Extracto
La agresividad del adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) se caracteriza por su alto potencial metastásico y la falta de terapias eficaces, que es el resultado de una falta de comprensión de los mecanismos implicados en la promoción de metástasis de PDA. Se identificaron Anexina A2 (ANXA2), un miembro de la familia de anexina de proteínas de unión a fosfolípidos dependientes de calcio, como una nueva molécula que promueve la invasión y las metástasis PDA. Encontramos ANXA2 para ser un antígeno asociado PDA-reconocido por los sueros post-tratamiento de los pacientes que demostraron una supervivencia prolongada después del tratamiento con una vacuna específica-PDA. de la superficie celular ANXA2 aumenta con el desarrollo y la progresión PDA. Desmontables expresión ANXA2 de interferencia por ARN o el bloqueo con anticuerpos anti-ANXA2 inhibe
in vitro
invasión de las células PDA. Además, después de la vacunación inhibe sueros de pacientes
in vitro
invasión de las células PDA, lo que sugiere que los anticuerpos anti-ANXA2 terapéuticos son inducidos por la vacuna. Además, la localización de la superficie celular de ANXA2 es tirosina 23 dependiente de la fosforilación; y se requiere la fosforilación de la tirosina 23 para PDA invasión. Hemos demostrado que se requiere de la tirosina 23 de la fosforilación que resulta en la expresión de superficie de ANXA2 para inducida por TGF, la transición epitelial-mesenquimal mediada por Rho (EMT), que une la función celular de ANXA2 que se mostró anteriormente a estar asociado con pequeños reordenamientos del citoesqueleto GTPasa regulada , para el proceso de EMT en PDA. Por último, el uso de modelos de PDA ratón, se demostró que shRNA knock-down de
ANXA2
, una mutación en la tirosina 23, o anticuerpos anti-ANXA2, inhibir la metástasis de PDA y prolongar la supervivencia del ratón. Por lo tanto, ANXA2 es parte de una nueva vía molecular metástasis PDA subyacentes y un nuevo objetivo para el desarrollo de la terapéutica PDA
Visto:. Zheng L, K Foley, Huang L, Leubner A, G Mo, Olino K, et Alabama. (2011) 23 Tirosina fosforilación dependiente de la localización de la superficie celular de la anexina A2 se requiere para la invasión y la metástasis del cáncer de páncreas. PLoS ONE 6 (4): e19390. doi: 10.1371 /journal.pone.0019390
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 4, 2011; Aceptado: March 28, 2011; Publicado: 29 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Zheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el NCI SPORE en cánceres gastrointestinales P50 CA062924-14 (EMJ), Fundación Lustgarten (EMJ), Broad Foundation (EMJ), NCI R01 CA88058 (EMJ), Fundación Viragh, NIH 1K23 CA93566-01A1 (DL), ASCO joven Premio al investigador (LZ), NIH 5T32 CA0090701-28 Formación Grant (LZ), el Centro de cáncer de páncreas Goldman Sol (LZ). El Dr. Jaffe es el primero en recibir el Dana y Albert "Cubby" Broccoli Dotada Cátedra. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. He leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: En virtud de un acuerdo de licencia entre BioSante y la Universidad Johns Hopkins, la Universidad tiene derecho a pagos por hitos y regalías sobre las ventas del producto de vacuna se describe en este manuscrito. No tenemos ningún otro conflicto de interés relevante para darse a conocer. P. Illei ha dado una conferencia patrocinada por Leica Microsystems. Esto no altera nuestra adhesión a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDA) sigue siendo un cáncer letal con una tasa de supervivencia global a 5 años de & lt; 5% [1]. La incapacidad de diagnosticar a tiempo, un alto potencial metastásico, y la cuenta de resistencia a los medicamentos por su baja tasa de supervivencia. Aunque está bien establecido que la patogénesis de PDAs sigue etapas escalonadas que muestran el aumento de atipia celular y acumulan mutaciones clonales o expresión aberrante de oncogenes o genes supresores de tumores tales como
K-Ras
,
p16
,
p53
,
y DPC4 /SMAD4
[2], los fármacos que se dirigen a estas anormalidades moleculares aún no se han traducido en una mejora de las respuestas clínicas [3]. La naturaleza agresiva del PDA se caracteriza por su alta incidencia de metástasis en el momento del diagnóstico inicial y la alta incidencia de metástasis temprana después de la resección quirúrgica. Sin embargo, poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares que subyacen a la invasión y procesos metastásicos. Una mejor comprensión de estos mecanismos es esencial para el desarrollo de tratamientos innovadores y mejorados para el PDA.
