Extracto
Introducción
anti-EGFR terapia dirigida es de creciente importancia en el cáncer colorrectal avanzado y antes de
KRAS
pruebas de mutación es obligatoria para la terapia. Sin embargo, a la cual ocasiones esto se debe realizar es aún objeto de debate. El objetivo fue evaluar en pacientes con cáncer de recto localmente avanzado si existe dentro de la muestra de la heterogeneidad KRAS antes de y después de la quimiorradioterapia preoperatoria (CRT), y si hay algún cambio en
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estado de mutación debido a esta intervención.
Materiales y Métodos
KRAS
análisis de estado de mutación se realizaron en 199 muestras de tumores de 47 pacientes con cáncer de recto. Para evaluar la heterogeneidad entre las diferentes áreas tumorales dentro del mismo tumor antes de la CRT preoperatoria, 114 biopsias de 34 pacientes (media de 3 biopsias por paciente) fueron analizados (pre-terapéutica heterogeneidad intratumoral). Para la evaluación de la heterogeneidad después de CRT tejido tumoral residual (85 muestras) de 12 pacientes (media 4.2 muestras de tejido por paciente) se analizaron (post-terapéutica heterogeneidad intratumoral) y evaluación de la heterogeneidad antes y después de CRT se evaluó en muestras de pacientes correspondiente (intervencionista heterogeneidad). método de extensión del cebador (Snapshot ™) se utilizó para inicial
KRAS
pruebas de estado de la mutación para el codón 12, 13, 61, y 146. Los resultados discordantes por este método fueron reevaluados mediante el aprobado por la FDA
KRAS
Pyro Kit 24, V1 y el
RAS
Extensión Pyro Kit 24, Kit V1 (TheraScreen®
KRAS
prueba).
resultados
Para 20 (43%) de los 47 pacientes, un
se detectó KRAS
mutación. Con 12 de los 20, la mayoría de estas mutaciones afectados codón 35. No se obtuvo evidencia de que la TRC se traduce en cambios en el
KRAS
patrón de mutación. Además, hay una heterogeneidad intratumoral en el
KRAS
estado mutacional se pudo probar. Esto era cierto tanto para las biopsias previas a la TRC y las muestras de resección a partir de entonces. La discrepancia observada en algunas muestras cuando se utiliza el ensayo de Snapshot ™ fue debido a la insuficiente sensibilidad de esta técnica sobre la regresión tumoral masiva por el CRT como la aplicación de los resultados TheraScreen®
KRAS
prueba reveló concordantes.
conclusión
Nuestros resultados indican que el
KRAS
estado de la mutación en el sitio del tumor primario del cáncer de recto es homogénea. Su evaluación de las decisiones terapéuticas es factible en las biopsias pre-terapéuticos, así como en las piezas resecadas post-terapéuticos. La cantidad de células tumorales viables parece ser un determinante importante de la sensibilidad del ensayo y por lo tanto se debe considerar para la selección del método analítico
Visto:. Jo P, A König, Schirmer H, J Kitz, Conradi LC, Azizian A, et al. (2016) La heterogeneidad de los
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Estado mutaciones en el cáncer rectal. PLoS ONE 11 (4): e0153278. doi: 10.1371 /journal.pone.0153278
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, JAPÓN
Recibido: 24 Agosto, 2015; Aceptado: 25 Marzo de 2016; Publicado: 11 Abril 2016
Copyright: © 2016 Jo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante /el conjunto de datos mínimos de datos están dentro del manuscrito
Financiación:.. el trabajo es parte de la Unidad de Investigación clínica (de KFO 179) y fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)
Compitiendo intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la terapia dirigida contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) representa una estrategia de tratamiento bien aceptada y eficaz en el cáncer colorrectal metastásico asociado. con una mayor tasa de respuesta y la supervivencia del paciente prolongada [1, 2]. En su función oncogénica
EGFR
controla las funciones celulares esenciales tales como la diferenciación, proliferación y supervivencia por lo que es un objetivo que vale la pena para la terapia contra el cáncer [3]. Sin embargo, la inhibición de esta molécula de señalización central en el cáncer colorrectal solamente es prometedor cuando los efectores intracelulares aguas abajo de
EGFR
no se ve alterada por la activación de mutaciones. Uno de los principales efectores intracelulares que traducen
EGFR
señales representan las pequeñas GTPasas
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control de cascadas de señalización intracelulares vitales como la vía de Proteína- mitógeno activado señalización (MAP) quinasa. de mutación en el
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gen locus da como resultado una activación continua de la vía MAPKinase independiente de factores extracelulares y de la
EGFR
. No es sorprendente, y debido a la estimulación continua de las vías de señalización oncogénicas por mutatively activados
KRAS
, la inhibición de
EGFR
no tuvo efectos beneficiosos o incluso adversas en pacientes con cáncer colorrectal que alberga un
KRAS
mutación. En consecuencia, los pacientes con mutado
KRAS ¿Cuáles son excluidos de anti-
EGFR
la terapia y la determinación de la
se requiere KRAS
estado de mutación antes de la terapia prevista.
