Extracto
factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) es producido por los ovarios las células cancerosas y se ha sugerido que desempeñar un papel importante en la progresión tumoral. En este estudio, mostramos que el tratamiento FGF2-regulado por la E-cadherina por hasta la regulación de sus represores transcripcionales, Slug y ZEB1, en células de cáncer de ovario humano. La inhibición farmacológica de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K), objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR), y MEK sugiere que tanto PI3K /Akt /mTOR y la señalización /ERK MAPK son necesarios para FGF2 inducida por E-cadherina baja regulación. Por otra parte, el FGF2 hasta reguladas Slug y la expresión a través de los ZEB1 /Akt /mTOR y de señalización MAPK /ERK vías PI3K, respectivamente. Por último, la invasión de células FGF2 inducida fue abolida por la inhibición de la PI3K /Akt /mTOR y las vías de MAPK /ERK, y la expresión forzada de E-cadherina disminuyeron la invasividad intrínseca de las células de cáncer de ovario, así como la invasión de células FGF2 inducida . Este estudio demuestra un nuevo mecanismo en el que FGF2 regula a la baja la expresión de E-cadherina a través de la activación de PI3K /Akt /mTOR y la señalización /ERK MAPK, y la sobre regulación de Slug y ZEB1 en células de cáncer de ovario humano.
Visto: Lau MT, WK Así, Leung PCK (2013) factor de crecimiento de fibroblastos 2 induce e-cadherina de Down-regulación a través de PI3K /Akt /mTOR y señalización MAPK /ERK en células de cáncer ovárico. PLoS ONE 8 (3): e59083. doi: 10.1371 /journal.pone.0059083
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia |
Recibido: 7 de Diciembre, 2012; Aceptado 11 de febrero de 2013; Publicado: 15 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Lau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos canadienses de Investigaciones Sanitarias de la PCKL. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer ovárico epitelial (EOC), que comprende el 90% de todos los tumores malignos de ovario, es la forma más común y letal de cáncer ginecológico en los países desarrollados [1], la tasa de mortalidad por esta enfermedad no ha cambiado mucho en los últimos 50 años.
factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) medie diversos eventos celulares, incluyendo la proliferación, la motilidad y la diferenciación [2], [3], y los tumores malignos de ovario son comunes en pacientes con elevada FGF2 [4] - [6]. Sin embargo, el papel de FGF2 en la progresión del cáncer de ovario sigue siendo controvertido. Los tumores de ovario con alta FGF2 citoplásmico están asociados con la reducción de la agresividad del tumor y el aumento de las tasas de supervivencia en comparación con los pacientes con niveles bajos de FGF2 [7], [8]. En contraste, anteriores
in vitro
estudios y el perfil de expresión de genes de cáncer de ovario avanzado sugieren que FGF2 actúa como un factor de crecimiento autocrino para la proliferación de células de cáncer de ovario [9] - [11] y la invasión [12]. Por otra parte, el FGF2 regula la expresión de otros genes implicados en la angiogénesis o metástasis, incluyendo metaloproteinasas [13], el factor de crecimiento endotelial vascular [14], y E-cadherina [13], [15], [16].
funciones e-cadherina como una proteína de célula-célula adhesión y supresor de tumor que está silenciado en muchos tumores malignos, y la pérdida de la expresión o función de e-cadherina es un acontecimiento común en la progresión del tumor [17], [18]. E-cadherina es conocido para suprimir la invasión de células tumorales, y la re-expresión de E-cadherina en los carcinomas de E-cadherina-deficiente revierte las células a un fenotipo menos invasiva, menos agresivo [19] - [21], mientras que la pérdida de E -cadherin está asociada con la metástasis del cáncer de ovario, diseminación peritoneal, y el mal pronóstico [22] - [26]. La pérdida de la función E-cadherina se puede lograr por la mutación del gen de la E-cadherina [27], el hipermetilación del promotor de E-cadherina [28], [29], y la represión transcripcional de E-cadherina [30] - [33]. Varios factores de transcripción se han identificado para suprimir la E-cadherina incluyendo Snail, Slug, Twist and ZEB1 a través de su interacción con el sitio de unión en el promotor de la E-cadherina [30] E-box, [31], [34] - [36] .
