Extracto
MUC1 en vivo se asocia con la transformación celular y la tumorigenicidad y es considerado como un importante antígeno asociado a tumor (TAA) para el tratamiento del cáncer. Hemos informado anteriormente de que el anticuerpo monoclonal anti-MUC1 C595 (C595 MAb) más docetaxel (DTX) mayor eficacia de DTX solo y causaron células epiteliales humanas cultivadas de cáncer de ovario (EOC) para someterse a apoptosis. Para estudiar más a fondo los mecanismos de esta combinación la apoptosis mediada, se investigó la eficacia de esta terapia de combinación
in vivo en un
intraperitoneal (i.p.) modelo de ratón EOC. OVCAR-3 células se implantaron intraperitonealmente en ratones desnudos atímicos hembra y se dejaron crecer tumor y ascitis. Los ratones se trataron luego con solo MAb C595, DTX, prueba de combinación (MAb C595 y DTX), el control de combinación (negativo MAb IgG
3 y DTX) o i.p. control del vehículo durante 3 semanas. Los ratones tratados murieron 4 semanas después del tratamiento. Se evaluó el volumen de ascitis, el peso del tumor, los niveles de CA125 de la ascitis y la supervivencia de los animales. La expresión de MUC1, CD31, Ki-67, TUNEL y proteínas apoptóticas en xenoinjertos de tumores se evaluó por inmunohistoquímica. Mab C595 sola vía intraperitoneal inhibido el crecimiento del tumor y la producción de ascitis de una manera dependiente de la dosis, pero no prevenir, obviamente, el desarrollo de tumores. Sin embargo, la prueba de combinación redujo significativamente el volumen, el crecimiento tumoral y las metástasis ascitis, los niveles de CA125 en la ascitis y la mejora de la supervivencia de los ratones tratados en comparación con los ratones tratados con un solo agente, control de combinación o control de los animales tratados con vehículo (
P Hotel & lt; 0,05). Los datos estaban en un buen acuerdo con que a partir de células cultivadas
in vitro
. Los mecanismos detrás de los efectos observados podrían ser a través de la orientación antígenos MUC1, la inhibición de la angiogénesis tumoral, y la inducción de apoptosis. Nuestros resultados sugieren que este enfoque de combinación puede reducir eficazmente la carga tumoral y ascitis, prolongar la supervivencia de los animales a través de la inducción de la apoptosis y la necrosis del tumor, y puede proporcionar una terapia potencial para EOC metastásico avanzado
Visto:. Wang L, Chen H, Pourgholami MH, Beretov J, Hao J, Chao H, et al. (2011) anti-MUC1 anticuerpo monoclonal (C595) y docetaxel incrementa y reduce la carga tumoral y ascitis, y prolongar la supervivencia en un
in vivo
Modelo cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (9): e24405. doi: 10.1371 /journal.pone.0024405
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2011; Aceptado: 9 Agosto de 2011; Publicado: 9 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue parcialmente apoyado por una beca de colaboración Internacional de la Junta de Salud de Henan, china (LW, HMC y HTC), una beca de Desarrollo de Carrera NSW Cancer Institute (YL) y el Fondo de St George hospital de cáncer de ovario Research Trust (YL y JK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer de ovario
epitelial (EOC) es la neoplasia ginecológica más letal y la quinta causa más común de muerte por cáncer en mujeres en los Estados Unidos, lo que resulta en un estimado de 21.880 nuevos casos y 13.850 muertes en 2009 [1 ]. Los pacientes con enfermedad avanzada tienen una tasa de respuesta de más del 80% después de la cirugía y la quimioterapia adyuvante con platino-taxano, con una mediana de intervalo libre de progresión de 18 meses [2]. Desafortunadamente, el cáncer se repite en la mayoría de estos pacientes, y la tasa de supervivencia global a 5 años para los pacientes con enfermedad en estadio avanzado es solamente 23-30% [3]. la quimioterapia convencional contra el cáncer a menudo da lugar a efectos secundarios graves relacionados con los modos no específicos de acción. Los estudios que evalúan diversos agentes citotóxicos en EOC recurrente han encontrado tasas de respuesta de 10 a 28%, con un aumento progresivo de acompañamiento en el número de tumores resistentes a fármacos [4]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias terapéuticas para mejorar el resultado de esta enfermedad mortal. Un enfoque prometedor que puede mejorar el resultado del paciente es el uso de anticuerpos monoclonales (MAbs) en combinación con la quimioterapia tradicional.
