Extracto
andrógenos (AR) variantes están asociadas con la resistencia a la terapia antiandrógeno tanto en líneas celulares de cáncer de próstata humano y clínica muestras. Estas observaciones apoyan la hipótesis de que la acumulación de AR isoforma es una consecuencia de la presión terapéutica selectiva en la AR longitud completa. El modelo de cáncer de próstata deficientes en PTEN procede con una cinética bien definidos, incluyendo la progresión a cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Mientras que los tratamientos de castración y Enzalutamida quirúrgicos producen una respuesta terapéutica inicial,
PTEN
- /-
epitelios siguen proliferando patología del tumor primario localmente invasivos rendimiento. Que la mayoría epitelio permanece AR positivo, pero ligando independiente, sugiere la presencia de variantes AR oncogénicos. Para hacer frente a esta hipótesis, hemos utilizado un panel de descrito recientemente
Pten
- /- las líneas de células tumorales derivadas de
tanto de la hormona intacta (E4, E8) y castrados mutantes PTEN (CE1, CE2) seguido por RACE PCR para identificar y caracterizar tres novedosos, amino terminal que contienen variantes truncadas AR (Mar-Va, b, c). Las variantes no sólo aparecen conservados a lo largo progresión, pero se correlacionan con la pérdida casi completa de longitud completa AR (AR-FL) a niveles de castración de andrógenos. La sobreexpresión de variantes conduce a una mayor actividad transcripcional de AR, mientras que derribar los estudios muestran una reducción de la producción de la transcripción. En conjunto, la identificación de variantes truncadas AR en el modelo de PTEN eliminación condicional apoya un papel para el mantenimiento del fenotipo CRPC y proporciona nuevas aplicaciones terapéuticas de este modelo preclínico
Visto:. Liang H, Adisetiyo H, Liu X, Liu R, P Gill, Roy Burman-P, et al. (2015) La identificación de los receptores de andrógenos variantes de empalme en la próstata murino Modelo de cáncer de PTEN deficiente. PLoS ONE 10 (7): e0131232. doi: 10.1371 /journal.pone.0131232
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: Abril 1, 2015; Aceptado: 29-may de 2015; Publicado: 21 de julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Liang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y su archivo de información de apoyo
Financiación:.. Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH para RO1CA059705 PR, la Escuela de Medicina de Fondos de investigación del cáncer adjudicados a DJM PCF Premio joven Investigador e Icahn
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
células de cáncer de próstata se ha considerado que el progreso a la resistencia a la castración a través de una multitud de modificaciones del receptor de andrógenos (AR). incluyendo la amplificación, reordenamientos de los genes o mutaciones, alteraciones en la expresión de co-transcripcional reguladores y
de novo
esteroidogénesis [1-6]. Más recientemente, los estudios con líneas celulares y tejidos de cáncer de próstata humano han identificado la presencia de variantes de corte y empalme AR (AR-VS) que puede ser de hasta reguladas en respuesta a la castración y promover la resistencia a la terapia con andrógenos receptor diana [7-9] [10 ] [11]. El receptor de andrógenos pertenece a la familia de factores de transcripción del receptor de esteroides y se compone de un dominio de activación transcripcional N-terminal (NTD, exon1), dominio de unión al ADN (DBD, el exón 2 y 3), una región bisagra (exón 4), y la unión a ligando del dominio C-terminal (LBD, el exón 4-8) [12,13]. Hasta la fecha, hasta 15 diferentes AR-V carece de diferentes partes de LBD se han reportado en líneas celulares de cáncer de próstata humano CWR-R1, 22Rv1, VCAP y Lucap xenoinjertos [14-21]. A pesar de esto, las isoformas AR siguen siendo muy poco estudiada en modelos preclínicos de ratón de tejidos de cáncer de próstata se limita a dos AR-Vs según ha informado el uso de la línea celular Myc-PAC [15]. Hasta la fecha, no hay variantes AR se han registrado en el órgano principal de un modelo preclínico de ratón de cáncer de próstata.
