoriamente utilizando 60 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en un plato de 100 mm como se describe en las instrucciones del fabricante. El medio que contiene el plásmido se reemplazó con medio fresco 24 h después de la transfección, y las células positivas para GFP se aislaron por células activadas por fluorescencia (FACS) Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA) 48 horas después de la transfección. células GFP positivas luego se utilizaron para ensayos de transferencia y la proliferación celular occidentales.
mirVana ™ miARN Mimic de miR-33a, miR-149 y miR-193a y mirVana ™ miARN Mimic Control Negativo#1 se obtuvieron comercialmente (Ambion ). WRO células fueron transfectadas con 50 pmol de miR imitan utilizando Lipofectamine 5 l 2000 (Invitrogen) en una placa de 6 pocillos de acuerdo con el protocolo del fabricante. El medio que contiene el plásmido se sustituyó por medio fresco 24 horas después de la transfección y el ARN total y proteínas se extrajeron 48 h después de la transfección.
luciferasa reportero de ensayo
secuencias de semillas de miR-33a, MIR -149 y miR-193a-3p y emparejando secuencias 3'UTR de MYC, FOSL1 y SLC7A5 fueron predichas por TargetScan. 3'UTR secuencias fueron clonados aguas abajo de la luciferasa de luciérnaga de pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target vector de expresión y verificadas por secuenciación (Promega, Madison, WI, EE.UU.). El pmirGLO construir y el MIR imitan o control de miR imitador se co-transfectaron en células WRO cultivadas en placas de 96 pocillos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las actividades de luciferasa de Renilla y luciérnaga se midieron usando un sistema Dual Luciferase reportero de ensayo (Promega). La luciferasa de luciérnaga se normalizó a Renilla actividad luciferasa. La media de la actividad de la luciferasa de luciérnaga relación /Renilla en células WRO co-transfectadas con cada uno de los pmirGLO construyen y controlan el miR mímica se establece en 1. Los datos se expresaron como media y desviación estándar de cinco experimentos independientes.
proliferación celular y la apoptosis Ensayos
células WRO se sembraron en pocillos de placas de microtitulación quíntuples 96 pocillos (100 l /pocillo) para el ensayo de proliferación de células, en placas de microtitulación de 12 pocillos (1 ml /pocillo) para el recuento de células ensayo, y en 6 pocillos placas de microtitulación (2 ml /pocillo) para el ensayo de apoptosis, a 5 × 10
4 células /ml y se cultivaron durante 24 h. Las células fueron luego transfectadas con miRNA mimic como se describe anteriormente.
La proliferación celular se evaluó utilizando Una solución CellTiter 96® Aqueous Ensayo de proliferación celular (Promega) en cada punto de tiempo (0, 24, 48, y 72 h) después de la transfección. Después reemplazado con medio fresco, se añadieron 20 l de la solución de un reactivo CellTiter 96® acuosa en cada pocillo y las placas se incubaron a 37 ° C durante 2 h en una atmósfera humidificada, 5% de CO
2 atmósfera. La absorbancia de las muestras se leyó a 490 nm con un lector de placas automático (Thermo). se restó la absorbancia de fondo de medio solo. El índice de proliferación se calculó como la absorbancia media de las células en el punto de tiempo indicado dividido por la absorbancia media de las células en 0 h después de la transfección y se expresan como media y desviación estándar. En ensayo de recuento de células, las células se separaron de los matraces con una solución de tripsina-EDTA y se contaron mediante un hemocitómetro en cada punto de tiempo. El número de células se expresaron como media y desviación estándar
En ensayo de apoptosis, las células transfectadas se cosecharon 72 h después de la transfección y se tiñeron con isotiocianato de fluoresceína conjugado de anexina V y fosfatidilinositol (PI), el uso de anexina V. - Kit FITC (Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante y analizado por BD AccuriTM C6 citómetro de flujo (BD Biosciences, San Jose, CA).
