Extracto
Antecedentes
reordenaciones genómicas que comprometen la familia ETS de factores de transcripción se producen en el 40-70% de los casos de cáncer de próstata. ERG y ETV1 son los miembros del ETS más comunes observados en estas alteraciones genéticas. La alta prevalencia de estos reordenamientos y su importancia biológica representa una nueva diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de próstata.
métodos y las conclusiones
Hemos informado recientemente el desarrollo de YK-4-279, una inhibidor de molécula pequeña de EWS-FLI1 oncogénica en sarcoma de Ewing. Desde ERG y ETV1 pertenecen a la misma clase de factores de ETS como FLI1, hemos probado la capacidad de YK-4-279 para inhibir las funciones biológicas de las proteínas ERG y ETV1 en el cáncer de próstata. YK-4-279 inhibido ERG y ETV1 mediadas actividad transcripcional en un ensayo de luciferasa. YK-4-279 también disminuyó la expresión de ARNm y proteínas diana aguas abajo ERG y ETV1 en
ETV1
-Fusion LNCaP positivo y
ERG
células positivas VCAP fusión. YK-4-279 redujo la motilidad de las células LNCaP en un ensayo de rayado y el fenotipo invasivo de ambas células LNCaP y VCAP en un ensayo de invasión de las células HUVEC. células PC3 de fusión-negativos fueron insensibles a YK-4-279. SiRNA mediada desmontables ERG en células VCAP resultó en una pérdida de la capacidad de respuesta de drogas. Al mismo tiempo, la expresión ERG transitoria en células PC-3 resultó en un incremento potencial invasivo, que se redujo por YK-4-279.
Conclusión
Estos datos demuestran que YK-4-279 inhibe ERG y ETV1 actividad biológica en células de cáncer de próstata de fusión-positivas que conducen a disminución de la motilidad y la invasión. Por lo tanto, YK-4-279 puede tener un impacto sobre la metástasis en el cáncer de próstata y se puede evaluar más a fondo por sus aplicaciones clínicas en el cáncer de próstata, además de sarcoma de Ewing
Visto:. Rahim S, Beauchamp EM, Kong y, Brown ML, Toretsky JA, Uren A (2011) YK-4-279 ERG y desactivaciones celular mediada por ETV1 invasión del cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (4): e19343. doi: 10.1371 /journal.pone.0019343
Editor: James McCubrey, Universidad de Carolina del Este, Estados Unidos de América
Recibido: December 20, 2010; Aceptado: March 28, 2011; Publicado: 29 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Rahim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue generosamente apoyada por el Centro de cáncer de subvención Soporte P30-CA051008 para el uso de la interacción molecular Biacore recurso compartido. Apoyo a la labor también vino de la Fundación del Niño del Cáncer (Baltimore MD), Go4theGoal, Fundación de Dani, limonada de Alex soporte Fundación, Liddy Iniciativa sarcoma Shriver, Burroughs Wellcome Premio científico clínico en la investigación translacional (JT), y los NIH R01CA133662 (JT) , R01CA138212 (JT), R01CA108641 (AU). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Una solicitud de patente tiene presentada por los autores para el compuesto YK-4-279. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de próstata es la forma más común de cáncer y la segunda causa principal de cáncer la mortalidad en los hombres. translocaciones cromosómicas que involucran a la familia ETS de factores de transcripción están presentes en 40-70% de los cánceres de próstata, incluyendo las formas clínicamente más agresivos [1], [2], [3], [4], [5]. Estas translocaciones producen genes quiméricos, que fusionan la región promotora de un gen sensibles a los andrógenos, como
TMPRSS2
, a la región codificante de los factores de ETS, con más frecuencia
ETV1
o
ERG
[6], [7]. Estos reordenamientos conducen a andrógenos depende la regulación de factores de transcripción ETS y su sobreexpresión. proteínas ETS son proto-oncogenes que han sido implicados en la patogénesis [8]. Se controlan la expresión de los genes diana implicados en la proliferación celular, la apoptosis, la invasión y la angiogénesis. La sobreexpresión de factores de ETS en las células del cáncer de próstata aumentar la invasión celular e induce la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) en modelos de ratones transgénicos [9]. El agotamiento de los factores ETS
in vitro
reduce la motilidad e invasividad. ERG y el agotamiento ETV1 también reducir el crecimiento tumoral
in vivo
[7]. Resultados recientes indican también que
TMPRSS2-ERG
expresión se reactiva en el cáncer de próstata resistente a la castración [10]. Así, las proteínas ETS representan un nuevo objetivo para la prevención o el tratamiento de la enfermedad metastásica.