En general,
KRAS
estado de la mutación se evalúa mediante el análisis de tejido del tumor primario. Sin embargo, debido a la heterogeneidad intratumoral [4-6]
KRAS
heterogeneidad mutación dentro de las diferentes áreas del tumor podría ser una preocupación potencial como informó recientemente al menos en pacientes seleccionados [7, 8]. Un fenómeno que no sólo se limita al cáncer colorrectal como se muestra por Queirós et al. [9]. Las diferencias en los
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estado de mutación entre el tumor primario y la metástasis a distancia [7, 10]. así como también se ha informado dependencia estadio del tumor [11]. Ciertamente, hay una alta concordancia entre el tumor primario y la metástasis tan recientemente revelada por un meta-análisis de Han y sus colegas [12]. Sin embargo, también debe tenerse en cuenta que la metodología de prueba mutación utilizada puede ser fuente de discrepancias reportadas como ha señalado recientemente por Sherwood et al. en el cáncer de pulmón [13].
A diferencia de la quimiorradioterapia preoperatoria del cáncer de colon (CRT) es la estrategia de tratamiento de elección en pacientes con cáncer de recto localmente avanzado. Sin embargo, no hay acuerdo sobre el momento de la determinación de los
KRAS
estado de la mutación. Además, los resultados posibles relativas a la concordancia de la
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estado de la mutación en muestras pre y post-terapéuticos tumorales (que se refiere como la heterogeneidad intertumoral) son poco frecuentes y de naturaleza conflictiva [14-16]. Por otra parte, no hay resultados que demuestran la reproducibilidad de los
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prueba en la biopsia primaria, así como en la pieza de resección dentro del mismo tejido tumoral (que se refiere como la heterogeneidad intratumoral). Por lo tanto, se intentó evaluar el
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estado desde múltiples biopsias pre-terapéuticos, así como en muestras de tumores resecados. Objetivo era comparar el estado de la mutación antes y después de la quimiorradioterapia en el cáncer rectal y de aclarar si las diferencias de mutación en los tumores no tratados previamente se producen en absoluto.
Materiales y Métodos
Pacientes y Tratamiento
los pacientes incluidos en este análisis fueron atendidos en los departamentos de general, Cirugía visceral y Pediátrica y Radioterapia y Oncología de Radiación de la Universidad del Centro Médico Goettingen, y se inscribieron o tratado de acuerdo con las directrices de ensayo de la CAO /ARO /AIO-94 [ ,,,0],17] o CAO /ARO /AIO-04 [18] (EudraCT 2006-002385-20-Número-NCT00349076) del Cancer Study Group alemán rectal. Todos los pacientes fueron seguidos de acuerdo con los protocolos de ensayos y dieron su consentimiento informado por escrito, ya sea de los pacientes o de sus representantes legales. Este estudio se ajusta a los principios éticos de la Declaración de Helsinki (Seúl, 2008) y fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Gotinga en Goettingen, Alemania (número de solicitud 20/9/95, 08/09/08).