MUC1 es una gran glicoproteína transmembrana de peso molecular que se sobreexpresa en muchos carcinomas [5], [6], incluidos EOC [7] - [9], y media en los eventos de transducción de señales que estimulan la motilidad, invasión y metástasis de las células del cáncer [10]. MUC1 se sobre-expresa en el 90% de las superficies celulares de EOC [7], [8]. Los mayores niveles de expresión de MUC1 por las células cancerosas pueden enmascarar los dominios extracelulares de la vigilancia inmune, que confiere una ventaja de supervivencia en las células malignas y que juega un papel importante en la capacidad de los tumores para invadir y metastatizar [11]. Por lo tanto, MUC1 asociado al tumor es una diana molecular prometedora para una nueva terapia para pacientes EOC.
C595 es una IgG
3, murino MAb levantó contra el núcleo de la proteína de MUC1 (mucin1 epiteliales urinario) humanos [ ,,,0],12]. mapeo de epítopos han demostrado que C595 reconoce un motivo tetrapéptido (RPAP) dentro del núcleo de la proteína de mucina MUC1 que contiene un gran dominio de múltiplos de una secuencia altamente conservada 20-amino-ácido de repetición (PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA) [12], [13]. Mab C595 ha sido marcada con radioisótopos γ-emisores de luz (
111 In) para poner a prueba su capacidad para la localización del cáncer y la identificación de 19 pacientes con sospecha clínica de malignidad ovárica, y ha logrado precisiones finales de 79% y un 64% en comparación con la resonancia magnética formación de imágenes y de ultrasonido en relación con la histología del tumor final [14]. Después de marcar con α-emisor (
213Bi),
213Bi-C595 α-conjugado (AC) se ha utilizado para un solo objetivo de próstata [15], [16] y las células de ovario de páncreas [17]
In
vitro y tener regresión de xenoinjertos subcutáneos pancreáticas
in vivo
[18]. Estos resultados apoyan la hipótesis de que el MAb C595 es útil ya sea solo o en combinación con otras terapias para mejorar el tratamiento de la EOC avanzada.
Aunque paclitaxel se utiliza en la terapia de primera línea, su docetaxel analógica (DTX) tiene ventajas, incluyendo más lento eflujo celular y mayor solubilidad, lo que permite mayores concentraciones intracelulares [19]. En los ensayos clínicos, DTX resultó en tasas de respuesta equivalentes y ha demostrado actividad contra los carcinomas al paclitaxel [20], [21]. DTX ha demostrado una actividad significativa en ambos estudios preclínicos y clínicos para el tratamiento de numerosas enfermedades malignas sólidas incluyendo EOC [22] - [25]. Es plausible que DTX puede llegar a ser parte de la terapia de primera línea para EOC. DTX combina con un compuesto de platino (por ejemplo carboplatino) se ha convertido en la quimioterapia sistémica de elección para EOC primaria, con alta eficacia. Sin embargo, la toxicidad relacionada con la dosis y la posible aparición de resistencias son cuestiones importantes que requieren atención en un entorno de oncología ginecológica. En última instancia, la mayoría de estos pacientes morirán de la enfermedad metastásica. El mantenimiento de niveles bajos de la droga en la circulación sistémica a través de la administración localizada en consecuencia, puede reducir los efectos secundarios tóxicos, y aumentar las concentraciones locales de la droga en el peritoneo, donde los tumores de ovario y ascitis residen. Esto se puede lograr a través de inyecciones i.p. administración. El Instituto Nacional del Cáncer ha recomendado que i.p. quimioterapia considerarse para el tratamiento de cáncer de ovario avanzado [26]. La terapia de combinación que emplea específicamente estrategias tales como un agente quimioterapéutico además de un anticuerpo a través de inyecciones i.p. administración puede reducir eficazmente la toxicidad limitante de la dosis y mejorar la eficacia del tratamiento
En un reciente estudio, hemos demostrado que Mab C595 por sí sola podría matar las células EOC en una forma dependiente de la dosis.; este asesinato también dependía de los niveles de expresión de MUC1. Bajas dosis de MAb C595 combinado con DTX aumento de la sensibilidad EOC para el medicamento de quimioterapia y la reducción de la dosis requerida [27]. En este estudio, la hipótesis de que este tratamiento de combinación puede funcionar eficazmente en un
in vivo
EOC modelo animal. Se encontró que el Mab C595 podría inhibir i.p. el crecimiento del tumor y la producción de ascitis en el modelo de xenoinjerto de OVCAR-3 de ratón y mejorar la eficacia terapéutica de DTX de una manera dependiente de la concentración, y que después de i.p. inyección, este tratamiento de combinación (test) (MAb C595 y DTX) podría reducir notablemente la carga tumoral y la ascitis y en consecuencia prolongar la supervivencia de los animales tratados. Nuestros resultados sugieren que esta nueva combinación es prometedora como una terapia potencial para el tratamiento de la EOC metastásico avanzado.