Los estudios anteriores han demostrado que suprime FGF2 E-cadherina en diversos tipos de células [13], [15], [16]; Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo en gran parte desconocido. En el presente estudio, hemos demostrado que reduce FGF2 E-cadherina mRNA y los niveles de proteína de una manera tiempo y dependiente de la dosis. Además, el aumento de Slug y la expresión ZEB1 través de la activación de la vía PI3K /Akt /mTOR y la vías de señalización MAPK /ERK, respectivamente, potencialmente media los efectos de FGF2 en E-cadherina. Por último, nuestros resultados indican que la baja regulación de FGF2 E-cadherina mediada mejora la capacidad de invasión de las células del cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Materiales
FGF2 fue comprado de Sigma-Aldrich (Ontario, Canadá). La rapamicina, U0126 y wortmanina se adquirieron de Calbiochem (San Diego, CA). anticuerpos E-cadherina se compraron de BD Biosciences (San Jose, CA). Akt, fosfo-Akt (Ser473), p44 /42 MAPK (ERK), fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204), p70S6K y fosfo-p70S6K (Thr389) anticuerpos fueron adquiridos de Señalización Cell Technology, Inc. (Beverly, MAMÁ). El anticuerpo β-actina se compró a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Peroxidasa de rábano picante conjugada con IgG de cabra anti-conejo de cabra y anticuerpos anti-IgG de ratón se adquirieron de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA).
Plásmido construcciones
El pcDNA-GFP (GFP) fue generosamente proporcionado por el Dr. Alonzo H. Ross [37]. El pcDNA-Ecadherin-GFP (cadE-GFP) fue una especie de regalo del Dr. Jennifer L. Stow [38].
Cultivo de células y transfections
líneas celulares de cáncer de ovario humano (OVCAR- 4 y Skov-3) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), y su uso fue aprobado por el Comité de Selección de la Universidad de Columbia británica clínica para investigación y otros estudios en seres humanos. Las células se cultivaron en medio 199: MCDB 105 (1:01; Sigma-Aldrich) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone Laboratories Ltd., Logan, UT), 100 U /ml de penicilina G y 100 mg /ml de estreptomicina ( Life Technologies, Inc., Rockville, MD) en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 95% de aire a 37 ° C. Las células se pasaron con 0,06% de tripsina (1:250) /0.01% EDTA en Mg
2 + /Ca
2 + - HBSS libre en la confluencia
Todas las transfecciones se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine. reactivo 2000 (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
transcripción inversa cuantitativa en tiempo real PCR (RT-qPCR)
ARN total se preparó usando el reactivo Trizol (Invitrogen ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ADNc de una sola cadena se sintetizó a partir de 2 g de ARN total de acuerdo con el procedimiento del fabricante (Amersham Biosciences, Quebec, Canadá). Los cebadores utilizados para SYBR Green RT-qPCR fueron los siguientes: para E-cadherina humana, el sentido, 5'-ACA CCG CCG CCT TAT GAT T-3 'y antisentido, 5'-GAA CCG TCG CTT CCT TCA-3'; para Slug, el sentido, 5'-GGA TTC CCCACA CAT TAC CT-3 'y antisentido, 5'-ACG GTG AGG GCA AGA AAA AG-3'; para ZEB1, sentido, 5'-ACG CCT GAA GAG GAC CAG AG-3 'y antisentido, 5'-TGC TGG TGT ATC TCC ATT TT-3'; y para GAPDH, sentido, 5'-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3 'y antisentido, 5'-CGC CCC ACT TGA TTT TGG -3'. RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando el Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System equipado con una placa de reacción de 96 pocillos óptica. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm se realizó usando el método Cq comparativo (método ΔΔCq) con GAPDH como gen de referencia.
análisis de transferencia de Western
Las células se recogieron en tampón de lisis [Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sodio, 1 mM EDTA, 0,1% SDS] que contiene cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich), y las concentraciones de proteína se determinaron utilizando la proteína DC de ensayo (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). La proteína (40 mg) se sometió a electroforesis en 7,5% de geles de SDS-poliacrilamida, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Bioscience), y se incubaron con anticuerpos primarios específicos a 4 ° C durante la noche. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa durante 1 hora y se visualizaron con una mejora de sustrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA).