Recientemente reportamos un inhibidor de molécula pequeña de la proteína quimérica EWS-FLI1 en el sarcoma de Ewing [11]. YK-4-279 inhibe la actividad de EWS-FLI1, induce la apoptosis en líneas celulares de sarcoma de Ewing y ralentiza el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto de ratón. FLI1, ERG y ETV1 son factores ETS Clase I y comparten identidad mayor que 60% y 80% de homología en sus secuencias de aminoácidos [12]. Debido a la estrecha homología de FLI1 con ERG y ETV1, hemos probado la capacidad de YK-4-279 para inhibir la actividad de los genes en el ETS de próstata líneas celulares que demuestran la expresión dependiente de ERG y ETV1 andrógenos. Nuestros resultados indican que YK-4-279 puede inhibir ERG y ETV1 dependiente de la actividad transcripcional y por lo tanto conduce a la reducción de la motilidad celular y la invasión.
Resultados y Discusión ¿Cuáles son
VCAP células LNCaP y sensibles a andrógenos y puerto ERG y ETV1 reordenamientos
próstata requiere andrógenos para funcionar correctamente y la capacidad de respuesta de andrógenos se puede utilizar como base para agrupar las líneas celulares de cáncer de próstata en una de dos categorías: andrógeno-sensibles y resistentes a los andrógenos. En la mayoría de los casos de ETS de transposición, el gen ETS se coloca bajo la regulación directa de un promotor de gen de andrógenos sensible. En estos casos, andrógenos media la sobre-expresión del factor de ETS oncogénico. Con el fin de estudiar el efecto de los inhibidores de ETS en el cáncer de próstata, se seleccionaron para trabajar con VCAP y LNCaP líneas celulares. La línea celular VCAP alberga un reordenamiento TMPRSS2-ERG, que se produce a través de deleción intersticial de la región Mb 3 entre TMPRSS2 y ERG en el cromosoma 21 (Fig. 1a) [6]. La línea celular LNCaP contiene una translocación genética donde se inserta todo el locus ETV1 en el último intrón de la región MIPOL1 específico de la próstata en el cromosoma 14 (Fig. 1a) [7]. Los reordenamientos ERG y ETV1 son mutuamente excluyentes a las células LNCaP y VCAP respectivamente, y no están presentes en la línea celular PC-3. Por lo tanto, la línea celular PC-3 se seleccionó como un control negativo para nuestros estudios. Hemos validado que las células tanto VCAP y LNCaP son sensibles a los andrógenos, como se demuestra por un aumento de antígeno específico (PSA) expresión de próstata a la estimulación por el análogo de andrógeno sintético R1881 (Fig. 1b). células VCAP y LNCaP expresan ERG y proteínas ETV1 en condiciones basales, debido a la presencia de
ETS
reordenamientos en estas células. tratamiento de andrógenos de estas líneas celulares, pero no PC-3, los resultados en el aumento de ERG y mRNA ETV1 y proteína (Fig. 1C y D). Estos resultados establecen que tanto las células VCAP y LNCaP se andrógenos sensible mientras que células PC-3 no lo son. Andrógenos capacidad de respuesta de las células LNCaP VCAP y se traduce en una mayor ETV1 y expresión ERG debido a reordenamientos cromosómicos específicos de cáncer de próstata.
a) se analizaron las células de la próstata para el estado de ETS reordenamiento mediante la realización de PCR usando primers específicos reordenamiento. VCAP células albergan el reordenamiento TMPRSS-ERG mientras que las células LNCaP contienen ETV1 reorganizado. VCAP células LNCaP y expresan la proteína ERG y ETV1 respectivamente, en condiciones basales. las células PC-3 no contienen ya sea reordenamiento y no expresan ERG o ETV1. b) células VCAP y LNCaP expresan PSA en respuesta al tratamiento R1881. las células PC-3 no son sensibles andrógenos. Las células fueron tratadas con 10 nM R1881 durante 48 horas y la expresión de PSA se analizó en tiempo real por qPCR. Los resultados fueron normalizados a la actina. *; p & lt; 0,0001, n.s .; insignificante. c) los resultados de estimulación R1881 en un aumento de ERG y mRNA ETV1 en las células LNCaP y VCAP respectivamente, pero no en células PC3. Se aisló ARN de células de andrógenos estimulada y se utiliza para llevar a cabo en tiempo real qPCR. Los datos se normalizó al nivel de expresión génica en ausencia de andrógenos. d) proteínas ERG y ETV1 se expresan en células LNCaP y VCAP respectivamente, pero no en células PC-3. estimulación de andrógenos produjo un aumento de la proteína ERG y ETV1 en células VCAP y LNCaP. células de la próstata no expresaban la proteína FLI1 bajo basal o andrógenos estimulan condiciones. MOLT4 se utilizó como control de línea celular positiva para la expresión FLI1.
