Extracto
adenocarcinoma ductal pancreático se caracteriza por una extensa invasión local del tumor, metástasis y principios diseminación sistémica. La gran mayoría de cáncer de páncreas (PACA) pacientes ya tienen complicaciones metastásicas en el momento del diagnóstico, y la tasa de mortalidad de este tipo letal de cáncer ha aumentado en las últimas décadas. Por lo tanto, los esfuerzos en la identificación de nuevos blancos moleculares terapias dirigidas son las prioridades. Estudios recientes han sugerido que la serotonina (5-HT) contribuye al crecimiento de tumores en una variedad de cánceres incluyendo el de próstata, colon, vejiga y cáncer de hígado. Sin embargo, hay una falta de evidencia sobre el impacto de los receptores 5-HT en la promoción de cáncer de páncreas. Habiendo examinado el papel de los receptores 5-HT-1, especialmente de 5-HT
1B y 5-HT
subtipos 1D en diferentes tipos de tumores malignos, el objetivo de este estudio fue investigar el papel de la 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D en el crecimiento y la progresión PaCa y analizar su potencial como dianas citotóxicos. Encontramos que desmontables de 5-HT
1B y 5-HT
1D expresión de receptores, utilizando pequeños ARN específico de interferencia (siRNA), inducida por la inhibición significativa de la proliferación de las células y clonogenicidad PACA. Además, se suprimió significativamente células Paca invasión y reduce la actividad de uPAR /MMP-2 de señalización y señalización de integrina /mediada por Src Fak /, como vías de células tumorales integrales asociados con la invasión, la migración, adhesión y proliferación. Por otra parte, la orientación 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores regula a la baja ZEB1 dedo de zinc y proteínas del caracol, los factores de transcripción que regulan características transición epitelio-mesenquimal (EMT), concomitantemente con un máximo de regulación de claudin- 1 y e-cadherina. En conclusión, nuestros datos sugieren que el 5-HT
1B y 5-HT
señalización mediada 1D juegan un papel importante en la regulación del fenotipo proliferativo e invasivo de PACA. También destaca el potencial terapéutico de la focalización de 5-HT
receptores 1B /1D en el tratamiento de la PACA, y se abre una nueva vía para la identificación de biomarcadores y dianas terapéuticas nuevas y valiosas para la gestión de cáncer de páncreas.
cita: Gurbuz N, Ashour AA, Alpay SN, Ozpolat B (2014) baja regulación de la 5-HT
1B y 5-HT
1D Receptores inhibe la proliferación, clonogenicidad e invasión de células de cáncer pancreático humano. PLoS ONE 9 (8): e105245. doi: 10.1371 /journal.pone.0105245
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Marzo, 2014; Aceptado: 21 de julio de 2014; Publicado: 29 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Gurbuz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Centro de Texas para el cáncer Nanomedicina (TCCN), (NCI) Centro del Instituto Nacional del Cáncer de Nanotecnología (454CA151668), y de siRNA proyecto del Centro, MD Anderson Cancer Center, UT, Houston, Texas, EE.UU.. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas (PACA), que tiene una capacidad invasiva fuerte con la metástasis y la recurrencia frecuente, es conocido por ser uno de los cánceres humanos más letales con & lt; 5% de tasa de supervivencia a 5 años [1]. Aunque sólo ocupa el décimo lugar en la incidencia entre los cánceres humanos más comunes, PACA es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los países occidentales y su tasa de mortalidad no ha disminuido en las últimas décadas [2], [3]. En general, la mortalidad Paca es aproximadamente el 100%, ya que generalmente se detecta en las etapas de avance, ya que por lo general no causa síntomas en las etapas anteriores [4]. PaCa es intrínsecamente resistentes a la apoptosis y mal responde a la terapéutica existentes, incluyendo la combinación regímenes quimioterapéuticos [5]. Para superar este problema de salud mundial, las investigaciones se centran en la identificación de nuevas dianas moleculares para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento.