enfoques de tratamiento de inmunoterapia del cáncer están en desarrollo para PDA. Hemos desarrollado un alogénico, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) que secreta la vacuna PDA para pacientes con PDA [4], [5], [6]. Fase I y II de los ensayos que evalúan esta vacuna en pacientes con CAP resecado demostrado tanto las respuestas clínicas e inmunológicas [4], [5]. Este enfoque proporciona la inmunoterapia reactivos linfocitos inmunizados para la identificación de antígenos PDA novedosos que se están probando como objetivos para la terapia PDA [7], [8]. Los objetivos terapéuticos potenciales identificados hasta ahora también han proporcionado claves importantes para el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen en el desarrollo PDA y metástasis. Aquí se presenta la utilización de un enfoque proteómico funcional que identifica anexina A2 (ANXA2) como una nueva diana candidato PDA de la respuesta inmune. Además, se muestra que se requiere tirosina 23 de la fosforilación dependiente de la localización de la superficie celular de la anexina A2 de transición epitelial a mesenquimal, invasión y metástasis formación de PDA.
Resultados
Identificación de ANXA2 como un nuevo antígeno asociado a un tumor candidato biomarcador PDA y
Se utilizó inmunizados sueros de dos sujetos que demostraron tanto las pruebas de post-vacunación respuestas inmunes celulares y prolongó la supervivencia libre de enfermedad (DFS) y supervivencia global (SG) en un estudio de fase II de un secretoras de GM-CSF vacuna entera PDA celular [4] para seleccionar extractos de células enteras de las líneas celulares PDA vacuna que sirvieron como el proteoma. Los extractos de proteína se separaron mediante una electroforesis bidimensional (2-DE); y se realizó el análisis de inmunotransferencia de comparar el reconocimiento de antígenos por los sueros antes y después de la vacunación. sueros proteínas reconocidas por los sueros post-vacunación con respecto a antes de la vacunación fueron identificados por espectrometría de masas. ANXA2 era una proteína identificada en las inmunotransferencias de sueros post-vacunación tanto de los pacientes evaluados. A fin de evaluar la prevalencia de vacunación posterior respuestas humorales a ANXA2, ANXA2 recombinante purificada se utiliza para la inspección antes de la vacunación y los sueros post-vacunación de 16 pacientes adicionales tratados en este estudio de fase II tanto por ELISA y Western Blot (Figura S1). anticuerpos anti-ANXA2 inducida por la vacuna, medida por un ELISA tipo sándwich, se detectaron en 6 de los 7 pacientes que demostraron una SSE superior a 36 meses [4], y sólo en 1 de los otros 9 pacientes que no demostraron SSE a largo plazo ( Tabla 1). Estos datos proporcionan la primera evidencia de que ANXA2 es una diana de anticuerpo de la respuesta inmune contra la PDA. Se ha informado de
ANXA2 que se sobreexpresa en una variedad de cánceres incluyendo PDA en comparación con los tejidos normales [9]. Sin embargo, ANXA2 es normalmente una proteína citoplasmática y luminal que residen en el tejido pancreático, y los estudios anteriores [9] no han determinado si la expresión ANXA2 superficie celular es un patrón dominante en los tejidos PDA. Por lo tanto, se analizó la localización de expresión ANXA2 por inmunohistoquímica (IHC) en los tumores extirpados de 52 de los 60 pacientes tratados en nuestro estudio de fase II para los cuales estaban disponibles para la tinción de muestras. Encontramos que las células epiteliales ductales pancreáticas normales muestran débil tinción citoplásmica y lumenal por IHC, mientras que la superficie celular ANXA2 localizadas aumenta con la progresión de las lesiones PanIN a invasiva PDA (Figura S2). Específicamente, 39 (75%) de 52 muestras de tejidos frescos tumor pancreático probados tienen una mayor expresión de la superficie celular de ANXA2 (Figura S2). Estos datos proporcionan más apoyo que la expresión de la superficie ANXA2 se asocia con el desarrollo de PDA y como tal puede servir como una diana inmunológica.