Materiales y Métodos
Droga
DTX se adquirió de Sigma-Aldrich , Pty Ltd, Castle Hills, Nueva Gales del Sur, Australia. El fármaco se diluyó por primera vez en [hydroperoxymethyl celulosa (HPMC), preparado como 0,5% en PBS] y se almacena a 4 ° C para su uso.
Los anticuerpos
Mab C595 fue proporcionado amablemente por la Universidad de Nottingham ( Nottingham, Reino Unido). IgG de ratón anti-humano de control
3 isotipo MAb fue adquirido de Zymed Laboratories Inc (South San Francisco, CA, EE.UU.). Anticuerpos monoclonales de conejo anti-humana Ki-67, caspasa-3 (activo), y PARP-1 (p85 escindido) fueron proporcionados por Epitomics (Burlingame, CA, EE.UU.). Rat anti-ratón CD31 MAb fue adquirido de BD Pharmingen (Bedford, MA, EE.UU.). Porcina anti-cabra, -mouse, -rabbit IgG /biotinilado, IgG de conejo anti-rata /biotina, estreptavidina /peroxidasa de rábano (HRP) y IgG de ratón de control
1 negativo MAb se adquirieron de Dakopatts (Glostrup, Dinamarca).
línea celular y modelo animal
Para todos los experimentos, se utilizaron 6~8 semanas de edad desnudos atímicos BALB /c nu /nu (Centro de Recursos animales, Perth, Australia occidental). Los ratones fueron alojados y mantenidos en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por la Universidad de Nueva Gales del Sur (UNSW) Cuidado de Animales y Comité de Ética (ACEC). Este estudio fue aprobado por ACEC, UNSW (ID: 08 /110A). Los animales se mantuvieron al menos 1 semana antes del procedimiento experimental.
La línea celular primaria EOC OVCAR-3 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.), y el sub-línea de OVCAR-3 se seleccionó y se han establecido con éxito en una ip modelo de xenoinjerto utilizando ratones desnudos en nuestro laboratorio [28]. Esta selección puede aumentar la tumorigenicidad de las células OVCAR-3
in vivo
. células Brevemente, viable OVCAR-3 (5 × 10
6/500 mu L en DPBS) fueron inyectados por vía intraperitoneal utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 26 y se dejaron crecer. La progresión tumoral se documentó una vez por semana durante 10 semanas por mediciones de la circunferencia abdominal para aumento abdominal usando una regla suave. Después del sacrificio, los tumores se retiraron para ponderar y procediendo para la prueba histológica
Los protocolos de tratamiento
estudios de toxicidad en ratones desnudos sin tumores:. Se llevaron a cabo estudios de toxicidad para determinar la dosis de tolerancia máxima (MTD) en ratones para cada Mab C595, IgG de ratón Mab
3 control negativo, DTX, prueba combinada (Mab C595 y DTX) y el control de combinación (negativo Mab IgG
3 y DTX). La relación dosis-tolerancia se examinó en ratones desnudos (sin tumores) para un solo i.p. administración de MAb C595, DTX y el tratamiento de combinación (prueba) en comparación con el tratamiento de control de combinación. Grupos de cinco ratones recibieron una concentración total inyectada de 1, 5, 10, 15, 20 mg /kg de MAb C595, o 3, 5, 7, 10, 15 mg /kg de DTX, así como combinado MAb C595 (1 /3 de MTD, es decir, 5 mg /kg) o 5 mg /kg de anticuerpo IgG
3 con 3, 5, 7, 10 mg /kg de DTX durante 3 semanas. Las dosis seleccionadas de MAbs se basaron en el MTD de la sola de MAb C595 y DTX. pesos de los ratones fueron comparados con aquellos en el día 0 (primer día de administración del tratamiento) para determinar el porcentaje de cambio de peso. La toxicidad limitante de la dosis se definió como puntos finales: pérdida de 15% del peso corporal o el comportamiento en dificultades (es decir, pérdida de apetito y la actividad, encorvado postura). La MTD se definió como la dosis más alta a la que un tercio de la cohorte alcanzó puntos finales toxicidad limitante de la dosis [29]. Después de 10 semanas, se sacrificaron los ratones sanos. Los siguientes experimentos se basaron en el MTD de los estudios de toxicidad
Los estudios de eficacia en OVCAR-3 modelo animal EOC:. Después de que el desarrollo de ascitis, la cavidad peritoneal se lavó con 2 ml de solución salina normal estéril. El contenido peritoneales se mezclaron mediante la gestión suavemente y luego completamente aspirado [28]. Los ratones fueron distribuidos al azar a continuación, ya sea en el grupo de tratamiento MAb C595 o DTX solo sola o la combinación de pruebas (MAb C595 y DTX) y el control de combinación (MAb IgG
3 y DTX) grupo (n = 10, por grupo). Los diferentes tratamientos se iniciaron inmediatamente después de la aspiración del líquido ascítico.