Invasión de ensayo
Veinte -cuatro pocillos transwell insertos con un poro de 8 micras recubiertas con 1 mg /ml de Matrigel (50 así l /; ciencias BD, Mississauga, ON, Canadá) se utilizaron para evaluar la invasión de células. Las células tratadas con tripsina (1 × 10
5) en medio FBS al 0,1%, con o sin FGF2, se sembraron por triplicado en la cámara superior. 1% de medio FBS se colocó en los pocillos inferiores. Las cámaras se incubaron durante 24 horas a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera. Las células que no penetran en el filtro fueron borradas, y las células en la superficie inferior del filtro invadieron se fijaron con metanol enfriado con hielo y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. Los resultados se presentan como la media del número de células invadidas de cinco campos (a 100 aumentos) ± SEM de tres experimentos independientes.
Análisis de los datos
Todos los valores se expresan como media ± SEM de tres para seis experimentos independientes. Los datos se analizaron mediante un ANOVA de un factor seguido de Tukey de
post hoc
prueba utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA).
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Efecto de FGF2 en la expresión de E-cadherina en las células de cáncer de ovario
Como primer paso hacia el análisis del papel de FGF2 en la progresión del cáncer de ovario, se investigó el efecto de FGF2 en la expresión de e-cadherina en OVCAR-4 y las células SKOV-3. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con FGF2 abajo-regulados los niveles de ARNm de E-cadherina, tanto en un tiempo-(figura 1A) y forma dependiente de la dosis (Figura 1B). Del mismo modo, Western blot mostró que el tratamiento con FGF2 abajo-regulados los niveles de proteína E-cadherina en una forma dependiente de la dosis en células de cáncer de ovario (Figura 1C).
OVCAR-4 y Skov-3 células (A) fueron tratados con 10 FGF2 ng /ml durante 0 a 24 h como se indica, y después los niveles de e-cadherina de ARNm se analizaron por RT-qPCR. (B y C) de las células OVCAR-4 y SKOV-3 fueron tratados con diferentes dosis de FGF2 de 24 h después de lo cual los niveles de E-cadherina de ARNm (B) y los niveles de proteína (C) fueron analizados por RT-qPCR y transferencia Western, respectivamente . Los resultados representan la media ± SEM (n = 3; los valores sin una carta común son significativamente diferentes,
P Hotel & lt; 0,05). Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.
FGF2 induce E-cadherina baja regulación a través de la vía PI3K /Akt y MAPK /ERK vías
está bien documentado que las vías PI3K /Akt y MAPK /ERK con frecuencia se amplifican y sirven como vías de supervivencia en los carcinomas de ovario [39]. Además, FGF2 es conocida por activar la vía PI3K /Akt y MAPK vías /ERK [40], [41] y se ha reportado para regular E-cadherina baja regulación [42], [43]. Por lo tanto, analizamos si estas dos vías estaban involucrados en la supresión de la expresión de E-cadherina por FGF2. Examinamos primero el estado de fosforilación de Akt y ERK en el tratamiento con 10 FGF2 ng /ml a los 5, 15, 30, 60, y 120 minutos después del tratamiento y encontramos que el tratamiento FGF2 inducida por la fosforilación de Akt (Ser473) y ERK (Thr202 /Tyr204) de una manera dependiente del tiempo en células SKOV-3 (Fig 2A). Para determinar si estas dos vías estaban involucrados en la supresión de la expresión de E-cadherina por FGF2, hemos utilizado dos inhibidores farmacológicos, wortmannina y U0126, para bloquear específicamente la vía PI3K /Akt y MAPK /ERK vías, respectivamente, en Skov-3 células y OVCAR-4 (Fig 2B), respectivamente. Como se muestra en la Fig. inhibidores 2C, la PI3K y ERK aumentaron significativamente la expresión de E-cadherina basal y marcadamente disminuidos, pero no abolió por completo, FGF2 inducida por la supresión de la expresión de E-cadherina, lo que demuestra la implicación de la vía PI3K /Akt y MAPK /ERK en la FGF2 mediada baja regulación de la expresión de E-cadherina en las células de cáncer de ovario.