La inhibición de la ANXA2 suprime la
in vitro
invasión de las células PDA
a continuación se investigó si la localización de la superficie celular de la ANXA2 juega un papel biológico en la facilitación de la invasión PDA. ANXA2 ha informado de obligar a los fosfolípidos de membrana asociada y tienen diversas funciones celulares, incluyendo la activación del plasminógeno, la fibrinólisis, el transporte de membrana, reorganización del citoesqueleto, la angiogénesis, la adhesión celular y la migración. ANXA2 también funciona como un receptor de alta afinidad para múltiples ligandos extracelulares que han sido implicados en el desarrollo del cáncer, invasión y metástasis [10], [11], [12], [13]. Para probar directamente si ANXA2 está involucrada en la invasión de PDA, la expresión ANXA2 fue derribado en células PDA por la interferencia de ARN (Figura 1A). Knock-down de
ANXA2
suprimió el
in vitro
invasión de las células PDA en un ensayo de cámara de Boyden (Figura 1B y la Figura S3). La inducción de anticuerpos contra ANXA2 que se observa en pacientes vacunados con DFS prolongada (Tabla 1) sugiere que los anticuerpos anti-ANXA2 pueden tener un efecto directo anti-tumor. Por lo tanto, hemos probado ambos anticuerpos policlonales y monoclonales de ratón anti-conejo ANXA2 y encontramos que puedan inhibir específicamente
in vitro
invasión de las células PDA (Figura 1 C, D). Por otra parte, los sueros de pacientes inmunizados que demostraron una respuesta después de la vacunación de manera similar ANXA2 inhibida
in vitro
invasión de las células PDA (Figura 1E). Los datos presentados enlace hasta ahora el aumento de la expresión de la superficie celular de la ANXA2 con capacidad de invasión PDA y sugiere que las respuestas de los anticuerpos inducidos por la vacuna pueden inhibir este aspecto de la progresión de la PDA. Sin embargo, el mecanismo por el cual se produce la invasión ANXA2 mediada PDA aún no se ha explorado. Curiosamente, la capacidad invasiva de las células de PDA no se correlaciona con su tasa proliferativa lo que sugiere un mecanismo independiente (Figura S3). Para descubrir otros mecanismos reguladores que dan cuenta de la capacidad de invasión de las células PDA, hemos examinado aún más la localización subcelular de la ANXA2 en diversas líneas celulares PDA por tinción fluorescente con anticuerpos anti-ANXA2 (Figura S4). ANXA2 se localiza predominantemente en la membrana celular en todas las líneas celulares 8 PDA encontrado que tienen una alta capacidad de invasión, mientras que ANXA2 está presente predominantemente en el citoplasma de las líneas celulares con baja capacidad de invasión (Figura S4 y en la Tabla S1). Estos datos apoyan aún más el papel de ANXA2 translocación desde el citosol a la superficie celular /membrana en la mejora de la invasión de células PDA.