a). Para el tratamiento único MAb C595, dosis baja (LD) (5 mg /kg) o una dosis alta (HD) (15 mg /kg) MAb en suspensión en 1 ml de solución salina, y el mismo volumen de solución salina con 15 mg /kg de ratón Mab IgG
3 (control) se les administró una vez /semana durante 3 semanas.
b). Para el tratamiento DTX sola, LD (5 mg /kg) o HD (10 mg /kg) DTX suspendió en 1 ml de HPMC (preparado como 0,5% en PBS) como vehículo y el mismo volumen de HPMC como control.
c). Para el ensayo de combinación (MAb C595 y DTX) y el control de combinación (MAb IgG
3 y DTX) grupos, se utilizó el siguiente. Combinación de prueba incluía una sola dosis de MAb C595 (tercera dosis de MTD, es decir, 5 mg /kg en suspensión en 0,5 ml de solución salina) en combinación con una dosis única de DTX (10 mg /kg DTX en suspensión en 0,5 ml de HPMC). de control de combinación incluye una sola dosis de MAb IgG
3 (5 mg /kg en suspensión en 0,5 ml de solución salina) en combinación con una dosis única de DTX (10 mg /kg DTX en suspensión en 0,5 ml de HPMC). El tratamiento de combinación (de prueba y de control) se administró secuencialmente de Mab C595 o Mab IgG
3 a DTX.
Por vía intraperitoneal
Se realizaron todos los tratamientos y la duración prevista del tratamiento fue de 4 semanas basado en nuestros estudios anteriores. Después de los tratamientos, si la circunferencia abdominal de un animal llegó a 9,5 cm o si se esperaba que están moribundos dentro de un corto período de tiempo, los animales fueron sacrificados. El tiempo de supervivencia de cada animal se calculó como el número de días transcurridos entre el inicio del tratamiento y la eutanasia. Al final de los experimentos, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical bajo anestesia mientras urethrane.
Ejemplo colección
Antes de la eutanasia, se recogió una muestra de sangre a través de punción cardíaca bajo anestesia. Al final de los experimentos, 2 ml de solución salina fisiológica se inyectó i.p. y la cavidad peritoneal fue completamente lavado y aspirado para la detección de CA125. Se registraron los volúmenes de ascitis en la cavidad peritoneal. Las ascitis de lavado líquido, tumores diseccionados de la cavidad peritoneal, y el plasma, fueron almacenadas a -80 ° C para su posterior análisis. volumen acumulado real de la ascitis recogidos después de cada aspiración se calcula restando el 2 ml del volumen total recogido.
niveles de CA125 en líquido ascítico
índices de marcadores tumorales (CA125 Ku /L) en las células exento de líquido ascítico de un solo MAb C595, DTX y tratamientos de combinación (de prueba y control) se determinó mediante un ensayo ELISA siguiendo las instrucciones en el George hospital de Bioquímica Laboratorios St. La concentración de CA125 en la ascitis se normalizó con el volumen real de ascitis recogidos.
Ratón tejidos y la histología
Los tejidos tumorales de combinación o vehículos animales individuales MAb, DTX, fueron tratados con control ya sea inmediatamente se congelaron rápidamente para secciones congeladas o fijadas en formalina al 10% durante 24 horas, incrustado en el bloque de parafina para H & amp; e tinción inmunohistoquímica. Cinco micrómetro secciones congeladas de muestras tumorales recientes se utilizaron para CD31 inmunotinción. Para los estudios de toxicidad, se recogieron los órganos pertinentes de ratón como el riñón, el hígado, el corazón y la médula ósea, fijado en formol y se envía para examen patológico (IDEXX Laboratories, Sydney, Australia).
