Extracto
En una estrategia de dos etapas, una inyección intraperitoneal (IP) de inyección de poli (etilenglicol) -
bloque
poli (ε-caprolactona) (PEG
b
-PCL) micelas que contienen paclitaxel (PTX), ciclopamina (CYP), y gosipol (GSP) a los 30, 30, y 30 mg /kg, respectivamente, resecados tejidos tumorales por 1,3 veces, sobre la base de la pérdida de la bioluminiscencia con & lt; 10% de cambio de peso corporal, y la apoptosis inducida en tumores peritoneales cuando se utiliza como la quimioterapia neoadyuvante (NACT) en un modelo de xenoinjerto de ES-2-luc-cojinete para el cáncer de ovario. En una segunda etapa, una sola (IV) la inyección intravenosa de la apoptosis de orientación GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-
b
micelas -PCL que contienen una sonda de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIR), dir (indotricarbocyanine 1,1-dioctadecyltetramethyl yoduro), dio lugar a una mayor acumulación de DiR peritoneal en la apoptosis inducida por ES-2-luc tejidos tumorales (
ex vivo
) en 1,5 veces en comparación con las moléculas de DiR entregados por metoxi PEG
b
micelas -PCL (no dirigido) a las 48 h después de la inyección IV en una segunda etapa. Como resultado, un tándem de PEG-
b
micelas -PCL permitieron la detección de alta resolución de
ca
. Los tumores de 1 mm de diámetro, lo que resulta en la resección de aproximadamente el 90% de los tumores, y un bajo índice de cáncer peritoneal (ICP) de
ca
. 7. Por lo tanto, un tándem de PEG-
b
micelas -PCL utilizados para NCAT y NIR imágenes de fluorescencia de la apoptosis inducida por el tratamiento quirúrgico para la orientación intraoperatoria puede ser una estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer de ovario metastásico.
Visto: Cho H, Cho CS, Indig GL, Lavasanifar a, Vakili MR, Kwon GS (2014) y polímero micelas de apoptosis-Targeted imágenes ópticas de cáncer y intraoperatoria Orientación quirúrgica. PLoS ONE 9 (2): e89968. doi: 10.1371 /journal.pone.0089968
Editor: Sung Kim Wan, Universidad de Utah, Estados Unidos de América
Recibido: 7 de noviembre de 2013; Aceptado 23 de enero de 2014; Publicado: 26 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Cho et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por los Institutos nacionales de Salud (R21 CA-161537) y el Centro de cáncer Carbone de la Universidad de Wisconsin-Madison. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es retratado como la enfermedad que susurra debido a los síntomas indolentes en las primeras etapas [1]. Desafortunadamente, no existen pruebas de detección eficaces: el cribado general de antígeno de cáncer en suero 125 (CA 125) o la ecografía transvaginal no permite la detección precoz del cáncer de ovario. En parte debido a las dificultades en el diagnóstico, el cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal [2]. La estrategia de tratamiento convencional para el cáncer de ovario consiste en un enfoque combinado que utiliza la cirugía citorreductora agresiva y (IV) la quimioterapia intravenosa (platino y taxanos análogos) [3].
En la última década, un beneficio potencial de la quimioterapia administrada a través de la intraperitoneal (ip) para el cáncer de ovario se ha visto en varios ensayos clínicos, y se ha puesto de manifiesto que la quimioterapia IP puede dar a las altas tasas de respuesta dentro del abdomen debido a la barrera de plasma peritoneal confinar la exposición de la quimioterapia a las superficies peritoneales, lo que resulta en una mayor drogas concentración en la cavidad peritoneal [3].