YK-4-279 ERG inhibe la actividad transcripcional y ETV1
YK-4-279 dirige el EWS-FLI1 oncoproteína en el sarcoma de Ewing [11]. Sin embargo, el sitio de interacción con EWS-FLI1 es desconocida. Considerando la estrecha homología entre FLI1, ERG y ETV1, se investigaron los efectos de YK-4-279 ERG sobre la función y ETV1. En primer lugar, se evaluó la expresión de FLI1 en células de la próstata. La línea linfoblástica aguda humana de células de leucemia MOLT4 se utilizó como control para la expresión FLI1, en condiciones basales. Ninguna de las células de la próstata utilizados en este estudio expresan FLI1 (Fig. 1d). Por lo tanto, los efectos de YK-4-279 en células de la próstata no se produciría como resultado de la orientación FLI1. A continuación, se validó la interacción directa entre las proteínas ETV1 utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR) YK-4-279 ERG y recombinante y. YK-4-279 unido a ERG con una afinidad (K
D) de 11,7 mM y unido a ETV1 con una afinidad de 17,4 mu M (Fig. 2a, S1). Evaluamos YK-4-279 para efectos sobre la actividad transcripcional ERG utilizando un fragmento de 207 pb transfectadas transitoriamente del promotor del gen Id2 que dirige la expresión de la proteína luciferasa. Esta región del promotor mínimo Id2 contiene dos sitios de ETS y se ha demostrado previamente para unirse ERG [13]. La co-transfección de reportero ERG y Id2 resultó en un incremento en la actividad de luciferasa. La actividad del promotor se redujo mediante el tratamiento simultáneo de las células con YK-4-279, sin ninguna disminución apreciable en los niveles de proteína ERG (Fig. 2b).
a) la cinética de unión de YK-4-279 a ERG y ETV1 se determinó por resonancia de plasmón superficial. YK-4-279 unido a ERG y ETV1 con una K
D de 11,7 micras y 17,9 mM, respectivamente. sensogramas SPR se proporcionan en las figuras complementarias (Fig. S1). b) Un ensayo de luciferasa se realizó en células COS-7 transfectadas con co-ERG y un constructo informador de luciferasa Id-2. Id-2 promotor de la actividad se redujo tras el tratamiento YK-4-279 sin afectar los niveles de proteína ERG. *; p & lt; 0,001. c) las células se trataron con VCAP 50 nM siERG o 10 mM YK-4-279 durante 48 horas y mRNA y los niveles de expresión de proteínas de los objetivos de ERG se evaluaron. tratamiento YK-4-279 resultó en disminución de expresión de Plau, ADAM19 ARNm y PLAT. Plau y PLAT los niveles de proteína se redujeron también. Los resultados fueron comparables a los obtenidos por caída ERG mediada por siRNA. d) las células LNCaP fueron tratados con 1 micra YK-4-279 y ETV1 niveles de genes diana fueron evaluados. tratamiento YK-4-279 generado una disminución en la expresión génica de MMP13 sin una reducción significativa en los niveles de ETV1. *; p. & lt; 0,01
A continuación, se evaluó los efectos de YK-4-279 sobre la expresión del ERG endógenos y ETV1 genes diana en VCAP y LNCaP líneas celulares. Nos centramos en varios miembros de la vía del activador del plasminógeno tales como Plau, PLAT, MMP13 y ADAM19. Estos genes median un fenotipo invasivo en varios tipos de cáncer y se ha informado como objetivos directos de los factores de transcripción ETS [9], [14], [15]. La exposición de las células a VCAP 10 M YK-4-279 durante 48 horas dio como resultado redujo significativamente en el mRNA y los niveles de proteína de varios genes diana ERG, como Plau, PLAT y ADAM29. El nivel de regulación a la baja era comparable a la obtenida por mediada por siRNA ERG ronda en células VCAP (Fig. 2c). Del mismo modo, YK-4-279 dio lugar a baja regulación de ETV1 gen diana de MMP-13 en las células LNCaP (Fig. 2d). Cabe señalar que se obtuvo esta inhibición de la actividad de la proteína ERG y ETV1 sin ninguna disminución significativa en la ERG o ETV1 niveles de proteína. Estos resultados sugieren que YK-4-279 es capaz de inhibir ERG y ETV1 actividad transcripcional en células de cáncer de próstata, lo que lleva a una disminución de la expresión de genes que están involucrados en la degradación de la matriz extracelular y la metástasis.