Comprobación de pre y post-terapéutica del tumor biopsias
biopsias de tumores se recogieron antes de la CRT preoperatoria durante los procedimientos de diagnóstico. Con unas pinzas de biopsia biopsias típicos produjo el tamaño de una cabeza de alfiler. Después de la cirugía de tumor residual fue tomado de los especímenes resecados. Debido a la regresión del tumor toda la región del tumor se ha incrustado y se evaluó después por el patólogo. El estado de la mutación fue evaluada en (FFPE) muestras fijadas en formalina-embebidos en parafina de tejido (4% formalina tamponada) de biopsias de tumores pre-terapéuticas y las piezas resecadas post-terapéuticos.
Tumor ADN preparación y aislamiento
diapositivas FFPE muestras de pre-terapéuticos y resecados fueron reevaluados de forma independiente y cegada por dos patólogo experimentado gastrointestinal (JK, PS). clasificación de regresión tumoral (TRG) se evaluó en porcentaje de regresión de acuerdo con la Dworak Grading [19]. En los casos discordantes, diapositivas fueron reevaluados por ambos patólogos y se tomó una decisión final. Añadimos los respectivos grados de regresión del tumor y los datos clínicos relevantes de las biopsias pretherapeutic para todas las muestras de los pacientes en la Tabla 1. La microdisección para el enriquecimiento de las células tumorales para conseguir un contenido de 70 a 80% se realizó manualmente. La técnica se realizó como se informó recientemente por Hunt et al [20]. En resumen, los cortes de tejido FFPE fueron desparafinados y se tiñeron con hematoxilina. áreas tumorales representativos se identificaron utilizando un microscopio con una ampliación de plegado 40. La disección se realizó utilizando una cuchilla quirúrgica en punta. El tejido tumoral se transfirió a un tubo de extracción y de ADN se realizó posteriormente utilizando el Kit de Qiagen AllPrep DNA /RNA FFPE (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
análisis de mutación
Primer método de extensión-Snapshot ™ Ensayo.
método de extensión del cebador se utilizó para analizar conocido punto caliente
KRAS
mutaciones en el cáncer de recto [21] tal como se describe anteriormente [22] . Brevemente, las regiones de las mutaciones de punto de acceso en los codones 12, 13, 61 y 146 fueron amplificados por PCR multiplex utilizando Qiagen Multiplex Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) con ADN de entrada constante 20 ng. Esta cantidad total de ADN de partida se mantuvo también para las pruebas de sensibilidad, por la cual el ADN con el solo conocido
KRAS
mutaciones se diluyó con ADN de tipo salvaje que alberga la configuración de acuerdo con
KRAS
loci. Por lo tanto, ocho mezclas con 100, 50, 40, 30, 20, 10, 1, y 0% de ADN que contiene mutante por cada una de las cuatro mutaciones interrogados se prepararon antes de la sujeción a la PCR multiplex. Después de la fosfatasa alcalina de camarón y Escherichia coli exonucleasa I (USB, Staufen, Alemania) de tratamiento de cebadores específicos de unión adyacentes a los sitios potenciales de mutación se aplicaron y alargada por didesoxinucleótido marcado con fluorescencia usando el kit de Snapshot ™ Multiplex (Applied Biosystems, Foster City, CA, ESTADOS UNIDOS). GeneScan ™ 120 LIZ
® tamaño estándar se utilizó como una escalera de ADN de tamaño interno para electroforesis capilar (3100 analizador genético, Aplied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los resultados fueron analizados con GeneScan ™ Versión 3.5.1 Análisis (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). técnica de extensión de cebador ha sido previamente demostrado ser una técnica válida para identificar mutaciones o polimorfismos [23, 24].
En caso de resultados discrepantes para las pruebas de mutación KRAS que reevaluado la sensibilidad con el sistema de prueba KRAS TheraScreen®.