la cirugía es crítica para los pacientes con cáncer colorrectal y de ovario cánceres que se han extendido ampliamente a la cavidad peritoneal. Hay tres tipos de cirugía reductora que se han intentado para el tratamiento de pacientes con cáncer de ovario: (1) la cirugía de reducción de volumen primario (cirugía inicial), que ha sido en gran medida el enfoque estándar; (2) la cirugía reductora escalonada después de la quimioterapia neoadyuvante (NACT), reservado para los pacientes que no sean médicamente aptas para su funcionamiento inmediato o cuya metástasis extensa no puede ser resecado por primera vez; y (3) la cirugía de reducción de volumen secundario (cirugía adicional), para los pacientes que desarrollan cáncer de ovario recurrente quimioresistente [1]. Aunque el abordaje quirúrgico óptimo sigue siendo controvertido, es muy claro que los sistemas de imágenes intraoperatorias cáncer mejorados producirán un beneficio significativo para la citorreducción quirúrgica con éxito de cáncer de ovario. Aunque los enfoques radiológicos como la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RM) han sido de gran ayuda en la caracterización de tumores malignos dentro de la cavidad peritoneal, que no son útiles para la evaluación intraoperatoria. En contraste, imágenes de fluorescencia se ha demostrado tener éxito en ensayos preclínicos y clínicos como una técnica óptica que ofrecen imágenes en tiempo real de objetivos quirúrgicos (carcinomatosis peritoneal y cáncer de mama) con una resolución de imagen adecuada y una alta sensibilidad intraoperatoria [4] - [8] . Coll y sus colegas informaron que la cirugía en el infrarrojo cercano (NIR) de fluorescencia intraoperatoria guiada por imagen utilizando un péptido, balsa-c-focalización del tumor (RGDfK)
4-Alex Fluor 700 (vía IV), en un pGL3-cojinete de la TSA modelo murino de adenocarcinoma peritoneal podría mejorar la calidad de la citorreducción quirúrgica al duplicar el número de nódulos tumorales detectadas y acortando el tiempo de operación [5]. Ntziachristos y sus colegas llevaron a cabo con éxito el primer ensayo en humanos de imágenes de fluorescencia específica del tumor intraoperatoria en la estadificación y la cirugía de reducción de volumen para el cáncer de ovario utilizando IV folato-FITC, y demostró que el número de tumores detectados por los cirujanos bajo la guía de imágenes de fluorescencia específicos de tumores aumentó 5,3 veces (34
vs. página 7) en comparación con la luz blanca observación visual por sí sola [7]. Frangioni y compañeros de trabajo también demostraron la utilidad de la antorcha (resección asistido por fluorescencia y exploración) dispositivo para la cirugía oncológica guiada por imagen en el primer ensayo clínico en humanos de cáncer de mama nodo linfático centinela cartografía (SLN) tras la inyección intratumoral /subcutánea de 1 :1 mezcla de indocianina verde y la albúmina sérica humana (ICG: HAS) [6]. En este ensayo, los GC identificados por linfoescintigrafía NIR y fluorescencia imágenes fueron idénticos en 4 de los pacientes con cáncer de mama 6
La aplicación de los nanomateriales como agentes formadores de imágenes de fluorescencia óptica utilizando puntos cuánticos, nanopartículas de oro, y la fluorescencia de la sonda que contiene o. - nanopartículas conjugados ha llamado la atención con fines de diagnóstico en los estudios preclínicos [9] - [13]. Las micelas poliméricas pertenecen a una clase importante de nanomateriales que han entrado en varios ensayos clínicos para la administración de fármacos,
por ejemplo
. SP-1049C (doxorrubicina, fase II), Genexol-PM (paclitaxel, fase II), y NC-6004 (cisplatino, fase I) [14]. Las micelas poliméricas ofrecen varias ventajas no sólo como vehículos de fármacos, sino también como agentes de formación de imágenes ópticas en oncología: tamaño pequeño-partículas con distribución estrecha de tamaño, estabilidad estructural, alta solubilidad en agua, bajo efectos secundarios tóxicos sobre los tensioactivos convencionales (
por ejemplo
. Cremophor EL), la acumulación preferencial en tumores sólidos mediante una mayor permeabilidad y retención de efecto (EPR), evadiendo la filtración renal, y la multifuncionalidad de decoración de la superficie.
se ha discutido que la administración de fármacos apoptosis y las orientadas por imagen del cáncer ( especialmente para obtener imágenes de la capacidad de respuesta del tumor a la quimioterapia) [15], [16] podría ser superior a antígeno asociado al cáncer o la estrategia de proteína de segmentación en una amplia gama de tumores malignos, debido a la heterogeneidad sustancial en las poblaciones de células de cáncer no garantiza la presencia exclusiva de antígenos y proteínas biomarcadores en tejidos diana [17]. oncólogos quirúrgicos podrían aprovecharse de imágenes de tumores apoptosis como diana (independiente del tipo de células y factores desencadenantes que inducen la muerte celular) después de NACT con mayor precisión y exactitud [18]. Por lo tanto, citorreducción quirúrgica del tumor usando una guía visual intraoperatoria con imágenes de fluorescencia en tiempo real NIR podría resultar en una mayor precisión quirúrgica y el resultado. Una de las características más destacadas de la muerte celular programada, la apoptosis, es la externalización de la fosfatidilserina (PS), que normalmente reside predominantemente en la cara interna de la membrana plasmática [18].