YK-4- 279 inhibe ETS mediada por la invasión de células de cáncer de próstata
Los estudios previos han sugerido que
reordenamientos ETS
genes median la invasión en el cáncer de próstata [7], [9]. Para hacer frente a la cuestión de si YK-4-279 es capaz de inhibir ERG y ETV1 invasión mediadas, se utilizó un ensayo de invasión de células endoteliales basado [16] de impedancia. Esta técnica implica desafiar una monocapa confluente de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) con una segunda capa de células metastásicas que se adhieren a, e invadir la monocapa HUVEC. La retracción de las uniones de células endoteliales y la invasión de células de cáncer de próstata se puede monitorizar en tiempo real mediante la medición de la disminución de la resistencia eléctrica en electrodos de oro [17].
un ensayo de citotoxicidad se realizó para determinar la dosis máxima tolerable de YK-4-279 en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata. YK-4-279 no mostró ninguna reducción significativa en el crecimiento celular en 1 M para las células LNCaP y 10 mM para VCAP y células PC3 después de 2 días de tratamiento (datos no mostrados). Se seleccionaron estas dosis para más ensayos funcionales con el fin de garantizar que los efectos inhibidores de YK-4-279 en la invasión y la motilidad, no son, como resultado de la muerte celular. Cuando las células HUVEC se estimularon con células LNCaP y VCAP, que condujo a una disminución pronunciada en resistencia eléctrica indicativa de la invasión de células. El tratamiento de estas células con YK-4-279 resultó en significativamente la disminución de la invasión de células HUVEC por las células LNCaP y VCAP. El compuesto solo no tuvo ningún efecto sobre la monocapa de células HUVEC. YK-4-279 no inhibió la invasión de
ETS
-Fusion negativo células PC-3. (Fig. 3a y b). Para asegurar que los efectos observados se deben a la inhibición de las proteínas ETS, hemos reducido la expresión de proteínas en células ERG VCAP utilizando siRNA. Esto dio lugar a la derogación de YK-4-279 mediada por la inhibición de la invasión (Fig. 3c). A continuación, hemos expresado transitoriamente ERG en las células PC-3 y se ensayaron estas células en el ensayo de invasión de las células endoteliales. expresión ERG solo en células PC-3 impartidas sobre estas células un fenotipo más invasiva. El tratamiento con YK-4-279 inhibió significativamente el aumento mediado ERG en la invasión (Fig. 3d). En conjunto, estos resultados sugieren que YK-4-279 es capaz de inhibir la invasión ETS-mediada de células de cáncer de próstata, tanto en las células con endógeno y exógeno alta expresión de las proteínas de ETS.
a) células HUVEC que forman un confluente monocapa se expusieron a LNCaP, VCAP y células PC-3 con o sin YK-4-279. YK-4-279 VCAP inhibido (10 M) y LNCaP (1 M) la invasión de células de HUVEC, mientras que células PC-3 no se vieron afectados. células de la próstata fueron pre-tratadas con YK-4-279. Los experimentos se realizaron por duplicado y la resistencia se normalizó a la hora de la adición de las células invasoras. b) La invasión se cuantificó en 10 horas después de la adición de las células del cáncer de próstata. Los resultados se expresan en relación a las condiciones no tratados. *; p & lt; 0,01. c) la expresión de ERG se redujo en las células VCAP utilizando una sonda de siRNA C-terminal. ERG caída en células VCAP resultó en una pérdida de YK-4-279 mediada por la inhibición de la invasión. VCAP células fueron pre-tratados con 10 mM YK-4-279 durante 2 días previos a la impugnación de la monocapa HUVEC. *; p & lt; 0,01, d) La expresión transitoria ERG en las células PC-3 impartidas sobre las células un fenotipo más invasiva. Posteriormente, el tratamiento YK-4-279 produjo una disminución de la invasión. PC-3 células fueron tratadas con YK-4-279 durante 24 h antes de desafiar la monocapa HUVEC.