La toxicidad hematológica y la función renal examen
Para determinar la toxicidad hematológica, 200 l de sangre en cada ratón se recogió en K3 EDTA y tubos MiniCollect gel suero Z (Greiner Bio-One, Alemania) a través de la vena safena y Microvette (Sarstedt, Alemania) antes del tratamiento y a las 2 y 3 semanas después de la inyección única o combinación. Se realizaron análisis hematológicos de glóbulos blancos (WBC), linfocitos, glóbulos rojos (RBC), y el recuento de plaquetas. La sangre se obtuvo al final de los experimentos para el análisis bioquímico del suero para las funciones renales.
La inmunohistoquímica
procedimientos estándar de inmunoperoxidasa fueron utilizados para visualizar MUC1, Ki-67, caspasa-3 (activo) y PARP-1 (p85 escindido). Brevemente, las secciones de parafina se deparaffinised en xileno, seguido de una serie graduada de alcoholes (100%, 95% y 75%) y re-hidratados en agua seguido por Tris-buffer.
salino (TBS) ( pH 7,5). Los portaobjetos se sumergieron posteriormente en ebullición 0,01 M de tampón de citrato (pH 6,0) durante 15 minutos para mejorar la recuperación de antígenos, se trató con peróxido de hidrógeno al 3% y después se incubaron con MAbs primarias: MUC1 (1:500 dilución), Ki-67 (1:50 dilución), caspasa-3 (activo) (1:100 dilución) y PARP-1 (p85 escindido) (1:100 dilución), respectivamente durante la noche (o /n) a 4 ° C. Después de lavar con TBS, los portaobjetos se incubaron con porcina anti-cabra, ratón, conejo biotinilado segundo anticuerpo IgG (1:150 dilución) durante 45 min a temperatura ambiente (RT), y luego con avidina solución /peroxidasa de rábano picante (HRP) (1 :300 dilución) durante 30 min a RT. Las secciones se desarrollaron por fin con 3,3 'diaminobencidina solución de sustrato (DAB) (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, Nueva Gales del Sur, Australia), entonces contraste con hematoxilina; células positivas aparecieron marrón. diapositivas de control se trataron de una manera idéntica, y se tiñeron con el mAb isotipo u omisión del anticuerpo primario como un control negativo. Los controles positivos fueron seleccionados en función de diferentes anticuerpos monoclonales, tejido de carcinoma de colon para MUC1, tejido de la lengua para Ki-67 y tratado con DTX OVCAR-3 línea celular para la caspasa-3 (activo) y PARP-1 (p85 escindido).
para la tinción de CD31, las secciones congeladas se descongelaron, y se fijaron en acetona fría durante 10 min a TA se secó al aire. Después de un aire de secado rápido y el lavado con TBS, las secciones se incubaron con la rata anti-ratón CD31 MAb (1:100 dilución) o /n a 4 ° C. Después de enjuagar con TBS, las secciones se incubaron con anticuerpo de conejo anti-rata biotinilado IgG (1:200 dilución) durante 45 min, y después con conjugado estreptavidina /HRP (1:200 dilución) durante otros 30 min. Las secciones fueron desarrollados mediante el uso de solución de DAB (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, Nueva Gales del Sur, Australia), y el contraste con hematoxilina. Los portaobjetos de control fueron tratados de manera idéntica, y se tiñeron con el mAb isotipo u omisión del anticuerpo primario como control negativo.
ensayo de TUNEL de células apoptóticas
in vivo
apoptosis se evaluó en los tejidos de xenoinjerto de tumor utilizando el método de TUNEL con el TdT-fragel in situ kit de detección de apoptosis (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La especificidad de la reactividad se confirmó con TUNEL negativa apropiada (TdT omitido de la mezcla de marcaje) y positivos (HL-60 tratadas diapositivas proporcionadas por la empresa) controles. Las láminas fueron examinadas usando un microscopio Leica luz (Nussloch, Alemania).
Evaluación de la inmunotinción
intensidad de la tinción (0-3) se evaluó mediante microscopía óptica (microscopio Leica, Alemania) a una × 40 objetiva - (negativo), + (débil), ++ (moderada) y +++ (fuerte). Evaluación de la tinción de tejidos se realiza, de forma independiente, por dos observadores experimentados (LW y HMC). Todas las muestras se obtuvieron ciega y se tomó un promedio de calificaciones. Si se obtuvieron resultados discordantes, las diferencias se resolvieron mediante la revisión y consulta conjunta con un tercer observador, con experiencia en patología inmunohistoquímica.