A. Análisis de transferencia Western que muestra que
ANXA2
siRNA inhibe la expresión de ANXA2 en una línea celular PDA. Extractos de células enteras de Panc10.05 tratados con siRNA control y
ANXA2
siRNA, respectivamente, fueron borrados por el anticuerpo policlonal de conejo anti-ANXA2 (panel superior) y por el anticuerpo policlonal de conejo anti-GAPDH (panel inferior). B.
in vitro
ensayo de invasión en mostrar que
ANXA2
siRNA inhibe la capacidad de invasión de la línea celular 10.05 PDA. células invadidas se midieron mediante ensayos de MTT y se normalizó para el número de células totales. anticuerpos anti-ANXA2 C. policlonales inhiben la capacidad de invasión de las células Panc10.05. D. anticuerpos monoclonales de ratón anti-ANXA2 (mAb) inhiben la capacidad de invasión de ratón y las células Panc02 Panc10.5 humanos. Para C y D, anticuerpo de conejo anti-ANXA2, control Ig de conejo, de ratón anti ANXA2-mAb (clon: ZO14), o control de isotipo de ratón se añadió IgG1 en los medios de cultivo a una concentración final de 25 mg /ml en todo el
in vitro
ensayos de invasión, respectivamente. E. Sólo después de la vacunación sueros de pacientes (3.009 y 3.028) que demostraron respuestas de anticuerpos anti-ANXA2, pero no de pacientes (3.037 y 3.039) que no demuestran respuestas de anticuerpos anti-ANXA2, inhiben la invasión de células Panc10.05. Antes y después de la vacunación sueros se añadieron al medio de cultivo en una proporción de 1:50. tres experimentos se realizaron para B-E.
La fosforilación de la ANXA2 en Tyr23 promueve la localización de la superficie celular de la ANXA2 y la capacidad de invasión de las células PDA
ANXA2 es un sustrato para Src quinasa, que fosforila ANXA2 en Tyr23 tanto
in vivo
y
in vitro
[10], [11], [12], [13], y la fosforilación de Tyr23 se ha sugerido que es importante para la dispersión celular normal y la morfogénesis de ramificación [14], [15]. ANXA2 también se informó de que la tirosina fosforilada cuando se localiza en la superficie celular bajo estrés [16]. Dado que las células malignas a menudo imitan las células normales que han sido sometidos a una variedad de estímulos de estrés, postulamos que ANXA2 se transloca a la superficie celular como una proteína tirosina-fosforila durante la tumorigénesis también. Para probar esto, se eluyó la fracción de la superficie celular de las células ANXA2 de Panc10.05 PDA, que tienen celular localización en la superficie de la ANXA2 (Figura S4 y el cuadro S1), y encontramos la fracción de la superficie celular de la proteína ANXA2 es de hecho una tirosina proteína fosforilada (Figura 2A). Por el contrario, ANXA2 no se pudo eluir de la superficie celular de las células Panc 3.11, una línea celular de PDA que demostró localización citoplasmática de ANXA2 (Figura S4). Para probar si la fosforilación de la ANXA2 en Tyr23 es importante por su localización en la superficie celular PDA, generamos un panel de plásmidos que expresan ya sea de tipo salvaje ANXA2 (ANXA2
WT), la proteína mutante ANXA2 (ANXA2
Y23A) en el que Tyr23 se alteró a un residuo de alanina hacer un mutante no fosforilable, o la proteína mutante ANXA2 (ANXA2
Y23E) en la que Tyr23 se alteró a un residuo de ácido glutámico imitando la fosforilación constitutiva. Cuando las células se transfectaron con Panc10.05 estos plásmidos que expresan ANXA2 etiquetados por GFP [17], ANXA2
WT-GFP y ANXA2
Y23E-GFP localizada predominantemente a la superficie celular de las células de PDA. Por el contrario, ANXA2
Y23A-GFP localizado en el citoplasma (Figura 2B). Estos resultados fueron confirmados mediante el uso de un lentivirus para ANXA2
WT, ANXA2
Y23A, o ANXA2
Y23E expresan constitutivamente en las células PDA (Figura S4). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la fosforilación en resultados Tyr23 en la localización de ANXA2 en la superficie celular.