El
PTEN
nula modelo de ratón de cáncer de próstata es poco sensible a la terapia de ablación de andrógenos incluyendo quirúrgico castración y del receptor de andrógenos terapia dirigida [22] [23] [24]. Mientras PI3K mayor de señalización /Akt se ha demostrado que proporcionar señales de supervivencia importantes en condiciones castrados, la mayoría de los epitelios permanecen receptor de andrógenos positivo. Esta observación plantea la posibilidad de que ligando forma independientes del receptor de andrógenos pueden existir facilitar la supervivencia y la progresión continua. Hemos tomado un enfoque múltiple para abordar esta hipótesis, incluida la caracterización y aplicación de varios novela, PTEN deficientes, líneas celulares de cáncer de próstata murino [25] [26] y el modelo de tumor primario correspondiente.
Hemos identificado tres nuevas variantes del receptor de andrógenos (denominada Mar-Va, b, c). Estas variantes AR todos contienen la AR-NTD con sólo una que contiene una secuencia de superposición parcial con el AR-LBD. La expresión relativa de estas variantes no sólo aumenta en respuesta a la castración, pero en respuesta a AR terapia dirigida incluyendo casodex y Enzalutamida. Sorprendentemente, después de la progresión a largo plazo de los niveles de andrógenos de castración, se observó una reducción significativa en la AR de longitud completa pero el mantenimiento de las isoformas identificadas. Los estudios funcionales revelaron que la sobreexpresión o derriban de AR-Va y Vc AR-AR podría regular la transcripción de salida.
En conjunto, nuestros datos apoyan la presencia de nuevas variantes AR que pueden servir como contribuyentes importantes durante la progresión de CRPC. Identificación de la variante también mejora significativamente la utilidad del modelo de cáncer de próstata nula PTEN tanto en términos de la comprensión de la función de AR y como un sistema para evaluar las terapias dirigidas a formas resistentes de los receptores de andrógenos.
Resultados
la identificación de nuevas variantes de AR en líneas celulares derivadas de cáncer de próstata el modelo nulo PTEN
Como parte de nuestros estudios de la función del receptor de andrógenos (AR) y los mecanismos de progresión CRPC, hemos caracterizado recientemente cuatro nuevos de cáncer de próstata murino líneas celulares derivadas de cualquiera de hormona intacta (E4, E8) o castrados (CE1, CE2)
PTEN
ratones mutantes nulos. Las líneas celulares se caracterizan por ser
PTEN
- /-
, después de haber activado PI3K /Akt señalización y características del modelo de tumor primario [25] [26]. Para ensayar la presencia de un receptor de andrógenos (AR) variantes, se aplicó 3 'RACE en ADNc generados a partir de las líneas de E8 y CE1 utilizando cebadores directos anclados dentro del exón 1 de AR ratón (S1 Tabla). El uso de este enfoque imparcial, hemos amplificado AR ARNm con colas de poli (A) incluidos los AR-Vs con potenciales nuevas secuencias 3 '. Siguiendo con la PCR anidada, se observó varios productos de secuencias únicas (Fig 1a, S1 Fig). Como se preveía, el (~ 2 kb) fue la banda más larga la longitud completa de AR (AR-FL), que contiene las secuencias de aguas arriba de la región poli (A) que se corresponde con el 3'UTR de AR ratón (MAR) ARNm. Clonación y análisis de secuencias de los ~ 850 pb productos de PCR se indica la existencia de varios ratón único AR-V (MAR-V) en las células E8 y CE1. Nos centramos en tres transcripciones único. En primer lugar, una isoforma corta AR se encuentra en la línea de E8, conservando los exones 1-4 de MAR de ARNm, seguido de una secuencia de 175 pb único encontrado para alinear a la región de intrón AR adyacente al exón 4 que hemos llamado el exón 4a (m4a) o variante AR-Va (Fig 1a y 1b). La estructura molecular AR-Va es análogo a los exones 5 'de retención de 1-4, pero que difieren en las composiciones de 3' secuencias de ratón se ha descrito previamente MAR-V4 [15] y ARV humano
567es [27]. A continuación, se detectaron dos nuevos AR-Vs con sitios potencialmente únicos de splicing alternativo en las células CE1. Cuando el mapeo de sus secuencias con el genoma del ratón, se encontró que las secuencias de 442 pb y 495 pb corresponden al intrón 1 y el exón 1, que nos hemos referido a M1b y M1c variantes empalmadas. Para evitar posibles confusiones con la nomenclatura de los ARV reportados en modelos de cáncer de próstata humano, hemos llamado a estas variantes de tres novela AR como ratón AR-Va, b, c (Mar-Va, b, c), de los cuales se identificó por primera Mar-Va en E8, con Mar-Vb y Vc en Mar-CE1 (S1 figura). El uso de las líneas celulares anteriores se determinaron los niveles de expresión relativa de cada variante. Curiosamente, la expresión Mar-Va fue más alta en las líneas E4 y E8, mientras que Mar-Vb y Vc-Mar mostraron mayor expresión en las líneas CE1 y CE2. Todas las variantes fueron significativamente menores en la expresión de la AR-FL (S2 figura).