YK-4-279 inhibe la motilidad mediada ETV1 en las células LNCaP
Siguiente , hemos probado los efectos de YK-4-279 en la inhibición de la motilidad de las células LNCaP en un ensayo de cero. Todos los experimentos de las figuras anteriores se realizaron con células LNCaP paso bajo (p & lt; 30). Sin embargo, las células LNCaP de bajo pasaje no eran susceptibles de esta técnica ya que vagamente se adhieren a la superficie del plato de cultivo celular. Del mismo modo, las células VCAP crecen en grupos y no forman una monocapa confluente. Por lo tanto, hemos realizado ensayos de cero utilizando células LNCaP alta de paso (p & gt; 60). células LNCaP-alto pasaje crecen a un ritmo mucho más rápido y son capaces de formar una monocapa confluente [18]. También expresan altos niveles basales de ETV1 (Fig. 4a) [19]. Antes de realizar el ensayo cero, YK-4-279 se ensayó para determinar su naturaleza citostático y se encontró que no tiene efectos sobre la proliferación de células a concentraciones utilizadas para el ensayo cero (Fig. S2). tratamiento YK-4-279 de células LNCaP dio como resultado una disminución significativa en la motilidad celular en el ensayo de cero, mientras que no se observaron efectos sobre la motilidad del control de línea celular negativa, PC-3 (Fig. 4b). El ensayo cero también se realizó con un tratamiento previo de las células LNCaP con 10 mg /C mitomicina ml durante 2 horas antes de rayar la superficie. YK-4-279 fue capaz de inhibir la motilidad celular LNCaP en condiciones tratadas con mitomicina también (Fig. S3) Estos hallazgos sugieren que los efectos de YK-4-279 en las células LNCaP en el ensayo cero no es debido a la citotoxicidad, pero debido exclusivamente a la inhibición de la motilidad celular.
a) se analizaron las células LNCaP-alta de paso para los niveles de expresión ETV1. células HP-LNCaP constitutivamente expresan mayores cantidades de ETV1, en comparación con las células PC-3. b) YK-4-279 motilidad inhibido en un ensayo de cero en células LNCaP de alto pasaje, mientras que las células PC-3 no respondieron. motilidad celular se cuantificó midiendo la distancia entre los límites de las celdas que migran. Motilidad se expresó en relación a las condiciones de tratados con vehículo. *; p. & lt; 0,0001
El EWS-FLI1 oncoproteína depende de la unión a RNA helicasa A (RHA) para su función oncogénica [20]. YK-4-279 induce la apoptosis en las células del sarcoma de Ewing mediante el bloqueo de la interacción entre EWS-FLI1 y RHA. Como un posible mecanismo para la actividad de YK-4-279 en cáncer de próstata, hemos probado si la interacción entre un miembro de la familia ETS y RHA está presente en células de la próstata también. Mientras ERG interactúa con RHA en las células de cáncer de próstata, YK-4-279 es incapaz de bloquear esta interacción (Fig. S4). También probamos si YK-4-279 es capaz de bloquear ERG o ETV1 unión a los ETS en el ADN utilizando la resonancia de plasmones superficiales. YK-4-279 no inhibió ADN ERG o ETV1 (Fig. S5a) de unión. Además, se llevó a cabo la inmunoprecipitación de la cromatina para evaluar ERG unión a promotor PLAU en presencia de YK-4-279. Los resultados confirmaron los hallazgos Biacore que YK-4-279 no interfiere con la unión de ADN ERG (Fig S5B). Debe tenerse en cuenta que las células de Ewing expresan una proteína FLI1 truncado que contiene sólo los exones 6-9 de FLI1. translocaciones ETS en el cáncer de próstata, por otra parte, dan como resultado la expresión de un miembro de la familia ETS casi de longitud completa. Por lo tanto, la hipótesis de que YK-4-279 puede inhibir ETV1 y función ERG en las células de cáncer de próstata mediante la prevención de las interacciones proteína-proteína que son diferentes a los asociados EWS-FLI1 en sarcoma de Ewing. Por lo tanto, se necesita más investigación para determinar el mecanismo molecular exacto de la inhibición mediada por YK-4-279 ERG y de la función ETV1 en células de cáncer de próstata.