En nuestro trabajo anterior, reportamos que (etilenglicol) poli -
bloque
poli (ε-caprolactona) (PEG
b)
-PCL micelas que contienen DiR (1,1-dioctadecyltetramethyl yoduro de indotricarbocyanine) de forma pasiva podría acumularse en LS180 tejidos tumorales de colon sólidos humanos por efecto EPR y proporcionar delineación no invasiva de tejidos tumorales LS180 con una relación de tumor a músculo de 30 a 43 a partir de tejidos recogidos [19]. También se observó la acumulación de DiR mejorada en los tejidos tumorales LS180 "preparado" después de una inyección IV de multi-fármaco que contiene poli (etilenglicol) -
bloquear
-poli (
D, L-ácido láctico) (PEG -
b
-pla micelas), lo que sugiere la disponibilidad de un tándem de micelas poliméricas que les puedan permitir una mejor delimitación del tumor para su uso en oncología quirúrgica [20]. Más recientemente, PEG-
b
micelas -PCL con paclitaxel (PTX), ciclopamina (CYP), y gosipol (GSP) a los 30, 30, y 30 mg /kg, respectivamente (q7d x 3) entrega a través IP, impidió la diseminación metastásica del cáncer de ovario y extensa formación de ascitis, dando como resultado una supervivencia prolongada en ES-2-luc intraperitoneal metastásico (adenocarcinoma indiferenciado, subtipo agresivo) y Skov-3-luc (adenocarcinoma seroso, subtipo de grado moderado) xenoinjerto murino modelos de cáncer de ovario [21].
Se propone una nueva estrategia de dos pasos para NACT, imágenes ópticas de apoptosis específica y orientación quirúrgica intraoperatoria (Figura 1). En el paso uno, PEG-
b
micelas que contienen -PCL PTX, CYP, y el SGP se utilizan para IP NACT y la inducción de la apoptosis en los tejidos tumorales. En un segundo paso, la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas que contienen -PCL DiR puede acumular activamente en los tejidos tumorales apoptóticas, lo que permite imágenes de fluorescencia óptica de la apoptosis de una manera en tiempo real (Figura 1). moléculas DiR, sondas fluorescentes que emiten luz NIR en la ventana de longitud de onda NIR, podrían ser útiles como un agente de imagen de fluorescencia óptica, evitando fuerte autofluorescencia de la piel y la sangre y permitiendo que las señales detectables a ser medido a través de varios milímetros de tejidos [22]. En este trabajo, se muestra que esta estrategia la delineación mejorada del tumor en dos etapas en la imagen óptica de fluorescencia NIR y proporciona una guía útil para la cirugía reductora escalonada en un modelo de xenoinjerto IP ES-2-luc-cojinete de cáncer de ovario, el acoplamiento de dos aplicaciones de micelas poliméricas en la administración de fármacos y formación de imágenes ópticas para la terapia oncológica quirúrgica de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Preparación de PEG-
b
-PCL micelas Llevar PTX, CYP y SGP
PEG-cargadas con el fármaco
b
micelas -PCL se prepararon por un método de evaporación del disolvente como se describe anterior [21]. Brevemente, 4,0 mg de PTX, CYP, y cada SGP y 120 mg de PEG-
b
-PCL (H
n de PEG = 5.000 g /mol, H
n del PCL = 10.000 g /mol, y M
w /M
n = 1.26) (Advanced Polymer Materials Inc., Montreal, Canadá) se disolvieron completamente en 1,0 ml de acetona seguido de una adición rápida de 1,0 ml de pre-calentado 0,9% de solución salina a 60 ° C con mezclado vigoroso. La acetona se evaporó a presión reducida a 60 ° C. La solución acuosa de micelas se centrifugó durante 5 min a 10.000 x
g
y pasado a través de un filtro de jeringa estéril de 0,2 micras de celulosa regenerada (RC) (Corning, Tewksbury, MA) para eliminar los fármacos insolubles. El contenido de PTX, CYP, y el SGP en PEG
b
micelas -PCL se cuantificó mediante el sistema de inversión de fase-HPLC (RP-HPLC) utilizando un sistema Shimadzu HPLC prominencia (Himadzu, Japón) como se ha descrito anteriormente [ ,,,0],21]. La separación de PTX, CYP, y GSP se hizo en un modo isocrático con fase móvil de 55% de acetonitrilo, 45% de agua destilada y ácido trifluoroacético al 0,1%. PTX, CYP, y el SGP se monitorizó a 227, 204 y 373 nm, respectivamente, y se eluyó en 2,7 min, 1,9 min y 10,6 min, respectivamente.