Skov-3 células (a) se trataron con 10 ng /ml FGF2 de 0 a 120 min, como se indica. Fosforilada y total de Akt, ERK fosforilada y total, y los niveles de beta-actina se analizaron mediante análisis de transferencia Western. (B) OVCAR-4 y las células SKOV-3 fueron pretratados con wortmanina (1 M) o U0126 (10 mM) durante 30 min antes de la adición de FGF2 (10 ng /ml) durante 30 min. los niveles de proteína ERK fosforiladas y el total de Akt, fosforilados y totales se analizaron por transferencia Western. El anticuerpo β-actina se utilizó como control para la igualdad de la carga. (C) OVCAR-4 y SKOV-3 células fueron pretratadas con wortmanina (1 M) o U0126 (10 mM) solo o en presencia de 10 ng /ml FGF2 durante 24 h, después de lo cual los niveles de proteína E-cadherina se analizaron por Western Blot. Los resultados representan la media ± SEM [(A) & amp; (B) n = 3; (C) n = 6; Los valores sin una carta común son significativamente diferentes,
P Hotel & lt; 0,05]. Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.
FGF2 diferencialmente hasta regula la expresión de Slug y ZEB1 a través de las Akt y MAPK /ERK vías PI3K /, respectivamente
para investigar si FGF2 regula a la baja la expresión de e-cadherina mediante la modulación de la regulación transcripcional de e-cadherina, hemos utilizado RT-qPCR para examinar los niveles de mRNA de los represores de la transcripción de cadherina e caracol, barra, haga girar y ZEB1. El tratamiento con FGF2 incrementado significativamente los niveles de ARNm de Slug y ZEB1 en un tiempo (Fig 3A y 3B) y de manera dependiente de la dosis (Fig 3C y 3D), pero no tuvo una influencia significativa en Snail y girar los niveles de ARNm (datos no mostrados). Para determinar si la PI3K /Akt y de señalización MAPK /ERK vías están implicadas en incrementos FGF2 inducida en Slug y mRNA ZEB1, las células fueron tratadas con el inhibidor de PI3K (wortmanina) o un inhibidor de MEK (U0126) en presencia o ausencia de FGF2. Curiosamente, wortmanina suprimió de forma significativa el nivel de ARNm de SLUG basal y totalmente suprimido los efectos de FGF2 en los niveles de ARNm de SLUG (Figura 3E), mientras que los niveles de mRNA ZEB1 FGF2-reforzada no se vieron afectados (Figura 3F). Por otro lado, el tratamiento U0126 abolió totalmente los efectos de FGF2 en los niveles de ARNm (Fig ZEB1 3F), el fármaco no tuvo efecto sobre los niveles de ARNm de SLUG (Fig 3E).
(A y B) OVCAR-4 y SKOV-3 células fueron tratadas con fueron analizados por RT-qPCR 10 FGF2 ng /ml durante diversos tiempos, y los niveles de ARNm de Slug (a) y ZEB1 (B). (C y D) OVCAR-4 y las células SKOV-3 fueron tratados con diferentes dosis de FGF2 durante 6 h (Slug; C) o 24 h (ZEB1; D), y los niveles de ARNm se analizaron por RT-qPCR. OVCAR-4 y las células SKOV-3 (E y F) fueron pretratadas con wortmanina (1 M) o U0126 (10 mM) durante 30 min antes de la adición de 10 ng /ml FGF2 durante 6 h (E) y 24 h ( F). los niveles de mRNA de babosas y ZEB1 se analizaron por RT-qPCR. Los resultados representan la media ± SEM (n = 3; los valores sin una carta común son significativamente diferentes,
P Hotel & lt; 0,05). Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.