El neurotransmisor mitogénica, la serotonina (5-HT) se conocía anteriormente a actúa como un factor de crecimiento [ ,,,0],6] para varios tipos de células no tumorales (por ejemplo vascular células musculares lisas, fibroblastos de pulmón y células mesangiales renales) [7], [8], y las células tumorales (por ejemplo, células cancerosas pancreáticas, células de carcinoma de pulmón de células pequeñas y carcinoma colorrectal) [9], [10], [11]. Recientemente, 5-HT se ha convertido en un importante regulador de la proliferación celular y el crecimiento tumoral en una variedad de tipos de cáncer [12], [13], [14], [15]. Durante la progresión tumoral, la tirosina hidroxilasa, la enzima limitante de la velocidad en la ruta de biosíntesis de la serotonina, es a menudo hasta reguladas [16]. Es importante destacar que los diferentes receptores de 5-HT se han identificado (5-HT-1-7) en base a sus características estructurales, funcionales y farmacológicas [17], [18]. Seis de las familias de los receptores 5-HT están acoplados a la proteína G, incluyendo Gi: 5-HT-1, G: 5-HT-4,6,7, y Gq /11: 5-HT-2,5. Sólo el 5-HT-3 es de forma exclusiva un canal catiónico regulado por ligando, relacionada con el receptor nicotínico de la acetilcolina [16]. receptores 5-HT se dividen en diferentes subtipos, por ejemplo, 5-HT-1 familia tiene cinco subtipos [18], que comprende la 5-HT-1A, 1B, 1D, -1E y -1f receptores y parejas preferentemente a Gi /o para inhibir la formación de AMPc [19], [20 ]. En particular, el ser humano 5-HT
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receptores 1D son especialmente similares en secuencia a pesar de ser codificada por dos genes distintos. La función precisa de estos receptores permanece indefinida, y el progreso hacia este se ha visto obstaculizada por la falta de ligandos selectivos [21]. Se indicó anteriormente que los receptores 5-HT-1 se expresan ampliamente en el cáncer de mama humano [22], el cáncer de próstata [23] y las células del cáncer de vejiga [18], lo que podría explicar los efectos mitogénicos de los agonistas de estos receptores en tales cánceres. investigación sobre el cáncer de páncreas se ha centrado principalmente en el estudio de mutaciones de genes y vías de transducción de señales en el adenocarcinoma ductal pancreático células (PDAC), mientras que el papel potencial de los receptores de neurotransmisores en el desarrollo y progresión de esta enfermedad neoplásica mortal se ha ignorado en gran medida [4]. Teniendo en cuenta la posible participación de 5-HT-1 receptores de señalización a la proliferación de varios tipos de cáncer, con consecuencias desconocidas de estos receptores en la progresión de la Paca, investigamos aquí el papel de la 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D en la proliferación y el fenotipo invasivo de PACA.
invasión local puede ser considerada como un paso inicial y esencial en la malignidad de los carcinomas, que conduce a la generación de metástasis a distancia generalmente fatal. Para que las células cancerosas invaden tejidos distantes, que tienen que penetrar circundante matrices extracelulares. Tales interacciones de células de cáncer /ECM se ven facilitadas por la familia de las integrinas de moléculas de adhesión celular incluyendo sustratos de tirosina fosforilada (la Src tirosina quinasa y la quinasa de adhesión focal) [24]. Las integrinas son alfa receptores heterodiméricos trans-membranosas /beta que median las interacciones célula-célula y la fijación de células a la matriz extracelular (ECM) [25], y que sirven como receptores para algunas proteínas ECM (por ejemplo, fibronectina, vitronectina, laminina y colágeno) [ ,,,0],26]. la actividad de la integrina alterado o afinidad por el sustrato pueden contribuir al fenotipo neoplásico. Normalmente, Src celular se mantiene en un estado inactivo, pero en varios tipos de cáncer, eventos anormales conducen a la actividad de quinasa elevada de la proteína y provocan respuestas celulares pleiotrópicos que inducen la transformación y metástasis [27].
Como carcinomas progresan, los tumores pueden perder la morfología del epitelio y adquirir características mesenquimales que contribuyen al potencial metastásico. Una transición epitelial a mesenquimal (EMT), un proceso crítico similar al proceso del desarrollo embrionario, se cree que es un mecanismo importante para la promoción de la invasión del cáncer y la metástasis [28]. En los últimos años, la familia de factores de transcripción ZEB dedos de cinc se ha documentado ya que los jugadores esenciales de EMT [29]. La proteína de adhesión epitelial, E-cadherina, es un supresor activo de la invasión y crecimiento de muchos cánceres epiteliales, y su baja regulación se considera una característica de la EMT [30], [31]. E-cadherina es un importante gen diana de los represores transcripcionales de la familia ZEB. EMT mediadores que inducen, como TCF8, desencadenan desdiferenciación epitelial por alterar la expresión /función de E-cadherina [32]. Los represores E-cadherina pueden regular los programas de desarrollo de la transcripción de la EMT en las células tumorales que les predisponen a la invasión y la metástasis [33]. Por lo tanto, las mutaciones en los genes que codifican ZEB vinculan estos factores a la progresión del tumor maligno [29].