El análisis estadístico
Todos los datos numéricos se expresaron como el promedio de los valores obtenidos , se calculó y la desviación estándar (SD). Los datos de los grupos tratados y de control se compararon mediante la prueba t de Student de dos colas. Todos los
P
valores fueron de 2 caras. ANOVA de una vía, seguido por el test post hoc de Dunnett se realizó para determinar diferencias significativas en ratones cambios medios de peso en los estudios toxicológicos. La supervivencia se calculó como el número de días transcurrido entre el inicio del tratamiento y la eutanasia, y% ratones supervivientes era el número de animales restantes en cada grupo (× 10) al final de cada semana después de la iniciación del tratamiento.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete GraphPad Prism 4.00 (GraphPad, San Diego, CA, EE.UU.).
Resultados
Evaluación toxicológica de un solo MAb C595, tratamientos de combinación y DTX
administración de una dosis única de Mab C595 a 1, 5, 10, 15 mg /kg y DTX a los 3, 5, 7, 10 mg /kg para las primeras 3 semanas no llegar a los puntos finales de toxicidad a los 70 días post-tratamiento (Fig. 1A y B). Una sola administración de control de MAb IgG
3 a 15 y 20 mg /kg durante los primeros 3 semanas no llegó a puntos finales de toxicidad a 70 días después del tratamiento (datos no mostrados). Los ratones tratados con 20 mg /kg de anticuerpo monoclonal C595 /semana o 15 mg /kg de DTX /semana comenzó a perder peso y fueron sacrificados 4 semanas después del tratamiento, debido a signos de sufrimiento; examen histopatológico indicó nefropatía leve en estos grupos. Los resultados sugieren que la MTD para una dosis única de AcM C595 se encuentra entre 15 y 20 mg /kg mientras que la MTD para una sola administración de DTX se encuentra entre 10 y 15 mg /kg.
cambios de peso porcentaje medio en comparación con los días 0 (es decir, días de administración única o combinación). A. Relación dosis de tolerancia en ratones mediante la sola Mab C595. ▪: MAb C595 (1 mg /kg); ▴: MAb C595 (5 mg /kg); ▾: MAb C595 (10 mg /kg); ♦: MAb C595 (15 mg /kg); •: MAb C595 (20 mg /kg). Se encontró que la diferencia significativa entre los 20 mg /kg de grupo tratado con C595 MAb y otros grupos tratados con MAb C595 (5-15 mg /kg) (
P
& lt; 0,05). B. Relación dosis de tolerancia en ratones por una sola DTX. ▪: DTX (3 mg /kg); ▴: DTX (5 mg /kg); ▾: DTX (7 mg /kg); ♦: DTX (10 mg /kg); •: DTX (15 mg /kg). Se encontró que la diferencia significativa entre los 15 mg /kg de grupo tratado con DTX y otros grupos DTX-tratado (5-15 mg /kg) (
P
& lt; 0,05). C. Relación dosis de tolerancia en ratones mediante la prueba de combinación [MAb C595 (5 mg /kg) + DTX (3-10 mg /kg)]. ▪: MAb C595 + DTX (3 mg /kg); ▴: MAb C595 + DTX (5 mg /kg); ▾: MAb C595 + DTX (7 mg /kg); ♦: MAb C595 + DTX (10 mg /kg). D. Relación dosis de tolerancia en ratones por el control de combinación [MAb IgG
3 de control (5 mg /kg) + DTX (3-10 mg /kg)]. ▪: Mab IgG
3 + DTX (3 mg /kg); ▴: Mab IgG
3 + DTX (5 mg /kg); ▾: Mab IgG
3 + DTX (7 mg /kg); ♦: Mab IgG
3 + DTX (10 mg /kg). Puntos, media (n = 5 en cada grupo); bar, SD.
Para los tratamientos de combinación, se utilizó 1/3 MTD MAb C595 (es decir, 5 mg /kg) como una prueba y 5 mg /kg de MAb negativo IgG3 como un control combinado con una gama de DTX (1~10 mg /kg) para evaluar aún más la toxicidad de los tratamientos de combinación. Ninguna toxicidad fue encontrado en los tratamientos de combinación (Fig. 1C y D). No había signos macroscópicos de toxicidad crónica a los órganos principales para cualquier ratón. Los recuentos de leucocitos estaban deprimidos en la sangre periférica en ratones tratados durante 2 semanas después de la inyección, con la recuperación se produce por 4 semanas y hematología normales se observó a los 70 días. Estos resultados sugieren que los tratamientos de combinación con AcM C595 y DTX o con IgG de control AM
3 y DTX podría ser utilizado con seguridad en modelos animales para estudiar la eficacia.