A. Panc10.05 células y se incubaron Panc3.11 ya sea con tampón que contenía EGTA o tampón EGTA libre. Dos eluciones diferentes de dos líneas celulares PDA diferentes, como se indica, se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-ANXA2 (carriles 1-4) o anti-fosfotirosina (anti-pTyr) anticuerpos (carriles 9-12). Después de la elución, las dos líneas celulares de PDA se lisaron y los lisados se immunoprecipated por anticuerpos anti-pTyr (carriles 5-8). ANXA2 B. marcado con GFP en células Panc10.05. Paneles superiores: GFP señales; paneles inferiores: se superponen imágenes de señales de GFP y DAPI de los núcleos. expresión etiquetado con FLAG C. ANXA2 en células Panc10.05 transfectadas con el vector de plásmido basado en pcDNA sola (carriles 1,5,9,13), el plásmido que lleva ANXA2
WT-FLAG (carriles 2,6,10, 14), el plásmido que lleva ANXA2
Y23A-FLAG (carriles 3,7,11,15), o el plásmido que lleva ANXA2
Y23E-FLAG (carriles 4,8,12,16). extractos de células enteras (WCE) (carriles 1-4), fracciones de la membrana celular (carriles 5-8, 13-16), o fracciones citoplásmicas (carriles 9-12) fueron aisladas por fraccionamiento bioquímico de las células Panc10.05 PDA, respectivamente , y se inmunoprecipitaron usando ya sea anticuerpos anti-FLAG M2 (carriles 1-12) o anticuerpos anti-fosfotirosina (anti-pTyr) (carriles 13-16). Los inmunoprecipitados fueron borrados utilizando anticuerpos anti-FLAG M2. D.
in vitro
invasión de las células Panc10.05. E.
in vitro
invasión de las células Panc3.11. Para ambos D y E, las células se transfectaron con el vacío basado en pcDNA plásmido vector (carriles 1,2), el plásmido que lleva ANXA2
WT-FLAG (carril 3), el plásmido que lleva ANXA2
Y23A-FLAG ( carril 4), o el plásmido que lleva ANXA2
Y23E-FLAG (carril 5). Carril 1 también se cotransfectaron con el control scramble siRNA. Los carriles 2-5 también se cotransfectaron con
ANXA2
siRNA dúplex. Los resultados de experimentos duplicados se muestran.
Para determinar si el cambio en ANXA2 de localización que se produce como consecuencia de la fosforilación de Tyr23 afecta a la capacidad de invasión de las células de PDA, un conjunto de plásmidos que expresan Bandera de etiquetado exógeno ANXA2 incluyendo ANXA2
WT-FLAG, ANXA2
Y23A-FLAG, y ANXA2
Y23E-FLAG se desarrollaron. Estos vectores son la interferencia de ARN resistente debido a mutaciones silenciosas en el sitio de destino siRNA. células Panc10.05 PDA transfectadas con estos plásmidos se fraccionaron en fracciones de membrana citoplasmática y celulares (Figura S4). En primer lugar confirmó que sólo ANXA2
WT-FLAG y ANXA2
Y23E-FLAG, pero no ANXA2
Y23A-FLAG, localizar a la fracción de membrana celular (Figura 2C). Como era de esperar, la proteína ANXA2
WT-FLAG es tirosina fosforilada en la fracción de membrana celular. A continuación, se encontró que la co-transfección del plásmido pcDNA expresar ANXA2
WT-FLAG o ANXA2
Y23E-FLAG, pero no ANXA2
Y23A-FLAG, con el siRNA (para inhibir la ANXA2 endógeno), revirtieron la inhibición mediada por siRNA de la invasión de las células Panc10.05 (Figura 2D). Sin embargo, en las células con baja capacidad de invasión y la única localización citoplasmática de ANXA2, como Panc3.11 (Tabla S1), co-transfección con ANXA2
Y23E-FLAG no pasa por el mecanismo de regulación de la fosforilación mediante la imitación de la fosforilación constitutiva y promueve la invasión de Panc3.11 células (Figura 2E). Estos datos sugieren que Tyr23 ANXA2 fosforilada confiere la capacidad de invasión PDA.