Prueba RAS TheraScreen®.
El KRAS
Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden, Alemania) (mutaciones de portada en
KRAS codones 12
, 13 y 61 de la humana
KRAS
gen) y el
RAS
Extensión Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden, Alemania) (mutaciones de portada en
KRAS
los codones 59, 61, 117 y 146 de la humana
KRAS
gen) se han realizado para la detección de mutaciones de validación de la
KRAS
gen en el ADN genómico de la muestra de cáncer de recto. La plataforma plataforma PyroMark Q24 MDx se ha utilizado para realizar el ensayo con el TheraScreen® Q24 Software, Versión 2.0.7 con plugins siguientes,
KRAS
v1.2.0 plugin y
RAS
Extensión PlugIn v .1.2.1.2.
Estamos amplificado regiones de interés en el ADN extraído usando cebadores en el
KRAS
ensayo de Pyro (QIAGEN, Hilden, Alemania). Estamos posteriormente inmovilizados, se lava, y se desnaturalizan los productos amplificados utilizando la estación de trabajo de vacío y se somete a esos productos utilizando la pirosecuenciación PyroMark Q24 Pyrosequencer (QIAGEN, Hilden, Alemania) para detectar y cuantificar los
KRAS
mutaciones. de entrada inicial del ADN de cada muestra fue de 100 ng.
Las líneas celulares.
Las siguientes líneas celulares de cáncer colorrectal humano que albergan indicaron, distinta
KRAS mutación
se han utilizado para los experimentos se describe en este manuscrito: DLD1 (ATCC CCL-221) para G13D, SW1116 (ATCC CCL-233) para G12A, LS174T (ATCC CCL-188) para G12D, y SKCO1 (ATCC HTB-39) para G12V. Como control negativo, se obtuvo de tipo salvaje de ADN genómico KRAS de la línea celular de fibroblastos humanos BJ (ATCC: CRL-2522). Todas las líneas celulares han sido adquiridos de ATCC (Manassas, Virginia, EE.UU.).
Resultados
El tratamiento de pacientes que sufren de cáncer de recto localmente avanzado (UICC etapas II y III) comprende quimiorradioterapia neoadyuvante, la resección y la quimioterapia adyuvante. En nuestro estudio 32 (68,1%) hombres y 15 (31,9%) mujeres recibieron CRT neoadyuvante seguida de resección quirúrgica y quimioterapia adyuvante (Figura 1). Neoadyuvante CRT incluye la irradiación del espacio presacro con una dosis total de 50,4 Gy (dosis única de 1,8 Gy) acompañado por cualquiera de 5-fluorouracilo (n = 24; 51,1%) o una combinación de una infusión intravenosa de oxaliplatino y una infusión continua de 5-fluorouracilo (n = 23; 48,9%). Dentro de 4 a 6 semanas después de la finalización de la resección del tumor primario CRT neoadyuvante se llevó a cabo, incluyendo la escisión del mesorrecto completa seguida de quimioterapia adyuvante.
KRAS
estado de la mutación se determinó técnica Snapshot ™ basado en la PCR a partir de biopsias obtenidas por el índice rectoscopia y de las muestras resecadas como se muestra en la figura 1.
cebador de extensión Método de ensayo La exactitud
Una de las principales dificultades en la detección basada en PCR de la mutación genómica representa el límite de detección de sensibilidad y la calidad de los cebadores utilizados en la etapa de amplificación. Con el fin de evaluar nuestro sistema de imprimación se utilizó líneas celulares de cáncer colorrectal humano que albergan distintas genómico
KRAS
mutaciones. Para evaluar el límite de detección del ensayo de extensión del cebador que simula la posible contaminación de las células tumorales con los fibroblastos. Precisamente, utilizamos cuatro líneas celulares establecidas como modelo para una de las mutaciones KRAS considerados: DLD1 para G13D, SW1116 para G12A, LS174T para G12D, y SKCO1 para G12V. Por tipo salvaje
se empleó KRAS
estado genómico de la línea celular de fibroblastos humanos BJ. El ADN genómico de cada una de las cuatro líneas de células tumorales se diluyó en serie con la de la línea BJ y se sometió a amplificación por PCR seguido de ensayo de Snapshot ™ a. evaluar la sensibilidad de este procedimiento. Por lo tanto, se determinó la intensidad de la señal, es decir, el área bajo la curva (AUC), de los picos que representan ya sea de tipo salvaje o mutante
KRAS
alelo en las diluciones seriadas preparados de control positivo y negativo y calculó un par de sabios relación de los picos correspondientes (figura 2).