Preparaciones de apoptosis de metas de PEG-
b
-PCL y metoxi-PEG-
b
-PCL micelas que transporten DiR
Preparación de la apoptosis de metas de PEG-
b
-PCL (GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG
b)
-PCL micelas que llevan DiR se inició con la conversión de grupos acetal en la superficie de PEG-
b
micelas -PCL a grupos aldehído (Figura S1). Acetal-PEG-
b
-PCL (H
n de PEG = 5.000 g /mol, H
n del PCL = 5.000 g /mol, y M
W /H
n = 1.13) fue proporcionado amablemente por el Dr. Afsaneh Lavasanifar, Universidad de Alberta (Edmonton, Canadá). El método de conversión fue ligeramente modificación de la literatura [23]. Acetal-PEG-
b
copolímero -PCL se disolvió en acetona a una concentración de 20 mg /mL. entonces el agua destilada se añadió rápidamente a la solución de polímero con agitación vigorosa a temperatura ambiente, seguido de la evaporación de la acetona a presión reducida a temperatura ambiente. La solución de micelas se centrifugó durante 5 min a 10.000 x
g
y pasado a través de un filtro de jeringa estéril de 0,2 micras RC. La conversión de grupos acetal en acetal-PEG-
b
micelas -PCL se llevó a cabo a pH 2,0 mediante la adición de 0,5 N de HCl. Después de 4 h de agitación moderada a temperatura ambiente, la reacción se neutralizó con 0,5 N de NaOH para detener la reacción. Después, la solución de micelas neutralizada se dializó contra agua con una membrana de diálisis (MWCO 6.000 g /mol) para eliminar la sal durante la noche y se liofilizó durante 48 h para el uso futuro. muestra liofilizada se disolvió en CDCl
3 (6 mg /ml) para estimar la tasa de conversión del acetal al grupo aldehído de PEG-
b
-PCL por
1H NMR. péptido libre, GFNFRLKAGAKIRFGS (UW Centro de Biotecnología, Madison, WI) a Mw = 1769 g /mol (Figura 2A), se disolvió en tampón HEPES (10 mM, pH 6,4) y se mezcla con el producto liofilizado aldehído-PEG-
b micelas
-PCL para obtener 4 mg /ml de polímero y 0,35 mg /ml de concentración de péptido en 2:01 relación molar (aldehído-PEG-
b
-PCL: GFNFRLKAGAKIRFGS). Después de 2 h de agitación moderada, se añadió NaBH
3CN (10 equiv) a la mezcla para reducir la base de Schiff. Después de 4 días, la solución de micelas se dializó de nuevo frente a agua con membrana de diálisis (MWCO 6.000 g /mol) durante la noche y luego GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-
b
solución de micela -PCL se liofilizó durante 48 h. La eficiencia de la conjugación del péptido sobre aldehído-PEG-
b
-PCL se determinó mediante análisis RP-HPLC. Brevemente, las muestras (10 l) se inyectaron en una columna Zorbax 300SB-C18 (4,6 x 15 mm, 3,5 m, Agilent) mantenida a 40 ° C y la tasa de flujo fue de 0,8 mL /min. La elución en gradiente se realizó con la fase móvil de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua destilada y ácido trifluoroacético al 0,1% en 90/10 (v /v) de acetonitrilo /agua destilada. La fase móvil fue programado como sigue: 0 min 85% de disolvente A y 15% de disolvente B; 35 min, 50% de disolvente A y 50% de disolvente B. péptido libre se monitorizó a 215 nm y se eluyó en 16 min. La cantidad de péptido conjugado en PEG-
b
micelas -PCL se calculó restando la cantidad de péptido libre de la cantidad de péptido añadido inicialmente a la reacción. En paralelo, péptido liofilizado conjugado en PEG-
b
-PCL se disolvió en DMSO
d
6 (6 mg /ml) para calcular la tasa de conjugación del péptido sobre PEG-
b
-PCL por
1H NMR a 80 ° C.