FGF2 inducida por E-cadherina baja regulación a través de la vía PI3K /Akt /mTOR
A continuación, investigado el papel de la vía mTOR en FGF2 inducida por E-cadherina regulación a la baja, debido a la mTOR es una vía de señalización corriente abajo de PI3K /Akt que se ha demostrado que participan en E-cadherina baja regulación [44]. Como se muestra, el tratamiento con FGF2 induce la activación de la señalización de mTOR de una manera dependiente del tiempo en células SKOV-3, como se indica por la fosforilación de la molécula de aguas abajo mTOR, p70S6K (Fig 4A). Para determinar si la vía de señalización de la vía PI3K /Akt /mTOR estaba involucrado en la regulación de los niveles de E-cadherina por FGF2, se utilizó la rapamicina inhibidor de mTOR específica para bloquear la vía mTOR en Skov-3 células y OVCAR-4 (figura 4B) . Al igual que en wortmannin, la rapamicina totalmente abolida la elevación inducida por FGF2 de Slug ARNm (Figura 4C), mientras que la rapamicina no mostraron ningún efecto sobre los niveles de ARNm ZEB1 (figura 4D). Por otra parte, la rapamicina tratamiento aumentó significativamente los niveles de la proteína E-cadherina y marcadamente disminuida el efecto supresor de FGF2 en los niveles de proteína E-cadherina (Figura 4E), lo que indica que la vía de la PI3K /Akt /mTOR participa en FGF2 inducida por E-cadherina supresión en las células de cáncer de ovario.
células SKOV-3 (a) se trataron con 10 ng /ml para FGF2 0 a 120 min, como se indica. niveles p70S6K fosforilados y totales se analizaron por análisis de transferencia Western. (B) células OVCAR-4 y SKOV-3 fueron pretratados con wortmanina (1 M) o rapamicina (20 nM) durante 30 min antes de la adición de 10 ng /ml FGF2 para 30 min. Fosfo-Akt y Akt, junto con fosfo-p70S6K y los niveles de proteína p70S6K se analizaron por transferencia Western. El anticuerpo β-actina se utilizó como control para la igualdad de la carga. (C y D) OVCAR-4 y las células SKOV-3 fueron pretratados con rapamicina (20 nM) durante 30 min antes de la adición de 10 ng /ml FGF2 durante 6 h (C) y 24 h (D). los niveles de mRNA de babosas y ZEB1 se analizaron por RT-qPCR. (E) OVCAR-4 y SKOV-3 células fueron pretratadas con rapamicina (20 nM) durante 30 min antes de la adición de 10 ng /ml FGF2 durante 24 h, después de lo cual los niveles de proteína E-cadherina se analizaron por transferencia Western. Los resultados representan la media ± SEM [(A) - (D) n = 3; (E) n = 6; valores sin una carta común son significativamente diferentes,
P
& lt; 0,05). Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.
La activación de la vía PI3K /Akt /mTOR y vías de señalización /ERK MAPK son críticos para la invasión celular inducida por FGF2
Varias líneas de evidencia indican que FGF2 juega un papel importante en las propiedades invasivas de las células cancerosas humanas [45], [46]. Por lo tanto, hemos examinado el efecto de FGF2 en la invasión de células en células de cáncer de ovario utilizando ensayos de invasión Transwell recubiertas con Matrigel. células OVCAR-4 y SKOV-3 fueron tratados con concentraciones crecientes de FGF2, dieron como resultado una estimulación dependiente de la dosis de la invasión (Fig 5A). También se evaluó la participación de la vía PI3K /Akt /mTOR y las vías de señalización MAPK /ERK en la invasión de células estimuladas con FGF2. Nuestros resultados mostraron que la invasión de células FGF2 inducida fue marcadamente disminuida, pero no totalmente, por el tratamiento con wortmanina, rapamicina o U0126 solo (figura 5B), FGF2 mientras que la inhibición combinada de la PI3K /Akt /mTOR y de señalización MAPK /ERK vías totalmente suprimidos la invasión de células inducida (Fig 5B). En conjunto, estos resultados indican que la MAPK /ERK y PI3K /Akt /mTOR vías están implicadas en la invasión de células de cáncer de ovario FGF2 inducida.
células cáncer de ovario (A) se sembraron en insertos Transwell recubiertas con Matrigel y tratados con diferentes dosis de FGF2 para 24 h. (B) Las células se trataron previamente con wortmanina (1 M), la rapamicina (20 nM) o U0126 (10 mM) durante 30 min y se sembraron en insertos Transwell recubiertas con Matrigel y se cultivaron con 10 ng /ml FGF2 para 24 h. Los resultados representan la media ± SEM [(A) n = 3; (B) n = 6; Los valores sin una carta común son significativamente diferentes,
P Hotel & lt; 0,05]. Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.