a) La identificación de variantes Mar (a, b, c) en líneas celulares derivadas visualizaron usando PCR convencional. b) Evaluación de PCR en tiempo real de AR variantes amplificado a partir de ADNc de células E8 visualizaron por electroforesis en gel. c, izquierda) La detección de isoformas AR en líneas celulares de cáncer de próstata humano y el ratón y C, derecha) análisis de densitometría de la variante y la expresión de proteínas AR-FL normalizado a ß-actina (*, p & lt; 0,05). d) la estructura esquemática de mAR variantes (a, b, c) y de longitud completa AR (AR-FL). cajas sólido de color representan los exones comunes de AR-FL y eclosionaron casetes indican los exones crípticos. líneas atrevidas se refieren a las secuencias transcritas en sus ARNm. La secuencia de aminoácidos predicha traducido por M4A y M1C aparece (diagramas inferiores).
El uso de software de edición de plásmido ApE fuimos capaces de deducir los pesos moleculares de Mar-Va como ~ 80 kDa y Mar- Vb, Vc sea ~ 54 y 56 kDa que corresponde a nuestras transcripciones identificadas (figura 1d, S2 Tabla, Tabla S3). Para determinar si AR-Vs se pudo detectar a nivel de proteínas se utilizó un anticuerpo dirigidas a la terminal animo de la AR (Santa Cruz, N-20) y se examinaron lisados de la E8, CE1 y derivados de andrógenos castrados (E8-CSS, CE1 -CSS). Evaluada junto con las líneas humanos, LNCaP y PC3, que detectan la AR-FL (~ 110 kDa) y tres bandas principales residen en ~ 75 kD, 85 kD y especies inferiores a ~ 50 kD y ~ 56 kD (1c figura, S2 Tabla).
la ablación androgénica aumenta la expresión relativa de AR variantes
para apoyar aún más el papel de las variantes AR durante CRPC, consideramos el impacto del tratamiento anti-andrógenos. Para ello, desafiamos las líneas de células E8 y CE2, ya sea con castrar a las condiciones de cultivo de andrógenos (suero tratado con carbón vegetal, CSS) o Casodex (10 mM) durante 3 días. Sorprendentemente, en condiciones de cultivo CSS se observó el aumento de expresión de transcripción en las tres variantes con el mayor aumento veces observado en Mar-Va en células E8 (MAR-Va, 3,5 veces, Mar-Vb, 2,5 veces, Mar-Vc 2,2 veces, p & lt; 0,05) cuando se normaliza a AR longitud completa (figura 2a). El uso de Casodex, también se observó una mejora estadísticamente significativa de todas las variantes de AR usando las líneas de E8 y CE2 (Figura 2b).