ANXA2 contribuye a la transición epitelio-mesenquimal de las células PDA
Fosforilados ANXA2 juega un papel en la dispersión de células en los procesos de morfogénesis normales [14] , [15]. Nuestros datos hasta ahora apoyan el papel de la ANXA2 fosforilada en PDA invasión. La transición epitelial a mesenquimal (EMT) regula el proceso de reestructuración morfogenética normal durante el desarrollo embrionario y el tejido, y se sugieren los pasos iniciales de la invasión y metástasis de imitar EMT [18]. Por lo tanto, hemos tratado de determinar si se requiere ANXA2 para la EMT en las células PDA. EMT se caracteriza por la represión de la transcripción de marcadores epiteliales, tales como E-cadherina y la inducción de marcadores mesenquimales tales como babosas y vimentina. ANXA2 ha informado de mediar EMT TGF-activado durante el proceso de desarrollo de la válvula cardíaca [19]. Además, se informó TGF para inducir EMT en células cultivadas PDA [20], [21]. Para examinar si la ANXA2 tiene un papel directo en el proceso de EMT de invadir células PDA, un vector lentiviral que contiene
ANXA2
shRNA se utilizó para lograr la supresión a largo plazo de la ANXA2 en las células PDA (Figura S3). En tiempo real PCR análisis mostró que la E-cadherina fue suprimida, mientras que fueron inducidos babosa y vimentina durante la EMT inducida por TGF Panc10.05 en las células con el control shRNA, pero no en las personas infectadas con
ANXA2
shRNA (Figura 3A ). Además, expresión de la proteína E-cadherina fue suprimida en las células tratadas con TGF con el control shRNA, pero se mantuvo sin cambios en las células tratadas con TGF, que también expresan
ANXA2
shRNA (Figura 3B, C). Como se predijo, las células PDA sin
ANXA2
shRNA pierden su fenotipo adhesión célula-célula y la dispersión en torno a la hoja de la cultura después del tratamiento TGF, que recuerda a un patrón de EMT (Figura 3B). Aunque ANXA2 todavía no se ha demostrado estar involucrados en EMT mediada por SMAD4, se ha demostrado estar involucrados en Rho (pequeñas GTPasas) mediada por el desprendimiento de células, un rasgo de EMT [15]. Por lo tanto, también se evaluó si Rho media la EMT asociado-ANXA2 en PDA y encontramos que la activación de Rho no se detecta en las células de PDA con la inhibición de shRNA ANXA2 después del tratamiento TGF (Figura 3C). Estos resultados demuestran que la pérdida de expresión ANXA2 conduce a la pérdida de la EMT mediada por TGF-Rho en células PDA.