El descenso de regulación de la E-cadherina media la invasión de células de cáncer de ovario FGF2 estimulada
A continuación, pregunta si la regulación por disminución de la E-cadherina mediada por la invasión celular inducida por FGF2. SKOV-3 células fueron transfectadas transitoriamente con el tipo salvaje E-cadherina humana plásmido de expresión durante 48 h y luego se trataron con FGF2 por otras 24 h (Fig 6A). tratamiento FGF2 reduce los niveles de proteína E-cadherina en células transfectadas con el vector vacío, mientras que no se detectó ningún efecto en células que sobreexpresan E-cadherina (Fig 6A). La sobreexpresión de E-cadherina se redujo de invasión basal y abolió la capacidad de FGF2 para inducir la invasión de células de ovario cáncer (Fig 6B), lo que implica que la E-cadherina juega un papel esencial en la invasión de células de cáncer de ovario FGF-estimulado.
( a) SKOV-3 células fueron transitorias transfectadas con el pcDNA-GFP (GFP) o humanos E-cadherina plásmidos de expresión (Ecad-GFP) durante 48 h. Después de la transfección, las células se trataron con 10 ng /ml FGF2 durante 24 h y se sometieron a inmunotransferencia para la E-cadherina y β-actina. (B) Después de 48 h de transfección, las células tratadas con tripsina se sembraron en insertos Transwell recubiertos con Matrigel, y se cultivaron con 10 ng FGF2 /ml durante 24 h. Los resultados representan la media ± SEM (n = 6; los valores sin una carta común son significativamente diferentes,
P Hotel & lt; 0,05). Los datos se analizaron por ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.
Discusión
FGF2, que es un miembro de la familia FGF, presenta normalmente en el plasma a una concentración de menos de 10 pg /ml, y niveles elevados (hasta 6 ng /ml) se pueden encontrar en el fluido ascético de pacientes con cáncer de ovario [4]. Los estudios clínicos han demostrado un alto nivel de FGF2 y su ARNm en los cánceres primarios de ovario avanzado en comparación con ovarios normales [6]. Además, varios estudios han demostrado un aumento de los niveles plasmáticos de FGF2 en pacientes con cáncer de ovario [4], [47], [48]. Los niveles elevados de FGF2 y sus receptores presentes en los tumores malignos de ovario sugieren que FGF2 juega un papel importante en la progresión del tumor de ovario [9]. Varios
in vitro
estudios y el perfil de expresión génica estudios en el cáncer de ovario avanzado revelan que las funciones de FGF2 como un factor de crecimiento autocrino para la proliferación de células de cáncer de ovario [9] - [11], y la invasión [12]. Por otra parte, FGF2 regula la expresión de varios genes implicados en la angiogénesis o metástasis [13] - [15], [49], lo que sugiere la señalización FGF2 puede ser una diana terapéutica potencial. Sin embargo, el papel de FGF2 en la progresión del tumor de ovario que queda por esclarecer. El presente estudio muestra que FGF2 indujo la baja regulación de la expresión de E-cadherina, que está implicado en la invasión de células de cáncer de ovario FGF2 inducida. Además, nuestros estudios sugieren que FGF2 ejerce sus efectos en células de cáncer de ovario humano a través de la activación de la vía PI3K /Akt /mTOR y vías de señalización /ERK MAPK y el aumento de la expresión subsiguiente de Slug y ZEB1.