Para todos
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variantes de mutación, hemos podido demostrar que la técnica aplicada Snapshot ™ representa un ensayo de prueba fiable. Específica
KRAS
mutaciones G13D y G12A se pudo detectar de manera fiable hasta una dilución contaminación con el ADN de fibroblastos de 90%, la de G12D incluso hasta 99% y la de G12V hasta un 80% lo que demuestra una alta sensibilidad y claramente lo que sugiere esta método no sea capaz de detectar todos los considerados
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mutaciones en las biopsias y microdissected pieza resecada. Además, en todas las muestras de ensayo que correctamente obtuvo el esperado
KRAS
variante mutación definida por la línea celular de cáncer utilizado.
En cada caso, la intensidad de la señal representa como el AUC (área bajo la curva ) del pico detectado en el electroferograma para el mutante (AUCmut) en relación con la de tipo salvaje (se calculó AUCwt) alelo. Esta relación fue cada refirió a la muestra que contiene ADN de entrada 100% de la línea celular de cáncer con la mutación respectiva (ajustado a 1,0). Una línea de regresión se calculó con el coeficiente de determinación (r
2) indicado. Cada serie se evaluó tres veces de forma independiente con la desviación estándar para cada dilución indicada como barras de error.
KRAS
estado entre las biopsias pre-terapéuticos
frente
correspondiente resecarse post-terapéutica espécimen
el
KRAS
estado de mutación de las biopsias obtenidas en la rectoscopia índice y las piezas resecadas correspondiente después de la quimiorradioterapia y posterior resección se estudió en 47 pacientes (Figura 1). En 20 de estos 47 pacientes (42,6%) se detectó una mutación en el exón 2, 3, o 4 (figura 3). La mayoría de estas mutaciones (12/20) afectados codón 35. Discrepancia de la
KRAS
estado de mutación en las muestras obtenidas en la rectoscopia índice y en las muestras de los pacientes correspondientes después de la TRC se encontraron en seis pacientes (12,8% ) utilizando el ensayo de Snapshot ™. Todos ellos reveló un
KRAS
mutación en la biopsia pre-terapéutica, pero se determinó que eran de tipo salvaje si el análisis se realizó en un bloque de tejido representativo de la pieza resecada.
las sondas discrepantes fueron reevaluados con un sistema de prueba adicional utilizando el ensayo TheraScreen® KRAS. Utilizando este ensayo de prueba adicional, cuatro de estas seis muestras reveló una mutación KRAS concordantes en las muestras obtenidas en el índice y rectoscopia en la pieza resecada emparejados. Los dos casos restantes no pudieron haber sido reevaluado ya estaba disponible para la reevaluación (Tabla 2) sin ADN. Además, el ensayo TheraScreen® KRAS reveló la misma mutación KRAS en muestras de rectoscopia índice y la resección quirúrgica que nos permite sugerimos estos resultados ser confiable.