Los resultados se presentan como% de moléculas FLI DiR con destino en las placas y FLI% de las moléculas unidas en DiR ovárico ES-2-luc esferoides tumorales. BLI a partir de células ES-2-Luc y FLI a partir de moléculas DiR se cuantificaron utilizando Xenogen IVIS 200 Series. (A) Ensayo de unión competitiva de la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL que llevan DiR (péptido 1,0 M y 500 nM DiR) para PC sobre o PS-recubierto placas de 96 pocillos (un total de 200 M de fosfolípidos ). (B) Ensayo de unión competitiva de la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL llevan DiR a la apoptosis inducida por ES-2-luc esferoides de tumor de ovario (** & lt; 0,01, *** & lt; 0,001) .
metoxi-PEG-
b
-PCL y la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL que llevan DiR se prepararon mediante un método de evaporación del disolvente: 4.0 mg de polímeros y 0,1 mg de DiR (Invitrogen, Carlsbad, CA) se disolvieron en 1,0 ml de acetona, seguido de una adición rápida de PBS (10 mM, pH 7,4) con mezclado vigoroso. La acetona se evaporó a presión reducida a temperatura ambiente. La solución micelar acuosa que contiene DiR se centrifugó durante 5 min a 10.000 x
g
y pasado a través de un filtro de jeringa estéril de 0,2 micras para eliminar RC no incorporada DiR. El contenido de DiR en micelas se cuantificó mediante RP-HPLC como se describe anteriormente [20]. La elución de DiR se hizo en un modo de gradiente con fase móvil de agua destilada 70% y ácido trifluoroacético al 0,07% como disolvente A y 30% de acetonitrilo y ácido trifluoroacético 0,03% como disolvente B. DiR se monitorizó a 745 nm y se eluyó en 16 min.
Caracterización física de metoxi-PEG-
b
-PCL y apoptosis de metas de PEG-
b
-PCL micelas que transporten DiR
Z -Promedio diámetros de metoxi-PEG-
b
micelas -PCL y la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL que llevan DiR se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando mediciones Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Reino Unido) a 25 ° C con un ángulo de detección de 173 ° y un láser de iones de He-Ne (4 mW, λ = 633 nm) para el haz incidente. funciones de autocorrelación fueron creados basándose en análisis acumulativo, el cálculo del diámetro hidrodinámico de las micelas de la ecuación de Stokes-Einstein y el índice de polidispersidad (PDI). Antes de las mediciones, las soluciones de micelas se diluyeron con PBS (10 mM, pH 7,4) para dar una concentración de polímero en ~ 0,4 mg /ml, que representa la concentración de polímero por encima de la concentración micelar crítica. DiR eficiencia de carga se muestra como polímero de peso DiR% /peso. El
in vitro
DiR cinética de liberación de metoxi-PEG-
b
-PCL y se estudió la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL que llevan DiR para estimar el tiempo para la liberación del fármaco 50% (t
1/2) basado en un modelo de decaimiento de una sola fase utilizando GraphPad Prism versión 5.00 para Mac OS X (la Jolla, CA). micelas DiR-carga, lo que representa 100 mg /ml de DiR, se añadieron en casetes de diálisis (MWCO 20.000 g /mol), y casetes se colocaron en 2,0 l de PBS (10 mM, pH 7,4) a 37 ° C con agitación moderada. Muestras (20 μΛ se retiraron de cassettes en varios puntos de tiempo, 0, 0,5, 1, 2, 3, 8, 12, y 24 h y después de cada toma de muestras, cassettes fueron repuestos con 20 μΛ de PBS fresco (10 mM, pH 7,4 ). El contenido de DiR en micelas que quedan en los casetes se analizó por RP-HPLC como se describe anteriormente.