a) Cultivo de cáncer de próstata murino (E8) líneas de células con tratamiento anti andrógenos incluyendo tratado con carbón vegetal suero (CSS) (3 días) o b) Casodex (10 M, 3 días) da como resultado mejora de forma significativa la expresión de AR isoformas normalizado a AR longitud completa. c) La castración quirúrgica de los mutantes PTEN (
C
+
; PTEN
L /L
, n = 7) da como resultado un aumento significativo en la expresión relativa de las isoformas de AR como detectados por Western Blot. d) la expresión variante AR transcripción de
Peso
, hormonas ratones mutantes intactas y castradas normalizaron a los niveles de AR-FL (*, P & lt; 0,05; **, p. & lt; 0,01) guía empresas
a continuación, consideramos si existían isoformas AR
in vivo usando
tumores PTEN nulo intactas hormonales (
C
+
; PTEN
L /L
; n = 6) y si la progresión a niveles de castración de andrógenos podría alterar su expresión. El uso de lóbulos resecados de la próstata (ventral, dorsal, lateral, anterior) se evaluó la expresión de ARS en la hormona mutantes intactos a los 2, 13 y 23 meses y se detecta la presencia de AR-FL (~ 110 kDa) y tres variantes principales de tamaño reducido de aproximadamente 45-50, 64 y 75 kD (figura 2c). De los 6 mutantes analizados, se observó sólo una en la cohorte de 13 meses con la expresión reducida AR-FL (*, estrella). Sorprendentemente, en los mutantes PTEN que fueron castrados quirúrgicamente (
C
+
; PTEN
L /L
; n = 7) se observó 6/7 a tener una pérdida significativa de AR-FL pero mantuvo la expresión de las isoformas AR (figura 2c, derecha). ARN cuantitativa (q-PCR) medición de Mar-Va, b, y c confirmó la elevación de isoformas de la hormona cánceres deficientes intactas y CRPC PTEN con respecto a
Wt
próstatas y normalizado a AR-FL (2d Fig ) (**, p & lt; 0,01). Para asociar aún más la presencia de truncada AR-V con la progresión resistente a la castración, se trataron PTEN mutantes de hormona intacta (
C
+
; PTEN
L /L
, n = 6) con Enzalutamida (10 mg /kg,
a través de
comida para ratones
ad libitum
) durante 10 semanas, seguido de anticuerpos contra el uso de inmunohistoquímica ya sea el AR amino terminal (AR, N-20) o AR c-terminal (AR, C-19). En consonancia con el análisis bioquímico, se observó muy baja detección de AR de larga duración, pero la tinción para robusta amino, que contiene variantes (Fig S3). Estas observaciones indican que la progresión a niveles de castración de andrógenos puede seleccionar en contra de la AR de larga duración, pero no AR variantes.
La actividad transcripcional del receptor de andrógenos longitud completa se potencia por AR variantes
Nuestro
el análisis in vivo
sugiere que la expresión relativa de las isoformas AR puede persistir durante CRPC y nos llevó a examinar las consecuencias de un aumento relativo de expresión de Mar-Vs PTEN en el cáncer de próstata deficiente. Para ello, llevamos a cabo una serie de ensayos de transcripción utilizando el PSA-luciferasa reportero plásmido [28]. En primer lugar, cada variante y la AR-FL fueron sub clonados en construcciones de expresión, seguido de la validación de expresión utilizando el Western Blot y la AR (20-N) de anticuerpos (figura 3a).
a) de Western Blot utilizando el AR ( N-20) anticuerpo confirma la expresión de variantes AR clonados en células COS-1. b) La sobreexpresión de AR variantes en las células tratadas con el control E8, DHT (0,03, 0,3 nM) o DHT + Casodex (BIC, con 1 m). (Control de
vs el mundo Mar-Va = comparaciones 1-4;.. Control de
vs el mundo Mar-Vc = comparaciones 5-6) (*, P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 ). c) Los co-inmunoprecipitación de células COS-1 transfectadas con AR-FL y, o bien AR-Va-myc (medio) o AR-Vc-myc (derecha).
Se han encontrado células de control a E8 ser sensible a DHT en una forma dependiente de la dosis (0,03-0,3 nM) (Fig 3b), mientras que las células CE1 no fueron sensibles a DHT a menos de rata exógeno AR-FL se introdujo a través de la transfección (Fig S4). Seguidamente, sobre-expresada Marva, B o C en células E8 y CE1 y observó que la isoforma Mar-Va aumentado significativamente la actividad transcripcional reportero comparación con el control transfecciones de plásmidos (comparaciones gráfico de barras 1-4, *, P & lt; 0,05, ** , p & lt; 0,01). Curiosamente, Mar-Vc transfección aumentada niveles reportero sólo en la presencia de andrógenos (comparaciones 5-6; *, p & lt; 0,05), mientras que Mar-Vb tuvo un efecto estadísticamente insignificante (p & gt; 0,05). (Fig 3b)
para entender un posible mecanismo por el cual MAR-Vs activar la función de AR-FL, se realizó el ensayo de co-inmunoprecipitaciones para la variante a la interacción AR-FL. Los plásmidos que codifican etiquetado-myc Mar-Va y MAR-Vc se generaron para este ensayo basado en el descubrimiento de que estos dos ARV podrían co-activate AR-FL en una o más de las líneas celulares ensayadas. , células negativas AR COS-1 se transfectaron con AR de rata solo (+ vector vacío) o en combinación con Mar-Va-myc (Va-myc) o mar-Vc-myc (Vc-myc) construcciones de expresión seguido de inmunoprecipitaciones para MAR -Va proteínas /VC utilizando el epítopo myc. Western blot análisis se llevaron a cabo a continuación, utilizando un anticuerpo específico para el C-terminal de AR que sólo reconoce AR-FL. Encontramos la banda de 110 kDa AR-FL a estar presente en los inmunoprecipitados Va-myc que indican que Mar-Va podría formar un complejo con AR-FL. Sin embargo, ya que una banda significativa AR-FL no se detectó en los inmunoprecipitados Vc-myc, inferimos que complejante estable fue menos eficiente o no formado entre AR-FL y AR-Vc-una observación que es coherente con reducido significativamente AR-Vb y AR-Vc mediada por co-activación del informador PSA (figura 3c). Estos datos sugieren que una mayor expresión de Mar-Vs puede mejorar la estabilidad de AR-FL mejorando de este modo dependiente de la salida ensayo de indicador de andrógenos. Estas observaciones también son similares a los obtenidos con la humana AR-V5, 6, 7ES [27].