El actual estudio se centró en investigar el papel de la 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores de Paca y la proliferación invasión. Nuestros datos demuestran reducciones significativas en Paca crecimiento celular, invasión y correlaciona la señalización aguas abajo en respuesta a la baja regulación de estos receptores de serotonina expresiones, lo que sugiere la participación significativa de estos receptores en la promoción de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, condiciones de cultivo y reactivos
Las líneas celulares de cáncer de páncreas humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). células PANC-1 y MIAPaCa-2 se cultivaron en DMEM /F12 suplementado con 10% FBS. Todos los medios contienen penicilina y estreptomicina (100 unidades /ml). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2/95% de aire, y se usaron entre los pasos 4 y 15. Las células humanas de páncreas conducto epiteliales (HPDE) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Kapil Mehta, Departamento de terapéutica experimental, MD Anderson Cancer Center, como un regalo generoso. las células se mantuvieron en HPDE queratinocitos medio libre de suero (SFM de queratinocitos-, 1X) que contiene L-glutamina, y se suplementó con precalificada humana recombinante Factor de Crecimiento Epidérmico 1-53 (EGF 1-53) y 25 mg /500 ml bovina Pituitaria extracto ( BPE) (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA). NF-kappa B inhibidor de la activación II, JSH-23 (4-metil-N
1- (3-fenilpropil) benceno-1,2-diamina) (EMD Millipore Billerica, MA), se disolvió en DMSO a una madre final concentración de 10 mM, y directamente añadido a cultivos de células en 25 y 50 mM concentraciones, que bloquea selectivamente la translocación nuclear de NF-kB su actividad de transcripción p-65 y.
Las transfecciones con siRNA
que crecen exponencialmente células PANC-1 y MIAPaCa-2 no tratadas se sembraron 24 h antes de la transfección. células cultivadas en placas fueron transfectadas con ARNsi bicatenario de orientación del ARNm de los receptores serotoninérgicos (5-HT-1) subtipo -B o -D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), o transfectadas con control (no silenciamiento) siRNA; (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') [34], [35] (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). siRNA dirigidos a la transglutaminasa tisular (TG2) (Qiagen, Valencia, CA) se emplearon también [35]. Las células fueron transfectadas con cualquiera de siRNA, a una concentración final de 25 a 50 nM durante 72 h, utilizando HiPerFect reactivo de transfección (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las concentraciones de siRNAs fueron elegidos en base a los estudios de dosis-respuesta. células siRNA transfectadas de control para no silenciamiento se utilizaron como controles negativos. Después del tratamiento, se recogieron las células /procesada para su posterior análisis y ensayos.
viabilidad celular y los ensayos de proliferación /crecimiento
La viabilidad y /o la proliferación de las células se detectaron mediante el ensayo de MTS (Promega, Madison, WI, EE.UU.), después del tratamiento las células, para medir el crecimiento celular. Las células se contaron usando un hemocitómetro y las células viables se identificaron por exclusión de azul de tripano. Las células viables se sembraron en placas de 96 pocillos (1,5 x 10
3 células /pocillo), y se transfectaron con ARNsi indicados. Después de 72 h de tratamiento, una solución que contiene MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxi-metoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio) y PMS ( metosulfato de fenazina) (20:01 v v) se añadió /a las células. Después de 2-3 h de incubación a 37 ° C, las células en crecimiento viables se estimaron mediante el control de la absorción del producto a 490 nm, basado en la generación de formazan a través de células vivas. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se presentan como media ± desviación de la absorción estándar.
supervivencia Clonigénicas ensayo de células
Paca se sembraron en placas de 6 pocillos (1,5 x 10
3 células /pocillo), transfectadas con el control no silenciar siRNA, o siRNA contra 5-HT
1B o 5-HT
1D (una vez /semana), y se cultivaron durante 2 semanas. Las colonias formadas se tiñeron con cristal violeta y las regiones de distribución de colonias del área de forma densitométrica se midieron [36]. Cada experimento se realizó por triplicado y los resultados se presentan como media ± desviación de la absorción estándar.