Evaluación de PS-unión selectiva de la apoptosis de metas de PEG-
b
-PCL micelas Llevar DiR
La unión de la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL que llevan DiR a PS se evaluó usando placas recubiertas con fosfolípido así [24] y esferoides tumorales en 3-D formadas a partir de la luciferasa que expresan células ES-2-luc. PC o PS solubilizados en etanol se inmovilizan sobre de fondo transparente, placas de 96 pocillos a una concentración de aproximadamente 200 mM en cada pocillo, y el etanol se evaporó a temperatura ambiente durante la noche. Algunos de PC o PS-revestido los pocillos se incubaron con 1,0 M de péptido libre durante 3 horas para saturar PS en pozos recubiertos con fosfolípidos. la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL que llevan DiR, lo que representa 1,0 M de péptido y 500 nM de DiR, se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Cada pocillo se lavó con PBS (10 mM, pH 7,4) y se detectó la apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL que llevan DiR unido en pozos por Xenogen IVIS 200 Series (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . ES-2-luc esferoides tumorales 3-D se generaron mediante siembra de 5.000 ES-2-luc células /pocillo en agarosa recubiertas de placas de 96 pocillos y se incubaron durante 4 días. ES-2 células de cáncer de ovario humano se transfectaron de manera estable con el plásmido de luciferasa pGL4.51-expresión que contienen el gen de resistencia a neomicina (Promega, Madison, WI) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) como se describe anteriormente [21]. ES-2-luc células se cultivaron en medio 5a de McCoy suplementado con 1% de L-glutamina, suero bovino fetal al 10%, 1% de penicilina /estreptomicina, y 750 g /antibióticos ml de G418 y se mantuvieron a 37 ° C bajo una atmósfera de 5 % de CO
2 en un incubador humidificado. PEG-
B Opiniones micelas que contienen -PCL PTX, CYP, y el SGP (3.3, 3.3, y 3.3 nM, respectivamente) se añadieron a esferoides tumorales ES-2-luc y se incubaron durante 3 días. Algunos de esferoides tratados ES-2-luc se incubaron 3 h con 200 nM de péptido libre para saturar PS expuesto en esferoides tumorales. La apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL llevan DiR continuación, se añadieron a esferoides tumorales ES-2-luc en una concentración final de 200 nM de péptido y 100 nM DiR y se incubaron durante 30 min a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora humidificada. Como control, la intensidad de la bioluminiscencia de las células ES-2-luc también se controló para asegurar que es-2-luc esferoides tumorales se formaron consistentemente en cada pocillo, utilizando Xenogen IVIS 200 Series.
intraperitoneal Human Cáncer de ovario de xenoinjerto Tratamientos y micelas
Femenino 6-8 semanas de edad desnudos atímicos Foxnl
nu ratones fueron adquiridos de Harlan Laboratories (Madison, WI). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El uso ético y humanitario de los animales fue asesorado por el Comité de Planificación y Asesoramiento Toda Campus Animal (ACAPAC) y el protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad de Wisconsin-Madison (Número de permiso: M02472) . La anestesia general fue inducida con 1,5% de isoflurano /oxígeno y se mantiene con 1% de isoflurano /oxígeno. se tripsinizaron las células ES-2-luc, recogidos a partir de cultivos sub-confluentes, y 1 × 10
6 células /animal de ES-2-luc células se inyectaron en la cavidad peritoneal de los ratones anestesiados. inyección IP de PEG-
b
micelas -PCL que llevan 30, 30 y 30 mg /kg de PTX, CYP, y el SGP se llevó a cabo 7 días después de la inoculación de las células ES IP-2-luc después de la observación de la bioluminiscencia la señal en imágenes de todo el cuerpo de los animales por Xenogen IVIS 200 Series. Un día después de la inyección IP de PEG-
b
micelas que contienen -PCL PTX, CYP, y el SGP, metoxi o apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL que llevan 250 g /kg de DiR se inyectó a través de la vena de la cola de animales anestesiados. Los pesos corporales de los animales se midieron mediante una escala portátil, y el aspecto general y la mortalidad de los animales se controló cuidadosamente durante todos los conjuntos de experimentos con animales. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales. Los animales fueron sacrificados con dióxido de carbono de calidad médica con la velocidad de flujo de 10 a 30% del volumen de la cámara de eutanasia por minuto.
TUNEL Ensayo de xenoinjerto
ES-2-luc-cojinete se dosificó a través de ruta IP con PEG-
b
micelas -PCL que llevan PTX, CYP, y el SGP en el día 7 después de las células ES-2-luc fueron inoculados en la cavidad peritoneal. Después, los animales (
n
= 4) fueron sacrificados a los 0, 12, 24, 48, y 72 h post-tratamiento de micelas. Se diseccionaron tumorales, el bazo, los riñones y los tejidos del hígado. la fragmentación del ADN inducida por la apoptosis se detectó en los tejidos por el método de dUTP mediada por TdT Nick-End Labeling (TUNEL) utilizando DeadEnd fluorométrico TUNEL kit de ensayo (Promega, Madison, WI). Los tejidos fueron congelados se seccionaron en 10 micras rodajas, permeabilizadas por proteinasa K, y se fijaron con formaldehído al 4%. La mezcla de reacción que consta de TdT y marcado con fluoresceína dUTP se añadió a la sección fija de tejidos y se incubaron durante 1 h a 37 ° C en una cámara humidificada en la oscuridad. fragmentos y núcleos de las células couterstained por DAPI de ADN marcadas con fluoresceína se visualizaron a 520 nm y 460 nm, respectivamente, usando un microscopio confocal (Olympus FV1000 FluoView, Minneapolis, MN). Las células apoptóticas y núcleos de las células se muestran en verde y azul, respectivamente.