resultados
Caracterización de las células transfectadas de forma estable XB130 shRNA WRO
Para estudiar el papel de los XB130 en la regulación de las actividades celulares WRO, que transfectadas establemente las células con shRNA orientación XB130. Expresión de XB130 fue significativamente menor en estos clones (C3-1, C3-4, C4-3 y C4-11) que la de las células no transfectadas WRO y otros tres clones transfectados de manera estable con un control negativo shRNA (NC1, NC9, NC12), como se determina mediante transferencia Western (Fig. 1A) y por cuantitativa en tiempo real RT-PCR (Fig. 1B). La expresión de ARNm SDHA se utilizó como gen de mantenimiento de QRT-PCR (Fig. 1B), ya que su expresión no cambia bajo diferentes condiciones experimentales [10], [34], [35]. Curiosamente, XB130 desmontables células mostraron morfología alargada cuando se examina con el microscopio de contraste de fase. Además, la tinción immunofluorecence reveló que la expresión de XB130 en células C3-1, C3-4, C4-3 y C4-11 era apenas detectable, y la tinción de actina F también mostró morfología alargada en los niveles de células individuales (Fig. 1C, La Fig. S1)
se examinaron los siguientes elementos:. células WRO (WRO), control negativo shRNA transfectaron células WRO (NC1, NC9 y NC12) y XB130 shRNA transfectaron células WRO (C3-1, C3-4 , C4-3 y C4-11). (A) XB130 shRNA reduce eficazmente los niveles de proteína XB130. (B) cuantitativa en tiempo real RT-PCR reveló que la expresión de mRNA en XB130 XB130 shRNA transfectadas células WRO fueron significativamente más bajos que las células WRO (* P & lt; 0,05). (C) WRO, NC9 y C3-1 eran inmunes teñidas con un anticuerpo XB130 y counterstained para la F-actina y los núcleos con Oregon Green 488 faloidina y Hoechst 33342. La expresión de proteínas en el citoplasma XB130 desaparecido en las células transfectadas XB130 shRNA.
células de expresión de microARN de perfil en XB130 shRNA transfectadas
Para identificar miRNAs regulados por XB130, se realizó un ensayo de perfil de expresión de los genes miARN, comparando XB130 shRNA células transfectadas de forma estable WRO (C3-1, C3-4, C4-3 y C4-11) con los controles (WRO, NC1, NC9 y NC12) utilizando un ensayo de matriz de microARN. El análisis GeneSpring GX mostró que 38 miRNAs se han cambiado de manera significativa por la caída estable de XB130 en las células WRO (valor de p & lt; 0,05), de los cuales, 16 fueron reguladas (Tabla 1) y se redujeron regulado 22 (Tabla S1) en XB130 shRNA células transfectadas.
para determinar los mecanismos por los cuales XB130 regula la proliferación celular, nos centramos en los miRNAs reprimidos por XB130 y seleccionamos el miR-33a, miR-193a-3p y miR-149 para su posterior análisis , que se ha informado para mostrar funciones supresores de tumores en varios tipos de cáncer [36] - [38]. Para comprobar los efectos de XB130 de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p, que cuantifica los niveles de estos 3 miRNAs utilizando en tiempo real QRT-PCR. Tanto el miARN maduro (Fig. 2A) y los niveles de pri-miARN (Fig. 2B) de estos tres miRNAs en XB130 shRNA transfectadas de forma estable células WRO (C3-1, C3-4, C4-3 y C4-11) fueron significativamente mayores que los de las células no transfectadas WRO o células establemente transfectadas con shRNA control negativo (NC1, NC9 y NC12)
.