heterogeneidad intratumoral dentro de las biopsias de índice de rectoscopia y especímenes resecado quirúrgicamente
un problema potencial en la determinación de la
KRAS
estado de la mutación mediante la recopilación de una sola biopsia representa el error de muestreo. Esta trampa en el diagnóstico se basa en la suposición de que distintos clones de células tumorales existe en los tumores sólidos que alberga potencial heterogeneidad en
KRAS
mutaciones. Para evaluar el papel de la heterogeneidad intratumoral entre varias biopsias dentro del tumor,
KRAS
estado de la mutación se evaluó en múltiples biopsias obtenidas en la rectoscopia índice, así como en los bloques tumorales del espécimen resecado quirúrgicamente. Para este análisis sólo los casos con más de una muestra de tejido (biopsias de índice de rectoscopia: campo de 2-5 biopsias por paciente, muestras resecado quirúrgicamente: 3-5 bloques de tejido por paciente) fueron incluidos (figura 4) guía empresas.
en promedio, se obtuvieron tres biopsias en la rectoscopia índice y se sometieron estas muestras para
KRAS
análisis. Sólo en un solo paciente encontramos resultados discordantes para
KRAS
prueba en dos biopsias diferentes del mismo tumor se analizaron mediante el ensayo de Snapshot ™. Una de las muestras reveló una mutación G12V y el otro
KRAS
estado salvaje-tpye. Estas dos muestras de ADN discordantes fueron remitidos a TheraScreen® test de KRAS. Desafortunadamente, el análisis no ya no hay picos fueron detectables. Para volver a probar ninguna cantidad suficiente ADN estaba disponible
.
Debido a la gran regresión tumoral inducida por el CRT preoperatoria la heterogeneidad intratumoral en el espécimen resecado quirúrgicamente sólo pudo ser evaluada en un subgrupo de 12 pacientes, de los cuales más de un bloque que tiene un tumor estaba disponible (promedio de 4.2 bloques /paciente). En 6 de cada 12 pacientes encontramos una homogénea
KRAS
estado de comparación de al menos dos bloques usando el ensayo de Snapshot ™. En los otros 6 pacientes se detectaron resultados discrepantes de los
KRAS
estado de la mutación (Tabla 3). Después de reevaluación con el TheraScreen®
KRAS
prueba de que podríamos volver confirmar exactamente que
KRAS mutaciones
, comprobados en la biopsia previa del ensayo de Snapshot ™. Tras la corrección de los datos discordantes todos los bloques tumorales mostraron una homogénea
KRAS
de estado.
Discusión
A medida que el principal resultado de este estudio en el cáncer de recto que parece haber ninguna aparente heterogeneidad en el
KRAS
estado de la mutación. Esto se aplica para las muestras tomadas de tumores en la misma ocasión y para las muestras comprobadas antes y después de la TRC. Este análisis se basa en un alto número de muestras pre y posttherapeutic y por lo tanto representa un conjunto de datos rara. Teniendo en cuenta un método de detección sensible en relación con las cantidades de células tumorales viables, la determinación de la
KRAS
estado de mutación puede llevar a cabo de manera fiable en muestras de tumores de la biopsia pre-terapéutico obtenido en la rectoscopia índice así en el resecado especímenes después de la quimiorradioterapia neoadyuvante. Con respecto a las muestras de pre-terapéuticas ingenuos para radio y quimioterapia el ensayo Snapshot ™ parece proporcionar una herramienta de detección fiable, en particular, si se analizan biopsias múltiples para reducir al mínimo el riesgo de resultados falsos negativos. El número total de
KRAS
tumores -mutated en las biopsias pre-terapéuticas del 43% (20/47) coinciden más o menos datos de la literatura actual en este tema. Por otra parte, la distribución de las mutaciones individuales observadas fue también mucho más en línea con lo descrito hasta ahora [25, 26]. Esto nos hace confiar en que el ensayo Snapshot ™ produce resultados fiables en las muestras antes del tratamiento, es decir, cuando un número suficiente de células tumorales viables están presentes. En cuanto a las muestras obtenidas tras quimiorradioterapia, nuestro estudio sugiere que un método sensible, en particular, como el kit de Pyro TheraScreen® aprobado por la FDA debe ser preferido.