Matrigel invasión de ensayo
Paca células fueron transfectadas con 50 nM de ARNsi indicados, y 72 horas más tarde, igual número de células viables tratadas (4 × 10
4 células), se sembraron en cultivos polarizados cubiertos con Matrigel (con filtros 8- micras de tamaño de poro) en cámaras de invasión de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). El número de células que invadió el lado inferior de la membrana después de 24 h se determinó contando las células en un mínimo de cuatro áreas seleccionadas al azar. Los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se presentan como media de los porcentajes de la invasión ± desviación estándar.
Migración de ensayo
in vitro En-
Se usó un ensayo de cicatrización de heridas para evaluar la motilidad celular y la capacidad de migrar. células PANC-1 se sembraron en placas de 6 pocillos (5 × 10
5 células /pocillo), y se cultivaron en medio que contiene 10% de FBS para conseguir una monocapa de células casi confluentes. A cero fue cuidadosamente realizada sobre la capa de células usando una punta de micropipeta estéril de 10 l, y cualquier desecho celular se eliminó mediante lavado con PBS para eliminar las células flotantes. Las monocapas heridos fueron transfectadas con 50 nM de siRNAs indicados. Inmediatamente después de los tratamientos, las células se fotografiaron usando un microscopio de contraste de fase (Nikon), para determinar el ancho de la herida en el tiempo 0. Se continuaron los cultivos, y las células se fotografiaron de nuevo después de 12 h y después de 24 h de herir la célula capa. La cicatrización de la herida se visualizó mediante la comparación de las fotografías tomadas a las 0 h con las tomadas a las 12 h y 24 h más tarde, y se analizaron para la distancia migrada por el borde delantero de la herida en cada momento. La distancia recorrida por las células se determinó mediante la medición de la anchura de la herida en el tiempo de 12 h y 24 h, y restarlo de la anchura de la herida en el tiempo 0. Los valores obtenidos se han expresado como la migración%, ajuste de la anchura del hueco en 0 h como 100%. Tres experimentos se realizaron por triplicado.
Análisis de transferencia Western
Las células fueron sembradas en 25 cm
2 frascos de cultivo (0,5 × 10
6 células /frasco). Después de los tratamientos, las células se recogieron, se centrifugaron, se lavaron dos veces en PBS enfriado con hielo y de células enteras lisados se obtuvieron mediante la suspensión de las células en un tampón de lisis a 4 ° C. Los lisados se centrifugaron a 13.000 g durante 10 min a 4 ° C, y se recogieron las fracciones de sobrenadante. La concentración total de proteína para cada muestra se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas compatible detergente (Bio-Rad, Hercules, CA), y la transferencia Western se realizó como se 40 g de proteína /carril en 4-15% de gel de SDS-PAGE. Las proteínas se electro-transfirieron a membranas de PVDF y se incubaron primero con los siguientes anticuerpos primarios; p-Src (Tyr-416), Src, la integrina β1, uPAR, MMP-2, Caracol, TCF8 /ZEB1, NF-kappa B (p-105 /P-50), y Claudín-1 (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MAMÁ); p-FAK (Tyr-397), FAK (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ); 5-HT
1B (Sigma Chemical, St. Louis, MO); TG2 y α-SMA (Abcam, Cambridge, MA); La fibronectina y 5-HT
1D (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y luego con peroxidasa de rábano conjugada anti-conejo o anti-ratón anticuerpo secundario (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). β-actina (Sigma Chemical, St. Louis, MO), o α-β-tubulina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) se utilizaron como controles de carga. Todos los anticuerpos se diluyeron en TBS-Tween 20 que contenía leche en polvo al 5%. detección quimioluminiscente se realizó con reactivos de detección Chemi-brillo (Alpha Innotech, San Leandro, CA), y las manchas se visualizaron con una cámara FluorChem 8900, y se cuantifica mediante un densitómetro usando el programa de análisis de imágenes (software de procesamiento de ImageJ 1.48s, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE.UU.). Todos los experimentos se repitieron al menos dos veces de forma independiente.