las formas maduras (a) y transcritos primarios (B) de miR-33a, miR 149 y miR-193a-3p son significativamente mayores en XB130 shRNA transfectadas las células WRO (C3-1, C3-4, C4-3 y C4-11) que en WRO (* P & lt; 0,05) guía empresas
expresión XB130 ectópico suprimido formas primarias y maduros de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p
Para confirmar aún más los efectos reguladores de XB130 sobre la expresión de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p, se realizó un estudio de "rescate" en las células de MRO, que tienen muy baja expresión XB130 según lo determinado por el Western Blot. Células transfectadas con plásmidos que expresan MRO GFP-solo, GFP-XB130, o su N-terminal mutante de deleción, GFP-XB130ΔN. células GFP positivas se recogieron por FACS, y la expresión de GFP-XB130 y proteínas GFP-XB130ΔN en las células transfectadas MRO fue demostrado por transferencia de western (Fig. 3A). En contraste con las células WRO, células MRO mostraron significativamente más altos niveles de expresión de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p, tanto en las formas maduras y primaria. XB130-GFP sobreexpresión dio lugar a una regulación por disminución significativa tanto de miRNAs maduros y pri-miRNAs, mientras que la sobreexpresión de GFP-XB130ΔN no provocó tales efectos (Fig. 3B y C). Puesto que el N-terminal de XB130 contiene motivos funcionales que pueden interactuar con Src [7] y la subunidad p85 de PI3K [8], la falta de efectos de este mutante sugiere que los efectos de "rescate" de GFP-XB130 pueden estar relacionados con Src y mecanismos relacionados /o PI3K. El hecho de que tanto en el plano maduros y pri-miARN estaban regulados de manera similar por XB130 sugirió que XB130 afectado estos tres miRNAs al menos parcialmente en el nivel transcripcional.
MRO células fueron transfectadas con el vector GFP sola, o GFP-XB130 , GFP-XB130ΔN (XB130 N-terminal supresión mutante). células GFP positivas se recogieron por FACS. (A) de Western blot reveló que las células expresan MRO muy bajo XB130. La transfección de GFP-XB130 (MRO-XB130) o GFP-XB130ΔN (MRO-XB130ΔN) mostró XB130 expresión en células de MRO. Las formas maduras (B) y transcritos primarios (C) de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p fueron examinados por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Estos miRNAs y pri-miARN en las células de MRO fueron significativamente mayores que la de las células WRO, y redujo significativamente por la sobreexpresión de GFP-XB130, pero no por GFP-XB130ΔN. * P & lt;. 0,05 en comparación con las células WRO
sobreexpresión de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p reducido Targeted-Stream Down proteínas relacionadas con la proliferación de células
se informó anteriormente de que en XB130 shRNA transfectadas establemente células WRO, 57 genes relacionados con la proliferación celular o la supervivencia se alteraron de manera significativa, y la mayoría de estos genes se redujeron reguladas por XB130 shRNA [10]. Especulamos que entre estos genes, algunos son objetivos de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p. Usando TargetScan 6.0, microRNA.org, PicTar, y v4 DIANA-microt /TarBase 5.0, identificamos MYC y CEBPG como candidatos de genes diana de miR-33a, CEBPG y FOSL1 de miR-149, SLC7A5, DECR1 y SETD8 de miR 193a-3p. Para evaluar si en realidad estos miRNAs regulan la expresión del candidato objetivos, transfectadas en células de miR imitan WRO. La transfección de estos tres imita miR aumentó significativamente los niveles de miRNAs respectivas (Fig. 4A), pero no afectó los niveles de proteína XB130 (Fig. 4B). En comparación con las células WRO, los niveles de proteína de MYC, FOSL1 y SLC7A5 fueron más bajos en XB130 shRNA células transfectadas de manera estable (C3-1 como un ejemplos) (Fig. 4C-E). La sobreexpresión de miR-33a resultó en una disminución de los niveles de proteína myc (Fig. 4C). Del mismo modo, la sobreexpresión de miR-149 reguladas por los niveles de proteína FOSL1 (Fig. 4D), y la sobreexpresión de miR-193-3p las reguladas niveles de proteína SCL7A5 (Fig. 4E). El imitador control negativo (Cont-m) no afectó a estas tres proteínas (Fig. 4C-E). Los niveles de proteína de CEBPG, DECR1 y SETD8 no se modificaron por la sobreexpresión de estos miméticos de miR (datos no mostrados).
(A) Transfección de imita miR (33a-m, 149 m y 193a-m) significativamente aumento de la respectiva miARN expresión, mientras que el control de miR mímica (cont-m) no tenía tal efecto, tal como se cuantifica por tiempo real RT-PCR cuantitativa. (B) transferencia de Western muestra que la transfección de MIR imitador no cambió XB130 niveles de proteína. (C-E) MYC, FOSL1 y SCL7A5 se predicen objetivo de miR-33a, miR-149 y miR-193-3p, respectivamente. El panel superior muestra ejemplos de que la expresión de la proteína diana predicho se redujo en un respectivo de miR imitan transfecciones como se determina por transferencia de Western. El panel inferior muestra la cuantificación de los niveles de expresión mediante densitometría.