Efecto de la única Mab C595 y DTX en la inhibición del crecimiento tumoral y la producción de ascitis
en primer lugar nos comparó la actividad antitumoral de un solo Mab C595, Mab IgG de control
3, solo DTX y el control del vehículo (HPMC), tras el desarrollo de ascitis y la aspiración inicial de 3 semanas. volumen acumulado de líquido ascítico producido por animal se presenta en la Fig. 2A. ratones tratados con vehículo continuado para producir ascitis a una velocidad más frecuente y tuvo que ser aspirado en repetidas ocasiones durante el curso del tratamiento (28 días), mientras que los ratones tratados con C595 MAb produjo menos ascitis relacionados con la dosis de MAb C595 (4 ± 1 ml para HD y 5 ± 1 ml de LD, respectivamente) en comparación con los ratones control mAb IgG3 (7 ± 2 ml) (Fig. 2A). ratones tratados con DTX desarrollado ascitis lentamente en comparación con el control de HPMC (6 ± 1 ml) y la producción de ascitis estaba relacionada con la dosis de DTX (2 ± 1 ml para HD y 4 ± 1 ml de LD, respectivamente) (Fig. 2A ). El HD de DTX (10 mg /kg) redujo significativamente el desarrollo de ascitis (P & lt;. 0.05, Fig 2A). Además de la producción de ascitis, también se evaluó el cambio total del peso del tumor en cada grupo al final de los experimentos (4 semanas después del tratamiento). El cambio del peso del tumor es consistente con el cambio de la producción de ascitis (Fig. 2B). Individual MAb C595 inhibe sólo parcialmente el crecimiento de OVCAR-3 tumores, como se evidencia por el peso del tumor de 380 ± 80 mg en LD (5 mg /kg) y 260 ± 76 mg en HD (150 mg /kg) frente a 560 ± 77 mg en ratones que recibieron el control IgG3 MAb negativo (15 mg /kg) (P & lt; 0,05), respectivamente, mientras que solo DTX obviamente inhibió el crecimiento de OVCAR-3 tumores, como se evidencia por el peso del tumor de 230 ± 66 mg en LD (5 mg /kg ) y 75 ± 14 mg en HD (10 mg /kg) frente a 540 ± 96 mg en ratones que recibieron el mismo volumen de HPMC (P & lt; 0,05), respectivamente (figura 2B).. Estos resultados sugieren que tanto MAb C595 y DTX pueden inducir la regresión del crecimiento del tumor OVCAR-3 de una manera dependiente de la dosis y que la actividad anti-tumor de DTX es más eficaz que la de MAb C595.
Después de la eutanasia, la cavidad peritoneal de cada ratón se lavó con 2 ml de solución salina normal, y después de la aspiración, se registró el volumen de ascitis presente. A. volúmenes acumulados de ascitis recogidas de cada animal a partir del inicio del tratamiento [Mab C595 (H y L), Mab IgG
3, se muestra DTX (H y L). La diferencia obvia se observó entre DTX (H) Grupo grupo tratado y otros tratados (
P Hotel & lt; 0,05). B. pesos tumorales (mg) al final de los experimentos después de una sóla Mab C595, Mab IgG
3, DTX o vehículos tratamientos con diferentes dosis. El tumor era obviamente un peso menor en los grupos tratados con MAb y tratados con DTX en comparación con MAbIgG
3-tratado y el grupo control tratado con HPMC (
P Hotel & lt; 0,05). C. Efecto de la única MAb C595, MAb IgG
3, DTX o vehículo en suprimir el aumento en el marcador tumoral CA125 (CA125 Ku /L) en el fluido de ascitis (lavado peritoneal) al final de los experimentos. El nivel de CA125 era obviamente menor en Mab C595 (H) y tratados con los grupos tratados con DTX en comparación con MAbIgG
3-tratado y el grupo control tratado con HPMC (
P Hotel & lt; 0,05). H: alta dosis; L: baja dosis. se muestran las gráficas representativas.