Nuestros resultados apoyan los resultados de Ondrejka et al. [14] que no encontró ninguna discrepancia cuando el
KRAS
estado en 17 pacientes con cáncer de recto se evaluó antes y después de la TRC neoadyuvante. Los primeros resultados de la secuenciación de próxima generación y análisis cuantitativos muestran
KRAS
mutaciones en la gran mayoría de las células neoplásicas [27]. En un estudio publicado recientemente por Demes et al. [15] en dos de cada 25 pacientes discrepantes un
KRAS
estado en muestras obtenidas antes y después de la terapia fue detectado. Como las dos técnicas aplicadas (secuenciación y Snapshot ™) están mucho más relacionados que puede ser la hipótesis de que la sensibilidad en ese estudio fue comparable a la técnica Snapshot ™ de nuestro estudio y puede haber fallado para identificar mutaciones en muestras muy degradadas. Este supuesto es consistente con Boissière-Michot et al. [16] quien recientemente señaló que, especialmente en el cáncer de recto después de la TRC de detección de falsos negativos de la
KRAS
estado de mutación representa un problema relevante que puede dar lugar a la negligencia grave. Esto se refiere a las cuestiones técnicas como un segundo resultado importante de este estudio.
Mientras que el ensayo Snapshot ™ parece tener una buena sensibilidad para detectar
KRAS
mutaciones en los tejidos viables (es decir, las biopsias pre-terapéuticas ) esta técnica no basta para detectar loci mutado en CRT neoadyuvante. La explicación más plausible es una desintegración masiva terapia provocado de las células tumorales. Las reacciones inflamatorias y del estroma dan como resultado un aumento sustancial de las células no mutadas en el área del tumor así "dilución" las células malignas restantes. Sin embargo, la aplicación de una técnica muy sensible para el análisis de mutación reveló los cambios observados por error. Esto está en línea con un estudio realizado por González de Castro D et al. que tiene en comparación sensibilidad de secuenciación de Sanger, en la que se basa realmente la técnica Snapshot ™, con Cobas, TheraScreen y pirosecuenciación masiva en paralelo [28] En caso de bajas fracciones de ADN mutante de la secuenciación de Sanger era menos sensible que los otros métodos investigados.
Boissière-Michot et al. [16] sugiere que una mayor sensibilidad puede lograrse mediante microdisección láser y el uso del ensayo TheraScreen®. En el presente estudio se puede demostrar que la microdisección manual de parece ser suficiente para reunir las cantidades adecuadas de células tumorales para análisis de ADN. Esto puede ser relevante para la práctica clínica, especialmente en los centros menos especializados, donde microdisección por láser de tejido tumoral frecuencia no se dispone
.
Como se ha señalado en los datos
KRAS
las pruebas de estado son aún poco frecuente para evaluar la verdadera tasa de casos discrepantes. Al añadir el presente documento más grande cohorte de pacientes y analizar el
KRAS
estado desde diferentes biopsias pre-terapéuticas del mismo tumor podemos añadir una confianza adicional a la práctica clínica de los
KRAS
prueba en el cáncer de recto. Por otra parte, estamos de acuerdo con Boissière-Michot et al. [16] que el tipo de técnica utilizada para las pruebas deben realizarse de acuerdo con el tejido tumoral disponible y los recursos financieros son de importancia si el tejido tumoral inicial es de cantidad o calidad menor. Esto es de importancia ya que los pacientes que reciben terapia anti-EGFR que tiene un
KRAS mutación
sufren de efectos secundarios innecesarios [29].
Conclusiones
En resumen, nuestros resultados indican la evaluación fiable de
KRAS
estado de mutación para la toma de decisiones terapéuticas en las biopsias pre-terapéuticas, así como en el tejido tumoral residual post-terapéutica. Discordancia puede ser un evento muy raro y es practicable puede ignorarse. El ensayo Snapshot ™ se puede utilizar de manera rentable para el análisis mutacional de muestras tumorales con un alto contenido de células tumorales, mientras que las pruebas más sensibles y caros deben reservarse para los casos no concluyentes y para las muestras con una baja cantidad de células tumorales como las que después de la TRC.