bioluminiscencia y fluorescencia imagings
Xenogen IVIS serie 200 se utilizó para la imagen tanto bioluminiscencia y fluorescencia de los objetos
in vitro
,
in vivo
, y
ex vivo. Xenogen IVIS serie 200 estaba equipado con una lámpara halógena de cuarzo de 150 W y un láser de barrido de potencia de 1 mW. Las imágenes fueron pantalla muestran con una resolución espacial de & gt; 60 micras /píxel. imágenes de bioluminiscencia fueron adquiridos por un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) con los siguientes parámetros: tiempo de exposición = 1 s, hurgar en la basura = medio, y f /stop = 2.
in vitro
, D-luciferina (Vida del calibrador Science, Hopinton, MA) a 10 g /pocillo se añadieron a ES-2-luc esferoides tumorales 5 min antes de imágenes de bioluminiscencia, y
in vivo
, D-luciferina a 113 mg /kg se inyectó IP en ES-2-luc-cojinete modelo de xenoinjerto de 5 min antes de imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero. Se recogió la dinámica de crecimiento de los tumores RE-2-luc y se muestra como imágenes codificadas por colores utilizando el software de imágenes en vivo para el análisis cuantitativo y BLI de los tumores RE-2-luc fue escalado por el recuento total.
Las imágenes de fluorescencia fueron también adquirida por una cámara cargada dispositivo de par (CCD) con los siguientes parámetros: tiempo de exposición = 1 s, binning = medio, y f /stop = 2. un filtro de ajuste para la detección DiR se fijó en 745 nm para la excitación y a 800 nm para la emisión. Todas las imágenes codificadas por colores se recogieron usando un software de imágenes en vivo para la adquisición y análisis de imágenes. FLI de DiR se demostró por medio de la eficiencia radiante, fotones totales por segundo por centímetro cuadrado por estereorradián en el rango de irradiancia (microvatios por centímetro cuadrado): [ps
-1cm
-2sr
-1] /[ ,,,0],mW cm
-2]. La fluorescencia de DiR en los tejidos tumorales se determinó a partir de la eficiencia radiante media en el retorno de la inversión dibujado alrededor de los tejidos tumorales preestablecidas por imágenes de bioluminiscencia de un animal idéntico.
bioluminiscencia y fluorescencia imágenes de todo el cuerpo se registraron a las 6, 12, 24 , y 48 horas después de una inyección IV de PEG-
b
micelas -PCL que llevan DiR. Los ratones fueron colocados en posiciones abdominales para obtener de bioluminiscencia y fluorescencia imágenes codificadas por colores de todo el cuerpo. Todos los ajustes del equipo de bioluminiscencia y fluorescencia imagings eran idénticos en el tiempo experimento.
En tiempo real la imagen de fluorescencia Adquisición de Animales
Fluobeam 800 es un sistema de imágenes de fluorescencia 2-D NIR integrado por CCD cámara y una fuente integrada NIR de luz (100 mW) con una longitud de onda de excitación a 780 nm y una longitud de onda de emisión a & gt; 820 nm. Este sistema proporciona 7,5 x 10 cm de campo aligerado homogénea y el sistema portátil de mano compuesta de cámara y láser se encuentra aproximadamente a 20 cm por encima del objeto. Las imágenes de fluorescencia fueron pantalla que se muestra con una resolución espacial de 110 m /pixel y grabado, ya sea como imágenes en blanco y negro estáticos (9 imágenes /seg) o vídeos en tiempo real (25 imágenes /seg).