Efecto de la combinación de Mab C595 y DTX sobre el crecimiento tumoral, la producción de ascitis y la supervivencia
A continuación, comparó la actividad antitumoral de la combinación de 1/3 MTD MAb C595 (5 mg /kg) o el control MAb IgG
3 (5 mg /kg) con una DTX dosis (10 mg /kg) después de desarrollo de ascitis y la aspiración inicial durante 3 semanas. La prueba de combinación (5 mg /kg de anticuerpo C595 y 10 mg /kg DTX) podría inhibir significativamente el desarrollo de ascitis en comparación con el control de combinación (5 mg /kg de anticuerpo IgG3 y 10 mg /kg DTX) y el control del vehículo (Fig. 3A) . El patrón de la producción de ascitis en el grupo control combinación es similar a la observada para un solo 10 mg /kg de tratamiento DTX como se describe anteriormente. volumen acumulado de líquido ascítico producido por animal se presentan para la prueba de combinación (0,4 ± 0,2 ml), control de combinación (2 ± 1 ml) y el control del vehículo (7 ± 2 ml) en la Fig. 3B (P & lt; 0,05). Cuatro semanas después del tratamiento, el tratamiento de prueba combinación inhibió significativamente el crecimiento de OVCAR-3 tumores, como se evidencia por el peso del tumor de 15 ± 11 mg frente a 65 ± 16 mg en el grupo control combinación y 560 ± 100 mg en el grupo de control del vehículo (P & lt ; 0,05), respectivamente (Fig 4A y B).. La supervivencia de los animales era mucho mejor en el grupo de combinación de pruebas que los grupos control y de control de combinación de vehículos (P & lt; 0,05). (Fig. 4C)
A. Al final de los experimentos, no hay signos evidentes de la formación de ascitis se ven en combinación de pruebas (5 mg /kg de anticuerpo C595 + 10 mg /kg DTX) ratones tratado con (a); signos de formación de ascitis se encontró en el control de combinación (5 mg /kg de anticuerpo C595 + 10 mg /kg DTX) ratones tratado con (b); signos evidentes de la formación de ascitis se encontró en el vehículo (solución salina 1/2 + 1/2 HPMC) ratones tratado con (c). B. Se muestran los volúmenes acumulados de ascitis combinación de pruebas, control de combinación o ratones tratados con vehículo (
P Hotel & lt; 0,05). C. Efecto de la combinación de ensayo, control de combinación o vehículo en la supresión del aumento en el nivel de marcador tumoral (CA 125 kU /L) en el fluido de ascitis (lavado peritoneal) al final de los experimentos (
P
& lt; 0,05 ). imagen representativa y gráficos se muestran.
A. El peso del tumor cambia al final de los experimentos después de los tratamientos de ensayo de combinación, de control de combinación o de vehículos con diferentes dosis (
P
& lt; 0,05). B. El volumen del tumor en los ratones de ensayo tratados con la combinación fue significativamente menor que en los ratones de control tratados con vehículo (
P
& lt; 0,01). C. Para todos los animales, la duración prevista de tratamiento fue de 4 semanas. Los ratones (10 por grupo) se les practicó la eutanasia si es debido a la mala salud, se esperaba que están moribundos dentro de un corto período de tiempo. La supervivencia se calculó como el número de días transcurrido entre el inicio del tratamiento y la eutanasia, y% ratones supervivientes era el número de animales restantes en cada grupo (× 10) al final de cada semana después de la iniciación del tratamiento. La tasa de supervivencia de los animales en el grupo de combinación de pruebas era mucho mejor que la del grupo de control combinación o grupo de vehículos (
P Hotel & lt; 0,05). se muestran imágenes representativas y gráfico.
afecta el tratamiento individual o combinación de los niveles de marcador tumoral CA125
Al final de los experimentos, el cambio en los niveles medios de CA125 sola Mab C595 en LD no fue significativamente diferente en comparación con Mab IgG
3 de control, mientras que el cambio en los niveles medios de CA125 para un solo CA125 en HD o solo DTX era obviamente diferente en comparación con Mab IgG
3 o HPMC de control, respectivamente (
P
& lt;. 0,05) (Fig 2C). Es evidente que el grupo de prueba combinación tenía niveles de CA125 significativamente inhibidos en comparación con el grupo de control de combinación (
P
& lt; 0,05) o el grupo de control del vehículo (
P
& lt; 0,01) (Fig. 3C). En la eutanasia, los valores de los vehículos CA125 fueron 68.000 ± 12.000 Ku /L, en comparación con la prueba combinada y el control combinación de 14030 ± 5022 kU /L y 28 306 ± 11 403 kU /L, respectivamente. La reducción en los niveles de CA125 de fluido ascitis libres de células es consistente con la reducción en el volumen de ascitis y el peso del tumor.
alteraciones histológicas en xenoinjertos de tumores después del tratamiento de combinación
Para comparar la histología de cada grupo, 5C.