A continuación, consideramos los efectos de la inhibición de la variante de PSA de salida reportero transcripcional. Para ello hemos diseñado siRNAs sustrato DICER (DsiRNAs) que tendrían como objetivo específicamente Mar-Va o C, pero no estaba lleno AR longitud. A través de la transfección de estos siRNAs en células E8 o CE1 junto con los plásmidos informadores de luciferasa, se observó que desmontables de cualquiera de Mar-Va y Vc reducen AR actividad transcripcional en ambas líneas celulares (Fig 4a). siRNAs variantes eran igualmente potentes en las células E8 mientras que en las células CE1, desmontables de Mar-Vc produjo el efecto más robusto (datos no mostrados). La eficiencia de la variante de derribo se ejemplifica mediante la medición q-PCR de los niveles de Mar-Vc en el control y Mar-Vc-siRNA células tratadas E8 (figura 4b).
a) las células E8 fueron transfectadas con siRNAs dirigidos ya sea Mar-Va o C y se evaluó la actividad de reportero PSA-luc 48 horas más tarde (siRNA control
vs el mundo Mar-Va siRNA = 1-3; comparaciones.. siRNA control
vs el mundo Mar-Vc siRNA = comparaciones 4-7). b) Validación de siRNA desmontables de Mar-Vc medido por Q-PCR (*, p & lt; 0,05, **, p. & lt; 0,01) guía empresas
Estos resultados indican que el Mar-Vs contribuyen a AR actividad transcripcional tanto en las células E8 y CE1 y que su inhibición se opone a la actividad de AR. Para explorar más a fondo cómo la actividad de la señalización AR puede ser modificada durante el CRPC, que mide los niveles de expresión del gen diana, AR
FKBP5
[29], utilizando dos
in vivo
manipulaciones diferentes. En primer lugar, castrados
C
+
; PTEN
ratones
L /L
mutantes en 6 semanas y se analizaron a 30 semanas y segundo que eliminan AR epitelial en PTEN próstatas deficientes (
C
+
; PTEN
L /L
; Ar
L
/Y
): un modelo que hemos caracterizado previamente (Fig S5) [30]. Al igual que en nuestros tratados Enzalutamida mutantes (Fig S3), se observó una menor pérdida de expresión de la AR distal de orientación anticuerpo /(AR-C19) y se mantuvo la expresión del anticuerpo amino terminal de orientación (AR-N20). En comparación con la hormona intacta regiones (AR +) (Fig S5B, panel superior izquierdo, AR + flechas), la expresión FKBP5 se redujo significativamente en las muestras de castración. Como validación y control para la modulación dependiente de andrógenos FKBP5 genética, se evaluó la AR y la expresión FKBP5 en PTEN nulo; regiones AR son nulos de
C
+
;
L /L
; AR
L
/Y
mutantes observando la pérdida completa de AR epitelial (AR- región) y cerca de la pérdida de la expresión de la proteína FKBP5 (S5B figura, arriba a la izquierda, flechas AR). Además, el uso de líneas CRPC derivados del modelo de ratón nulo PTEN [30], se validó la activación de andrógenos
FKBP5
tras la adición de andrógenos exógenos (S5C figura). Estos datos indican que durante la inducción quirúrgica o genética de CRPC en la tumorigénesis PTEN nulo, el eje de señalización AR-FKBP5 se deteriora.