El resultado de la inhibición ETV1 parece ser más potente que la inhibición del ERG, en términos de célula-motilidad y la invasión. Sin embargo, este fenómeno no puede atribuirse concluyentemente a una mejor inhibición ETV1, como una comparación razonable de los datos se complica por el hecho de que ERG y ETV1 se expresan en diferentes líneas celulares. Por lo tanto, la calidad de la respuesta también puede ser un factor de diferencias entre las células LNCaP y VCAP. Experimentos adicionales, tales como la medición de la magnitud de la respuesta ERG y ETV1 en la misma línea celular, serían necesarios para hacer frente a este punto concluyente.
Los informes recientes han sugerido que el HTA knock-down en células de cáncer de próstata puede resultar en disminución de la proliferación en células que expresan estas oncoproteínas [21], [22]. Aunque los experimentos en este manuscrito se realizaron a dosis e intervalos de tiempo que no eran tóxicos para las células, no parece haber una correlación directa entre la expresión de proteínas de ETS y YK-4-279 citotoxicidad. ETS-reordenamiento negativo PC-3 y las células DU-145 muestran una respuesta mínima a YK-4-279 tratamiento (IC50 & gt; 100 mM). Por el contrario, YK-4-279 es más tóxico para tanto VCAP (IC50 = 9,55 mM después de 72 h) y las células LNCaP (2,75 mM después de 72 h). Por lo tanto, YK-4-279 también puede ser evaluada por sus potenciales citotóxicos en las células del cáncer de próstata positivas ETS-reordenamiento en futuros estudios.
El andrógeno dependiente de la sobreexpresión de la proteína ERG y ETV1 en células de cáncer de próstata ha sido directamente implicado al aumento de la invasión y la metástasis. Por otra parte, varios estudios han correlacionado el incremento en la expresión de estas proteínas con mal pronóstico, las puntuaciones de Gleason más altas y una menor incidencia de supervivencia libre de recurrencia. En la actualidad, las vías de señalización dependientes de andrógenos en el cáncer de próstata se dirigen a través de la castración y antagonistas del receptor de andrógenos. Los efectos de estos tratamientos pueden atribuirse en parte a la regulación a la baja de los factores de ETS reordenados. Por lo tanto, el éxito del desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas de ERG y ETV1, como YK-4-279, representará una nueva línea de productos terapéuticos destinados a prevenir o tratar la enfermedad metastásica, mientras que el ahorro de los pacientes los efectos a largo plazo de las terapias dirigidas a la andrógenos vía.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
VCAP, LNCaP, se obtuvieron células PC-3 y DU-145 de la ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA ). HUVECs se obtuvieron de Lonza Biosciences (Allendale, NJ). células VCAP se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal. LNCaP, PC-3 y las células DU-145 se mantuvieron en medio RPMI suplementado con 10% de FBS y 1% HEPES. Las células HUVEC se cultivaron en EBM-2 medios de comunicación (Lonza) suplementado con EGM-2 kit de bala (Lonza) que contiene factores de crecimiento, antibióticos y 5% de SFB.
Western-Blots
Proteína lisados fueron preparados y occidental-borrones realizaron como se describe anteriormente [23]. ERG (sc-354), ETV1 (sc-1953) FLI1 (sc-356), PLAT (sc-5241) y actina (sc-1615) anticuerpos fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). El anticuerpo anti-PLAU se adquirió de Calbiochem (Gibbstown, NJ).
aislamiento de mRNA y qPCR
mRNA se aisló utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el ADNc se preparó usando primera transcriptor hebra de cDNA síntesis kit (Roche, San Francisco, CA) según el protocolo del fabricante. QRT-PCR se realizó con verde SYBR (Roche) en un Mastercycler realplex
4 instrumento (Eppendorf, Nueva York, NY). La expresión génica se normalizó a la actina. Los pares de cebadores se enumeran en el cuadro complementario S1.
Reordenamiento estado
ADN genómico se aisló de PC-3, las células LNCaP y VCAP utilizando el kit de extracción de ADN genómico Wizard (Promega, Madison, WI) de acuerdo con los protocolos del fabricante. PCR se llevó a cabo usando cebadores que flanquean los sitios de transposición. Primer secuencias se pueden encontrar en el cuadro complementario S1.