Procedimiento quirúrgico
los animales recibieron una inyección IP de D-luciferina (113 mg /kg) 5 min antes de la de todo el cuerpo de formación de imágenes de bioluminiscencia en día 9 después de ES-2-luc inoculación de las células (inyección de 24 h post IV de PEG-
b
micelas -PCL que llevan Dir). Después de bioluminiscencia de imágenes de todo el cuerpo se llevó a cabo, los animales fueron sacrificados inmediatamente. Todos los animales sacrificados fueron sometidos a una laparotomía media y las imágenes de todo el cuerpo de bioluminiscencia de animales incisas se obtuvieron de nuevo. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en animales sacrificados y por un oncólogo cirujano experimentado en cirugía murino. En un conjunto de experimentos (
n
= 4), para la comparación, la resección quirúrgica del tumor tradicional se llevó a cabo bajo la luz blanca normal. Cuando la resección quirúrgica del tumor se consideró satisfactoria, tejidos y carcasa de tipo tumoral disecados fueron escaneados por Xenogen IVIS serie 200 para obtener imágenes de bioluminiscencia. En otro grupo de animales (
n
= 4), sistema de imagen NIR, el sistema de imágenes NIR Fluobeam 800 se enciende y la resección quirúrgica del tumor fue asistido por imágenes de fluorescencia en tiempo real que se muestran en la pantalla. Cuando la gripe de tipo tumoral
+ tejidos fueron extirpados forma más completa posible, diseccionado tejidos tumorales y la carcasa fueron escaneados utilizando la Serie Xenogen IVIS 200 para obtener bioluminiscencia y fluorescencia imágenes. La duración de la cirugía se registró desde el momento de la incisión hasta la finalización de la reducción de volumen del tumor. una precisión quirúrgica se evaluó mediante dos cálculos: (1)% suma de BLU
+ tejidos tumorales a la suma de los tejidos totales similares a tumores extirpados durante todo el procedimiento quirúrgico, y (2) el recuento total de BLI de [ROI a mediados -line una incisión animales menos ROI en animales disecados] sobre los de retorno de la inversión a mediados de línea incisa animal. precisión quirúrgica también se midió mediante el cálculo de un índice de cáncer peritoneal post-resección (PCI) como se describe por Sugarbaker [3]. La PCI se basa en la distribución y tamaño de las lesiones en el abdomen de animal. En este estudio, PCI fue adaptada a los tamaños tumorales en ratones con las siguientes puntuaciones: El abdomen se dividió en 13 regiones y se obtuvo el tamaño de la lesión (LS) (0-3) en cada región de la siguiente manera: no hay tumores visuales (LS = 0), & gt; 0 a 0,5 mm tumor (Ls = 1), 0,6 a 2,0 mm tumor (LS = 2), y & gt; 2,0 mm tumor (LS = 3). Puntuación total LS por animal se sumaron como una puntuación numérica que se puede osciló entre 0 (no hay tumores observados) a 39 (13 zonas x 3).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de una vía a nivel de significación del 5% combinado con pruebas de comparación múltiple de Tukey por GraphPad Prism VER 5.00 para Mac OS X (La Jolla, CA).
Resultados
Caracterización de la apoptosis de metas de PEG -
b
-PCL micelas que transporten DiR
La Tabla 1 presenta los tamaños y las eficiencias de carga (% en peso de polímero DiR /peso) de la apoptosis de metas de PEG-
b
-PCL ( GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-
b
-PCL) y metoxi-PEG-
b
micelas -PCL obtenidos después de formar micelas incorporados-DiR por una técnica de evaporación del disolvente. La apoptosis de metas de PEG-
b
micelas -PCL tenía un diámetro promedio z de 83 ± 2 nm (índice de polidispersidad, PDI 0,1) y metoxi-PEG-
b
micelas -PCL tenía una z-diámetro promedio de 45 ± 2 nm (PDI 0,1). La eficiencia de carga de DiR para ambos micelas fue de aproximadamente 2%. Péptido (GFNFRLKAGAKIRFGS) fue conjugado a PEG
b
micelas -PCL con la relación de conjugación molar a 30%
a través de una reacción
base de Schiff, basado en los resultados de ambos HPLC (cuantificación de sustracción de la no péptido conjugado de péptido añadido inicialmente para la reacción) y
1H RMN (cuantificación de péptido conjugado) analiza (datos no mostrados). En
análisis 1H NMR, la relación de intensidad relativa del pico de los protones de bencilo de fenilalanina en la δ = 7,2 ppm en el péptido al pico de metileno de protones de protones de PEG en δ = 3,7 ppm determinó el nivel de péptido en PEG-
b
-PCL. Los datos para la cuantificación de péptidos de HPLC y
1 H RMN proporcionan valores comparables.