Discusión
La sobreexpresión de los receptores de andrógenos (RA) se produce en una significativa número de cánceres de próstata en su etapa finales incluidos los progresando a la resistencia a la castración. La identificación de variantes de AR en líneas celulares humanas CRPC y muestras clínicas sugieren que las variantes AR pueden facilitar la continua función oncogénica AR a pesar de la presencia de la terapia dirigida AR [31]. Esto se puede atribuir al hecho de que la mayoría de los AR-Vs identificado hasta ahora se prevé para codificar proteínas que carecen de la LBD pero conservando el dominio de transactivación N-terminal de esta manera en calidad de los factores de transcripción constitutivamente activos. Esto indica que el AR LBD es prescindible para la actividad transcripcional de AR y contribución a la progresión del cáncer [27] [32] [33] continuó. Como consecuencia de ello, la comprensión del proceso por el cual surgen variantes AR y su contribución a la aparición de CRPC se ha convertido en un área de intensa investigación.
sistemas homólogos de cáncer de próstata (dependencia de la hormona, la resistencia a la castración y líneas celulares derivadas) tal como se obtiene usando el modelo nulo PTEN, proporcionar una plataforma excelente para evaluar el inicio de la enfermedad y la progresión [22]. Nuestro estudio, por primera vez, describe la aparición natural de estas variantes AR NTD en células de cáncer de próstata de ratón deficiente PTEN y el sitio principal órgano. Es importante destacar que, mostramos que el identificado AR-V no son estáticas, sino que en la expresión alterada durante la progresión del CRPC. Las tres variantes AR ratón identificados en este estudio están compuestos de estructuras moleculares novedosas. Mar-Va, que retiene los exones contiguos 1-4 seguido de la lectura a través en el intrón 4 y es aproximadamente análoga a la informado MAR-V4 [15] y AR
V567es [27] con la excepción del aminoácido único secuencia codificada por el extremo 3 '. Mar-Vb y Vc-Mar se componen de dos regiones diferentes, situados en el intrón 1 empalmada después de exón 1, lo que lleva a la secuencia de la proteína deducida AR-V que contiene sólo el defecto del tubo neural. La llamada AR-V8 identificado en 22Rv1 células de cáncer de próstata humanos aparece como el homólogo humano más cercano que contiene el AR-NTD seguido de una cola de 33-aa ya codificada por un exón 3 'situado dentro del intrón 3 [19]. La similitud entre las variantes identificadas ratón y los previamente identificado en líneas celulares humanas, sugiere que el estrés celular de la terapia de ablación hormonal puede actuar de forma común durante la selección de variantes de poblaciones variantes AR
Los estudios clínicos recientes han demostrado Har-V7 a ser elevados en CRPC, la metástasis, la asociación con recurrencia bioquímica y los pobres resultados clínicos [11] [17] [18] [34]. Uno de los hallazgos más importantes de nuestro estudio es la posibilidad de la castración o AR terapia dirigida para seleccionar isoformas AR ratón. Estos datos demuestran no sólo un mecanismo adicional por el que
PTEN
células de cáncer de próstata deficientes pueden progresar a CRPC sino que también tiene fuertes implicaciones para las terapias destinadas a orientar directamente el dominio de unión a ligando del receptor de andrógenos. Curiosamente, mientras que se observó el faciliten la expresión relativa de Marvs en líneas celulares derivadas de la cultura, la expresión de AR-FL se mantuvo que es diferente de lo que se observó en los tumores primarios de ratón. Esto puede atribuirse a la naturaleza monoclonal de la obtención de células
frente
la naturaleza altamente heterogénea de muestras primarias. También puede estar asociada con el mantenimiento general de las líneas celulares en condiciones intactas hormona
frente
las condiciones de castración largas se utilizan para mantener los tumores primarios. La observación sorprendente que la AR-FL disminuyó durante la progresión a niveles de castración de andrógenos o en presencia de la exposición crónica Enzalutamida, proporciona apoyo convincente de que AR-FL se selecciona en contra y que los ARV pueden facilitar la continua función AR. Los informes anteriores han demostrado que
PTEN
mutantes nulos son poco sensible tanto a la castración y Enzalutamida la terapia [23] [35] [24]. Nuestros datos demuestran el aumento relativo de variantes AR-NTD, tanto
in vitro
y
in vivo
, lo cual es consistente con la falta de respuesta a AR terapia dirigida en este modelo.