Encuadernación Cinética
afinidades de unión en el estado estacionario se midieron en un instrumento Biacore T100. proteínas ETV1 (Origene, Rockville, MD) recombinante ERG y se inmovilizaron en chips CM5 por acoplamiento de amina y 6 concentraciones diferentes de YK-4-279 se inyectaron sobre la superficie en los duplicados. sensogramas SPR y K
D valores fueron obtenidos utilizando el software Biacore T100.
ensayo de luciferasa
COS-7 células fueron co-transfectadas con un plásmido lentiviral que expresa la encuentra más comúnmente truncada ERG mRNA, y un vector que contiene el promotor del gen Id2 expresión de un gen de la luciferasa de conducción. La transfección se llevó a cabo utilizando Fugene 6 (Roche) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Un vector lentiviral que expresa LacZ se utilizó como control negativo. Las células se dejaron de expresar ERG durante 48 horas y posteriormente se trataron con 10 mM YK-4-279. La actividad de luciferasa se midió después de 24 h usando un kit de ensayo de luciferasa dual, según el protocolo del fabricante (Promega, Madison, WI). Los resultados se normalizaron a la concentración de proteína total. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 4.0.
andrógenos y YK-4-279 tratamiento
Para el tratamiento de andrógenos, las células fueron sembradas en medio libre de rojo fenol que contenía 10% de FBS tratado con carbón vegetal y dejó que se unieran a la noche a la mañana plato de cultivo celular. Posteriormente, las células se mueren de inanición de suero durante 48 horas en rojo fenol medios libres y después se estimularon con 10 nM R1881 (Sigma, St-Louis, MO) durante 2 días.
YK-4-279 se disolvió en DMSO para preparar madre 10 mM. Logarítmicamente células en crecimiento se trataron con 1 M o 10 micras YK-4-279 de 48 horas antes de la evaluación de la expresión génica.
siRNA ERG knockdown
Transient ERG caída se realizó con un siRNA de encargo (5'-CGACATCCTTCTCTCACAT-3 ') dirigidos contra el C-terminal de ERG (Dharmacon, Lafayette, CO) [21]. 50 nM siRNA se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las células se analizaron para ERG desmontables 5 días después de la transfección con siRNA.
Expresión transitoria ERG
PC-3 células fueron transfectadas con un plásmido pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen) que expresa el más comúnmente encontrado truncado ERG isoforma. La transfección se llevó a cabo utilizando Fugene 6 reactivo (Roche) de acuerdo con los protocolos del fabricante durante 48 horas.
HUVEC Invasion
El potencial anti-invasivo de YK-4-279 se midió mediante el uso de la la técnica de detección de impedancia eléctrica celular (IEM) en ECIS Z instrumento (Biofísica Aplicada, Troy, Nueva York) y el sistema de xCELLigence (Roche). En pocas palabras, 250.000 células HUVEC se sembraron en 8W10E + matrices con circuitería de electrodos en el fondo, bien para medir la resistencia eléctrica. Después de la formación de un confluentes HUVEC monocapa (app. 21-24 horas), se añadieron las células de cáncer de próstata que invaden a una densidad de 100.000 células por pocillo en medio DMEM o RPMI que contenía las concentraciones de fármaco indicadas. Las células tumorales se pre-trataron durante 24-48 horas con YK-4-279 antes de la adición. Este punto de adición de células tumorales tiempo fue aceptado como 0 h de tratamiento y la invasión se monitorizó durante los siguientes 12 horas mediante la medición de cambios en la resistencia en la interfase célula-electrodo. Los experimentos se realizaron por duplicado. Resistencia se normalizó a momento de la adición de las células invasoras.