Dado que la sobre-expresión de GFP-XB130 en las células MRO expresión de miR-33a, miR-149 suprimida, y miR-193a-3p ( Fig. 3A-3B), también a prueba si podría afectar posteriormente las proteínas específicas de su corriente abajo. Las transferencias Western mostraron que en comparación con las células de MRO GFP-solo transfectadas, las células transfectadas GFP-XB130 mostraron mayor MYC, FOSL1 y SLC7A5. En comparación con las células transfectadas GFP-XB130ΔN, los niveles FOSL1 y SLC7A5 fueron también claramente superior en GFP-XB130 células transfectadas (Fig. S2). Estos resultados apoyan los datos imitan miARN en células WRO.
miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p directamente orientadas sitio de unión en el 3'UTR de MYC, FOSL1 y SLC7A5, respectivamente
a continuación, utiliza el sistema reportero pmirGLO Dual-Luciferase para determinar si la reducción en MYC, FOSL1 y los niveles de SLC7A5 por la sobreexpresión de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p MIR mímica era a través de la 3'UTR sus ARNm específicos. Se identificó una complementariedad considerable, utilizando los algoritmos en TargetScan entre las secuencias dentro de las regiones de semillas de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p y las secuencias en el 3'UTR de MYC, FOSL1 y SLC7A5, respectivamente (Fig. 5A ). Se generaron las construcciones pmirGLO que contienen un indicador de luciferasa y la 3'UTR de cada uno de estos 3 genes. células WRO fueron co-transfectadas con las construcciones de pmirGLO y cada uno de los miméticos de miR o un control negativo MIR. La sobreexpresión de miR-33a reducido significativamente la actividad de la luciferasa de la pmirGLO construir con secuencias 3'UTR clonadas de MYC (Fig. 5B). Del mismo modo, la sobreexpresión de miR-149 y miR-193-3p redujo significativamente las actividades de luciferasa cuando las células fueron transfectadas con el constructo de luciferasa que contiene la 3'UTRs de FOSL1 y SCL7A5 (Fig. 5C y D). Estos resultados indican que estos 3 miRNAs podrían afectar a la expresión de los genes diana afines mediante la unión a sus 3'UTRs.
(A) secuencias de semillas de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p y el emparejamiento 3'UTRs secuencia de MYC, FOSL1 y SLC7A5 como se predijo por TargetScan se muestran. El pmirGLO construir con las secuencias clonadas 3'UTR (luc-MYC, luc-luc-FOSL1 y SLC7A5) y el MIR mímica (33a-m, 149 m y 193a-m) o controlar el miR mímica (cont-m) eran co-transfectaron en células WRO. (B) La sobreexpresión de miR-33a redujo significativamente la actividad de la luciferasa de la pmirGLO construir con secuencias clonadas 3'UTR de MYC (luc-MYC). Del mismo modo, la sobreexpresión de miR-149 y miR-193-3p redujo significativamente la actividad de la luciferasa de la luc-FOSL1 (C) y la luc-SCL7A5 (D), respectivamente.
Reducción de la proliferación celular por la sobreexpresión de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p
MYC, FOSL1 y SLC7A5 son conocidos por participar en la regulación de la proliferación celular. Dado que la transfección de cada uno de estos miméticos de miR-regulado respectiva proteína específica, que a continuación examinamos los efectos de estos miméticos de miR en la proliferación celular. La proliferación de células WRO se redujo por la transfección de MIR imitador de miR-33a, miR-149 o miR-193a-3p, como se determina por el ensayo MTT (Fig. 6A), o por el recuento de células (Fig. 6B), en comparación con el control de miR imitador células transfectadas a las 72 h después de la siembra de células. Además, la expresión de marcadores de proliferación celular, Ki-67 y PCNA, se reduce en cada uno de estos tres imita miR en comparación con las células WRO no transfectadas o células transfectadas con el control sinóptico (Fig. 6C). Por otra parte, la sobreexpresión de GFP-XB130 y extender menos de GFP-XB130ΔN aumento de la expresión de Ki67 en las células de MRO (Fig. S2).