Hemos observado la capacidad para Mar-Va, pero redujo para MAR-Vb y Vc-Mar, para mejorar la actividad de los ensayos de reportero transcripcional de AR. Esto se puede atribuir al hecho de que Mar-Vb y Vc carecen de un motivo de unión a ADN. Nuestros datos, sin embargo, no se puede descartar la posibilidad de variantes como Mar-Vb y Vc tener la función oncogénica a través de mecanismos alternativos. Interesante, una variante novela AR de estructura similar se identificó en varias líneas celulares de cáncer de próstata humano [19]. El llamado AR8 también carece de un dominio de unión a ADN y, por lo tanto, al igual que el Mar-Vb y Vc Mar-identificados aquí, es poco probable que funcione como un factor de transcripción por sí solo. Más bien, se demostró AR8 asociar con Src y el receptor EGF promoviendo así una mayor fosforilación de la AR [19]. Será interesante para futuros estudios para analizar si MAR-Vb y Vc son capaces de asociaciones similares de la membrana plasmática y una contribución potencial a CRPC.
Nuestra AR-V derribar los estudios, lo que resultó en la reducción de la actividad transcripcional de AR , revelan posibles aplicaciones terapéuticas de la variante de orientación durante la progresión de CRPC. La presencia de variantes truncadas en PTEN ratón deficiente también es consistente con la observación clínica mantiene AR expresión a pesar de la presencia de potentes terapias dirigidas, AR Enzalutamida. Sin embargo, desde mar-Va, b, y c mostraron respuestas diferenciales en los cambios de expresión a la castración o Casodex en nuestros estudios, la contribución exacta (s) de variantes individuales, y su potencial cooperatividad hacia CRPC que queda por esclarecer y es probable que dependen de celulares contexto [8]. Los estudios futuros pueden considerar la posibilidad de progresión celulares localizaciones Mar-V, interacciones con otras vías oncogénicas y el impacto en
in vivo
progresión.
Los resultados aquí presentados proporcionan pruebas de la presencia de nuevas variantes detectable en la primaria sistema de órganos de los ratones nulos PTEN ingeniería genética resaltados por la expresión variante mejorada durante la progresión a niveles de castración de andrógenos. estudios terapéuticos futuros pueden considerar si la orientación temprana de estas isoformas identificadas AR puede prevenir o retrasar la progresión a CRPC. Que Mar-Va y Vc inhibición resultaron en función AR transcripcional reducida proporciona el fundamento para las pruebas de variantes focalización AR farmacológicos. Teniendo en cuenta nuestros resultados, es tentador especular que la introducción de AR-FL de nuevo a ciertas células deficientes CRPC PTEN contienen ARV pueden restablecer tales células para la terapia de privación de andrógenos.
Métodos
Cultivo de células y muestras de próstata de ratón
E4, E8, CE1 CE2 [25] [26] y cap8, P8 línea celular [36] se establecieron a partir del condicional
PTEN
modelo de ratón -null. células LNCaP y PC-3 se adquirieron de ATCC. C4-2B células COS-1 y fueron un regalo del Dr. Baruch Frenkel (Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA) y el Dr. Allen Epstein (Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA), respectivamente. Los derivados de líneas celulares de sus padres se han generado a través de la cultura 10% CSS (despojada de carbón Suero, Cellgro) por hasta 18 días. células E8 y CE2 se trataron también en medios que mantienen normales con la adición de 10 mM de anti-andrógenos, bicalutamida (Sigma-Aldrich) durante 6 días. tejidos prostáticos se obtuvieron de ratones portadores de tumores ADCA o CRPC, así como los de tipo salvaje en diferentes grupos de edad. próstatas disecados fueron procesados por la rápida congelación en nitrógeno líquido y se almacenan en -80 ° C para su posterior análisis.