Ensayo de Scratch
Las células se sembraron y se dejaron formar un confluente mono-capa. La superficie celular se raspó usando una punta de pipeta P-200. Las células se dejaron para llenar el área rayada y monitoreados durante el transcurso de 72 horas. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio Nikon Eclipse Ti (Nikon, Melville, NY). motilidad celular se cuantificó midiendo la distancia entre los límites de las celdas que migran.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
células PC-3 fueron transfectadas con un plásmido pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen) que expresa el más comúnmente encontrado truncada isoforma ERG. La transfección se llevó a cabo utilizando Fugene 6 reactivo (Roche) de acuerdo con los protocolos del fabricante durante 24 horas. Las células fueron tratadas durante 6 horas con vehículo 10 M o YK-4-279. ChIP se llevó a cabo usando proteína EZMagna un chip Kit de Millipore de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La inmunoprecipitación se llevó a cabo utilizando 2 g de anticuerpo ERG (SC-354x, Santa Cruz Biotechnology), 2 g de IgG de conejo normal (Sigma Aldrich) y 1 g de Pol II (Millipore). PCR se llevó a cabo utilizando cebadores publicados anteriormente para ERG positivo de unión en el promotor PLAU en células de la próstata [9]. Un perfil PCR de 94 ° C-5 min: 1 ciclo, 94 ° C-30 seg, 55 ° C-30 seg, 72 ° C-1 min: 35 ciclos, 72 ° C-5 min: se utilizó en 1 ciclo un termociclador Eppendorf realplex4
Análisis estadístico
Los grupos se compararon mediante la prueba t de Student de dos colas (Prisma 4, GraphPad Software, la Jolla, CA) y p. & lt; 0,05 se consideró significativo .
Apoyo a la Información
Figura S1.
sensogramas SPR para YK-4-279 unión a ERG y ETV1. afinidades de unión en el estado estacionario se midieron mediante la inyección de 6 concentraciones diferentes de YK-4-279 sobre las proteínas ERG y ETV1 recombinantes inmovilizadas en la superficie de los chips CM5 en un instrumento Biacore T100. sensogramas SPR se obtuvieron utilizando el software Biacore T100
doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s001 gratis (TIF)
figura S2.
YK-4-279 no es un agente citostático. VCAP (10.000 células /pocillo), LNCaP-alto pasaje (10.000 células /pocillo), LNCaP de bajo pasaje (10.000 células /pocillo) y PC-3 (5.000 células /pocillo) se sembraron células durante la noche en xCELLigence E-16 placas y permite que se adhieran a la bien inferior. El xCELLigence E-16 placas de pocillos de fondo está cubierto con miniatura de oro-electrodos que miden los cambios en la resistencia eléctrica en la superficie de los electrodos. Los cambios en la resistencia eléctrica se representan como un parámetro adimensional denomina célula-índice, y es directamente proporcional al área de pocillos de fondo cubierta por electrodos. Aproximadamente 20 horas después de la siembra de células de cáncer de próstata, medios de cultivo se reemplazó con medio fresco que contenía 1 M (LNCaP, PC-3) o 10 mM (VCAP) YK-4-279. La proliferación celular se monitorizó durante 72 horas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
YK-4-279 inhibe la motilidad celular LNCaP. Las células se sembraron y se dejaron formar una mono-capa confluente. Las células se trataron con 10 mg /ml de mitomicina-C durante 2 horas antes del ensayo cero, como se describe anteriormente [24], [25]. Después del tratamiento con mitomicina-C, se añadió medio fresco y la superficie celular se raspó usando una punta de pipeta P-200. Las células se dejaron para llenar el área rayada y monitoreados durante el transcurso de 60 horas. motilidad celular se cuantificó midiendo el área de cero no cubierta con la migración de células .. La motilidad se expresó en relación a las condiciones de tratados con vehículo. *; p & lt; 0,0001
doi: 10.1371 /journal.pone.0019343.s003 gratis (TIF)
Figura S4.
ERG interactúa con RHA en células VCAP. YK-4-279 no bloquea la interacción entre ERG y RHA. 9 × 10
7 células VCAP se sembraron en 15 platos cm y deja que se unan y se extendió durante 48 horas. Las células fueron tratadas con 10 mM YK-4-279 de 24 h. La inmunoprecipitación se realizó como se describió anteriormente [11]
doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s004 gratis (TIF)
Figura S5.
YK-4-279 no inhibe ERG o ETV1 unión a ADN. a) proteínas recombinantes ERG o ETV1 se inmovilizaron sobre la superficie de un chip Biacore CM5 mediante acoplamiento de amina. De tipo salvaje oligonucleótidos de doble cadena (ATGTAGACCGGAAGTAACTA) que contienen los consenso Ets sitio "GGAA" de unión se inyectaron en 5 M por triplicado sobre la superficie del chip en presencia o ausencia de 50 mM YK-4-279. La unión del ADN a recombinantes ERG o ETV1 se midió utilizando software Biacore T100.