El número de células viables se evaluaron mediante el ensayo de MTS (A) y el recuento de células (B) a las 24, 48, y 72 h después de la transfección de control de imitador (cont-m) y específica de miR imitador (33a-m, 149 m y 193a-m). La sobreexpresión de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p condujo a una reducción en la proliferación celular. (C) marcadores de proliferación celular, los niveles de PCNA y Ki-67, también se redujeron en el miR imitar las células tratadas (33a-m, 149 m, y 193a-3p). (D) La apoptosis se determinó por citometría de flujo utilizando PI /anexina V doble tinción. La sobreexpresión de miR-193a-3A inducida significativamente tanto la apoptosis temprana (anexina V positivo /negativo PI) y la apoptosis tardía (anexina V /PI doble positivo) en las células WRO. *: P & lt; 0,05
Para determinar si el número de células fue reducido debido a la apoptosis, se realizó citometría de flujo con PI /anexina V doble tinción.. células positivas anexina V representan principios de la apoptosis, mientras que las células positivas dobles anexina V y PI representan tarde apoptosis [10]. La sobreexpresión de miR-193a-3a (pero no otros dos miRNAs) indujo significativamente tanto la apoptosis temprana y tardía en las células WRO (Fig. 6D). Estos resultados sugieren que el número de células reducidos en miR-33a y miR-149 imita se deben principalmente a la inhibición en la proliferación celular, mientras que miR-193a-3p puede reducir la proliferación celular e inducir la apoptosis.
Discusión
en nuestro estudio anterior, el análisis de microarrays identificaron 246 genes que alteran significativamente por la forma estable tumbar de XB130 en células de cáncer de tiroides WRO. Especialmente, 57 de los 246 genes que están relacionados con la proliferación celular o la supervivencia, incluyendo muchos reguladores de la transcripción [10]. Se ha estimado que aproximadamente el 30% de todos los genes humanos puede ser regulada por miRNAs [39]. Las alteraciones en el procesamiento de miRNA contribuye a la tumorigénesis [40]. Por lo tanto, la hipótesis de que XB130 puede regular la expresión de miRNAs relacionados con el crecimiento y, posteriormente, controlar los genes relacionados con la proliferación celular y la supervivencia. Para evaluar esta hipótesis, analizamos la expresión de los genes miARN en XB130 células WRO desmontables. los datos del análisis de la matriz de microARN mostraron que 38 miRNAs se expresan de forma diferente en XB130 desmontables células. Entre ellos, nos centramos en el miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p que han sido reportados como miRNAs supresores de tumores en varios tipos de cáncer. MiR-33a desacelera la proliferación celular actuando a través de la inhibición de las células proto-oncogén del cáncer de colon Pim-1 en el linfoma y [36]. la expresión de miR-149 tiene una correlación directa con los oncogenes KCNMA1 y LOX en células de carcinoma de células renales [37]. Del mismo modo, el miR-193-3p dirige JNK1 e inhibe la progresión y la proliferación del ciclo celular en el cáncer de mama [38]. Hemos validado sobre regulación de miR-33a, miR-149 y miR-193a-3p en XB130 desmontables células por tiempo real QRT-PCR.
En los procesos de expresión de microARN, la ARN polimerasa II produce largas transcripciones primarias miARN llamada pri-miRNAs, que se recorta y se escinde por un complejo de múltiples proteínas que incluye Drosha y DICER1 para producir madurar miRNAs funcionales [41]. Como la expresión de los genes miARN está regulada todavía no está claro, sin embargo, se han sugerido varios mecanismos. Se ha demostrado que p53 era responsable de la maduración post-transcripcional de miR-16-1, miR-143 y miR-145, mientras que la expresión de las correspondientes pri-miRNAs no fue influenciado por p53 [25]. Como se informó en la Fig.