Clonación y construcciones
Un total de ARN celulares se aislaron de E8 y CE1 por Kit RNAqueous-4PCR (Life Technologies) que se utilizan como fuente. La detección de empalme AR ratón variantes de ellos se logró mediante el kit GeneRacer con superíndice III RT y TOPO TA Cloning Kit de Secuenciación (Life Technologies) según los protocolos del fabricante. En pocas palabras, los ARN extraídos fueron primero a transcripción inversa utilizando el cebador GeneRacer oligo (dT) y el módulo RT superíndice III del kit. ADNc listo para la carrera fueron sometidos a 'rápida amplificación de cDNA final de PCR (3' 3 RACE-PCR) utilizando un cebador específico de gen hacia adelante (SGP) y el cebador inverso GeneRacer 3 'del módulo de GeneRacer. Otra ronda de PCR anidada se llevó a cabo para más de amplificación utilizando un cebador anidado GSP adelante y atrás cebador anidado GeneRacer 3 'proporcionado en el kit. SuperTaq Plus de la Polimerasa (Life Technologies) se utiliza tanto para 3'RACE y PCR anidada. Adelante SGP y cebadores anidados ancladas dentro de exón 1 (S1) Tabla de variantes previstas (S2 tabla) mediante cebadores específicos RACE variantes (S3 Tabla). 3 'RACE y productos de PCR anidada fueron examinados por sub clonación y secuenciación estándar TA utilizando el Módulo de clonación TOPO TA. ApE plásmido Editor se utilizó en este estudio para analizar los resultados de secuenciación, predecir las secuencias de proteínas y generar mapas de texto para Marvs (S3) guía Tabla
construcciones de plásmidos utilizados en este estudio fueron:. Rata AR de larga duración (Dr. Robert Matusik, Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN), de larga duración AR humana (Dr. Jeremy Jones, City of Hope, Duarte, CA), y PSA-luciferasa reportero y pcDNA3.1-myc (Dr. Parkash Gill, Universidad del Sur California, Los Ángeles, CA). pCR4-TOPO fue comprado en el kit de clonación TOPO TA para la secuenciación (Life Technologies).
CDS (secuencias de codificación) para Marva, Vb y Vc se amplificaron mediante PCR a partir de ADNc de E8 y CE1 utilizando los conjuntos de cebadores que encierran el marco de lectura abierto (ORF), y sub clonados en pcDNA3.1-myc -HisC. Para generar los constructos ARVA-myc y MVDA-myc, atrás primers fueron re-diseñados para ser anclado aguas arriba de sus propios codones de terminación y en enmarcado con la ORF de vector de expresión. Hifi AccuStart Taq ADN polimerasa (Quanta Biosciences) y HotStar Taq ADN polimerasa (Qiagen) se aplicaron en la clonación PCR. Las secuencias de cebador usado para clonar Va, Vb, Vc, Va-myc y Vc-myc se proporciona en la Tabla S4.
PCR y cuantitativa en tiempo real PCR
Total de los ARN celulares se extrajeron de todas las líneas celulares derivado parental o de otro y luego a transcripción inversa utilizando oligo (dT) y el superíndice III primer capítulo de síntesis (Life Technologies). Las muestras de ARN se utilizan para diversos ensayos se aislaron de células con diferentes lotes. PCR convencional se realizó en ADNc utilizando el mismo cebador directo anclado dentro exon1 emparejado con cebador inverso específico para MAR-Va, b, c y AR-FL, respectivamente (Tabla S5). Quantitative PCR en tiempo real y análisis de datos se han descrito anteriormente. Los conjuntos de cebadores en tiempo real diseñados específicamente y exclusivamente para amplificar cada ARV y AR-FL se enumeran en la Tabla S6.
Transfección y ensayo de luciferasa reportero
1-2 días antes de la transfección, las células se colocaron en un medio que contiene suero tratado con carbón vegetal (CSS). Para todas las transfecciones, las mezclas de células fueron transfectadas utilizando Lipofectamine Plus (Invitrogen) con vacío plásmido vector de control, el plásmido AR de longitud completa, o plásmidos variante de empalme AR junto con las construcciones sensibles a andrógenos MMTV-luciferasa de luciérnaga o PSA-luciferasa de luciérnaga [28 ] y el control de luciferasa de Renilla andrógenos insensible pRL-SV40 (Promega). plásmido vector vacío de control se utiliza para equilibrar el total de ADN en todas las transfecciones. El día siguiente, las células se sembraron por cuadruplicado con las drogas en placas de 96 pocillos. 24 horas más tarde actividades de luciferasa se cuantificó (kit de ensayo de luciferasa Dual, Promega) en un lector de placas (Tecan) y la señal de luciérnaga normalizada a la señal de renilla para controlar el número de células.
Ensayo
Co-inmunoprecipitación
las células COS se transfectaron con Marva-myc o mARVc-myc, junto con la rata AR-FL utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según el protocolo del fabricante. Aproximadamente 48 hrs.