A. En tiempo real análisis de PCR cuantitativa de E-cadherina, babosa, y la expresión de ARNm en las células vimentina Panc10.05 PDA con y sin desmontables de ANXA2 por shRNA. Se muestran las proporciones relativas de la expresión de ARNm con el tratamiento frente a sin tratamiento TGFß1 TGFß1. Los datos se normalizaron con la expresión de β-actina. B. El mismo par de células PDA empleadas en el panel A se trataron con TGFß1 durante 0, 36, o 72 horas, respectivamente, y luego cosechadas por inmunotinción con anticuerpos anti-E-cadherina y anticuerpos secundarios conjugados con PE. DAPI se utilizó para teñir los núcleos. C. El mismo par de células PDA empleadas en el panel A se trataron con TGFß1 durante 0, 36, o 72 horas, respectivamente, y luego cosechadas. Una fracción de extracto de células se utiliza para el análisis de transferencia de Western y se tiñó con anti-E-cadherina, anti-RhoA, B, C, o anticuerpos anti-beta-actina como control interno, respectivamente. El extracto celular restante se sometió a un ensayo de tracción hacia abajo a través de una columna de afinidad que se une específicamente activa, formas unidas a GTP de Rho. Esto fue seguido por análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-Rho. Tenga en cuenta que anti-Rho anticuerpos reconocen Rho A, B y C, cuyos pesos moleculares son ligeramente diferentes, lo que resulta en dos bandas en el gel. El control designa las células con el control shRNA;
ANXA2
shRNA designa las células con
ANXA2
shRNA. D. cuantitativa en tiempo real PCR análisis de la E-cadherina, babosa, y la expresión del ARNm vimentina en un par de líneas de células Panc10.05 PDA infectadas con lentivirus que expresan de tipo salvaje ANXA2 (ANXA2-WT) o mutada ANXA2 Y23A (ANXA2-Y23A ), respectivamente. Las proporciones relativas de la expresión de ARNm con el tratamiento TGFß1 (indicado con +) frente a sin tratamiento TGFß1 (indicado con -) se muestran. Los datos se normalizaron con la expresión de β-actina.
A continuación examinó si Tyr23 fosforilación es importante para la EMT mediada por células en la ANXA2 PDA. Se observó que la ANXA2 endógeno ya no se localiza en la superficie celular en las células que expresan la variante de pérdida de sitio tirosina ANXA2
Y23A (Figura S4). Además, la transfección con ANXA2
Y23A-FLAG inhibe la invasión de las células Panc10.05 (Figura S4), lo que sugiere que la ANXA2
Y23A tiene un efecto negativo dominante. De acuerdo con los datos publicados [22], se encontró que ANXA2
Y23A todavía puede unirse a su socio S100A10 /p11 [23] en el citosol, pero no en la membrana celular (Figura S5). Por lo tanto, se sobreexpresa, ANXA2-citoplasma localizada
Y23A puede secuestrar todo el S100A10 /p11 en el citosol, confiriendo de este modo un efecto negativo dominante. Por lo tanto, aprovechando el efecto negativo dominante de ANXA2
Y23A, y el empleo de este ANXA2
Y23A mutante, hemos demostrado, además, que EMT es inducida por TGF en células que expresan ANXA2
WT, pero no en células que expresan ANXA2
Y23A (Figura 3D). Por lo tanto, estos datos demuestran además que la fosforilación de Tyr23 de ANXA2 promueve la EMT de células PDA y es un mecanismo por el cual concebible ANXA2 localiza en la membrana celular de PDA y confiere el potencial de las células para invadir PDA.
Expresión y fosforilación de la tirosina de ANXA2 son necesarios para la formación de metástasis PDA
in vivo
invasión local por las células tumorales es un paso conocido en el proceso de metástasis. Nuestros datos demuestran que la ANXA2 facilita la invasión de las células PDA
in vitro
. por lo tanto, se empleó un modelo murino de cáncer de páncreas transplantable de metástasis (Figura S6) para evaluar el papel de la expresión ANXA2, fosforilación, y la localización de la superficie celular en el proceso de metástasis PDA
in vivo
. En este modelo, el 100% de los ratones mueren con metástasis hepáticas en aproximadamente 4-6 semanas (Figura 4A) después de la inyección esplénica de 2 × 10
6 células PDA murino Panc02. Panc02 células infectadas con un lentivirus que expresan GFP que transporta shRNA específico para
ANXA2
caída o el control shRNA se clasificaron para las células GFP-positivas por FACS.