jugadas FGF2 un papel fundamental en diversas actividades biológicas, incluyendo la proliferación celular, la migración, y diferenciación [2], [3]. FGF2 también ha sido descrito como un factor angiogénico [50] y más recientemente se ha demostrado que contribuyen al desarrollo de la metástasis peritioneal [51]. la señalización de FGF desregulada es común en muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer de ovario [4] - [6], [52], lo que sugiere que esta señalización puede promover el desarrollo y progresión del tumor. FGF2 se ha informado de modular la expresión de E-cadherina en una variedad de tipos de células. Sin embargo, su papel en la expresión de E-cadherina parece ser el tipo de célula específico. En el adenocarcinoma de páncreas, FGF-1 y FGF2 se ha demostrado que un máximo de regular la expresión de E-cadherina [53]. En contraste, la baja regulación de la expresión de E-cadherina con el tratamiento FGF2 se ha observado en las células epiteliales tubulares y células de carcinoma de NBT-II, lo que resulta en un aumento de la migración celular y la invasión [13], [15]. También, FGF2 se ha demostrado que regular a la baja la expresión de E-cadherina en células endoteliales de vena umbilical humana a través de la señalización de JNK vía [16]. Los datos actuales apoyan un papel crucial para FGF2 en la baja regulación de la E-cadherina en células de carcinoma de ovario a través de los /Akt /mTOR y de señalización MAPK /ERK vías PI3K. La unión de FGF2 a sus receptores conduce a la activación de las vías de señalización corriente abajo, tales como PI3K /Akt y MAPK /ERK [40], [41]. Nuevas evidencias sugieren que estas vías están involucrados en la regulación de la E-cadherina [42], [43]. Por otra parte, la inhibición aberrante de la vía mTOR, que está aguas abajo de la señalización de PI3K /Akt bloqueado FGF2 inducida por E-cadherina baja regulación y la invasión celular. Estos resultados son consistentes con nuestro estudio anterior demuestra un requisito para la señalización de mTOR en el factor de growrh similar a la insulina 1 inducida por E-cadherina baja regulación en las células de cáncer de ovario [54]. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que la vía PI3K /Akt /mTOR y MAPK /ERK activación dependiente de FGF2 está involucrado en FGF2 inducida por E-cadherina baja regulación y la invasión celular en las células de cáncer de ovario.
La pérdida de la expresión del gen e-cadherina se debe principalmente a una sobreexpresión de represores transcripcionales, incluyendo caracol, barra y ZEB1 [34] - [36]. De hecho, los niveles elevados de ARNm de Slug y ZEB1 se han encontrado en el carcinoma de ovario [55], [56]. Por otra parte, un estudio previo demostró que la sobreexpresión de Slug en Skov-3 células se traduce en la baja regulación de la E-cadherina, el aumento de la motilidad y la invasión [57]. Sin embargo, se sabe mucho menos acerca de la regulación de estos represores transcripcionales. expresión Slug puede ser regulada por PI3K /Akt de señalización, que también puede ser activado por tratamiento FGF [40], [41], [43], [45]. De acuerdo con estos resultados, la inhibición de la señalización de PI3K /Akt por wortmanina redujo la basal y abolió Slug niveles de expresión FGF2 inducida, lo que sugiere que esta vía es crítica para la expresión de Slug. La activación de la señalización de PI3K /Akt se ha demostrado que estimula la expresión de Slug través de GSK-3β señalización /β-catenina y para posteriormente regular a la baja E-cadherina en carcinosarcomas uterinos y hepatocitos normales [43], [58]. Es bien sabido que la señalización de PI3K /Akt induce la acumulación de β-catenina nuclear mediante la inhibición de GSK3 [59], [60]. Además, la inhibición de la señalización mTOR por bloques de rapamicina aumenta la translocación β-catenina en el núcleo en las células beta pancreáticas humanas [61]. FGF2 puede activar la señalización PI3K /Akt y GSK3 sus aguas abajo y mTOR para inducir la transcripción-catenina que dependen de β incluyendo la de Slug. Se requieren más estudios para dilucidar el mecanismo exacto de la elevación de los niveles de Slug por la vía mTOR. En particular, los niveles de proteína E-cadherina fueron claramente aumentaron rapamicina, mientras que los niveles basales de ARNm de Slug no se vieron afectados. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la vía de señalización mTOR también modula los niveles de E-cadherina en forma Slug-independiente. Curiosamente, el tratamiento con el inhibidor de MEK U0126 sólo se bloqueó la expresión inducida por ZEB1 FGF2, pero no inhibió la expresión de Slug FGF2 inducida. Nuestros datos sugieren que MAPK /ERK es un factor de activación aguas arriba ZEB1 en células de cáncer de ovario
in vitro
. FGF2 se ha demostrado que activa la vía MAPK /ERK en diversas células de cáncer [62], [63], y mostrar en OVCAR-4 y las células SKOV-3 que ZEB1 expresión es MAPK /ERK-dependiente. Estos resultados son consistentes con un estudio previo que demuestra un requisito para la señalización de MAPK /ERK en la expresión ZEB1 inducida por IGF-1 en células de cáncer de próstata [42]. Por otra parte, un estudio reciente demostró que ERK2, pero no ERK1, reduce los niveles de E-cadherina mediada por vía FRA1 ZEB1 /2 en una línea no transformado humano de células epiteliales mamarias, células MCF-10A [64]. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que FGF2 regula diferencialmente Slug y ZEB1 expresión a través de la vía PI3K /Akt /mTOR y las vías de señalización MAPK /ERK en células de cáncer de ovario humano.
La importancia biológica de la reducción de E-cadherina en el cáncer de ovario invasividad se demuestra por el hecho de que la sobreexpresión de la E-cadherina bloqueó la invasión de células FGF2 inducida por
in vitro
. La evidencia indica que la pérdida de E-cadherina está asociada con la metástasis del cáncer de ovario, diseminación peritoneal y pobre supervivencia de los pacientes [22] - [26], lo que sugiere que las funciones de E-cadherina como un supresor de la invasión tumoral. De hecho, silenciando E-cadherina de siRNA aumenta la invasión de células de cáncer de ovario a través de una regulación de la α5-integrina [24]. También hemos encontrado que la E-cadherina desmontables por ARN de interferencia aumenta la vía PI3K /señalización Akt [65], que, a su vez, media la invasión E-cadherina-agotamiento inducida en las células de cáncer de ovario (Lau
et al
., sin publicar). Por otra parte, la sobreexpresión de un mutante de E-cadherina dominante negativo en células de carcinoma de ovario resultados en aumento de la migración de células mesenquimales [66]. Nuestros resultados demuestran que FGF2 mejora la invasividad de las células por abajo de la regulación E-cadherina y que la sobreexpresión E-cadherina inhibe la invasión basal y suprime la invasión FGF2 inducida. La PI3K /Akt y MAPK /ERK vías de señalización están implicadas en la invasión FGF2 inducida de células [45], [46]. Además, también se han descrito mecanismos adicionales, tales como la elevación de la actividad de la proteasa /secreción, la modulación de la citoesqueleto de actina, y aumento de la motilidad [12], [46], [67]. Mientras que la pérdida de E-cadherina se ha demostrado que estimula la invasión MMP-mediada en el cáncer de próstata y células tumorales bronquiales [68], [69]. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que E-cadherina actúa como un supresor crucial de la invasividad del cáncer de ovario, y junto con otros mecanismos descritos, la pérdida de E-cadherina juega un papel importante en la invasión celular inducida por FGF2.
en resumen, nuestros resultados muestran que FGF2 regula a la baja la expresión de e-cadherina, probablemente a través de la supresión de la transcripción de Slug y ZEB1, que se expresan de forma concomitante por la activación de los /Akt /mTOR y MAPK /ERK vías PI3K. Además, el presente estudio sugiere que la baja regulación de la E-cadherina media la invasión de células de cáncer de ovario FGF2 inducida (Figura 7). La inhibición de cualquiera de PI3K /Akt /mTOR o los resultados de señalización MAPK /ERK en el FGF2 parcialmente bloqueado inducida por E-cadherina baja regulación y la invasión celular. Por lo tanto, estos resultados indican que el diseño de tratamientos combinados dirigidos cascadas de señalización relacionadas con FGF2-puede tener implicaciones relevantes en la prevención y el tratamiento de esta patología.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Alonzo H. Ross (Universidad de la Escuela de Medicina de Massachusetts, Massachusetts), el Dr. Jennifer L. Stow (Universidad de Queensland, Brisbane, Queensland, Australia) por la amabilidad y generosidad que nos da las construcciones.
PCKL es beneficiario de un Premio Científico Distinguido del Instituto de Investigación infantil y Familiar.