Reverse arrays de proteínas de fase (RPPA)
Las células PANC-1 siRNA-transfectadas (0,5 × 10
6 células /ml de medio 2) se sembraron en placa de 6 pocillos. Después de 72 h de incubación, las células se lavaron dos veces con PBS, y 150 l de tampón de lisis [1% de Triton X-100, 50 mM Hepes (pH 7,4), NaCl 150 mM, MgCl 1,5 mM
2, mM EGTA 1 , 100 mM NaF, 10 mM de césped. pirofosfato, mM Na 1
3Vo
4 y 10% de glicerol, se añadieron que contienen inhibidores de proteinasas y de fosfatasa (Roche Applied Science, Indianapolis)] a cada pocillo. Se recogieron los lisados celulares, y RPPA se procesaron como se ha descrito antes [35].
aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa (RT-PCR) análisis
ARN total fue aislado de la células recogidas con el reactivo TRIzol (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA), y el ADNc se obtuvo de 1 g de ARN total usando RevertAid Primera Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). El ADNc para 5-HT
1B, 5-HT
1D, la integrina β1, TG2 y GAPDH se amplificaron utilizando el kit Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen /Life Technologies), con cebadores específicos. Brevemente, 2 l del total de 20 l de producto de transcripción inversa se utilizaron para la PCR en 1 x tampón de PCR que contenía 1,5 mM de MgCl
2, 200 trifosfatos M desoxinucleótidos (dNTPs), 1 unidad de Taq Platinum polimerasa y 0,2 M cada uno de los cebadores indicados (Integrated DNA Technologies, IDT), o cebadores GAPDH-específica (Thermo Scientific). Las secuencias de sentido y anti-sentido 5-HT
1B cebadores son 5'-TGCTGGTTATGCTATTGGCG-3 '; y 5'-GATGACACAGAGGTGCAGGATG-3 ', respectivamente. Las secuencias de sentido y anti-sentido 5-HT
cebadores 1D son 5'-TGCCGTGGTCCTTTCCGTC-3 '; y 5'-GGTGATGGTATAGGCGATGCTG-3 ', respectivamente. Las secuencias de sentido y anti-sentido ß1 cebadores de integrina son 5'-CCTACTTCTGCACGATGTGATG-3 '; y 5'-CCTTTGCTACGGTTGGTTACATT-3 ', respectivamente. Las secuencias de los sentido y anti-sentido primers TG2 son 5'-TAAGAGATGCTGTGGAGGAG-3 '; y 5'-CGAGCCCTGGTAGATAAA-3 ', respectivamente. Las muestras de ADNc se incubaron a 94 ° C (2-5 min.) Para desnaturalizar la plantilla y activar la enzima. Este paso fue seguido de 35 ciclos de amplificación por PCR (como 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 60 s con 5-HT
1B cebador; 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 60 s con imprimación TG2; 94 ° C durante 30 s, 58ºC durante 45 s y 72 ° C durante 60 s con 5-HT
1D y beta 1 integrina cebadores, en cada ciclo). La reacción de PCR se terminó con una etapa de extensión final de 5 min. a 72 ° C. Los productos de reacción amplificados se analizaron en un gel de agarosa al 1,2% que contenía bromuro de etidio. La síntesis de ADNc se verificó mediante la detección de la transcripción GAPDH, que se utilizó como control interno.
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, y la estadística el análisis se realizó a través de Student
t-test
, para determinar la significación estadística. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos y se señalan con un asterisco.
Resultados
5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D se sobreexpresa en el cáncer de páncreas células
Aumento de la capacidad de biosíntesis de 5-hidroxitriptamina, así como alteraciones severas en los patrones de expresión de los receptores de 5-HT, se ha informado anteriormente durante la progresión del cáncer de mama [16]. Aquí, se evaluó la expresión de 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D en diferentes células Paca, así como en las células normales conducto pancreático humano epiteliales (HPDE). Se encontró que estos receptores están regulados en todas las células Paca ensayadas, en comparación con su baja expresión en epitelio normal de páncreas (fig. 1A), lo que sugiere que la disfunción regulación de estos receptores podría promover la señalización de la progresión del tumor favor en las células Paca.
(a) 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores son altamente expresado en varias líneas celulares de cáncer de páncreas. Los lisados celulares de varias líneas celulares de PACA y las células normales conducto pancreático humano epiteliales (HPDE) se sometieron a análisis de transferencia Western como se indica. β-actina se utilizó como control de carga. (B-C) 5-HT
1B y 5-HT
1D de receptores niveles de expresión en PANC-1 (B) y MIAPaCa-2 células (C) después de la precipitación de la expresión receptores con sus siRNAs correspondientes. Las células fueron transfectadas con 50 nM de siRNAs indicados, y 72 h más tarde, los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western. ß-actina se utilizó como control de carga. Los histogramas muestran la cuantificación relativa de los niveles de las proteínas indicadas. (D-E) la expresión de ARNm de 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D en PANC-1 (D) y MIAPaCa-2 células (E) después de la caída de la expresión receptores con sus siRNAs correspondientes. Las células fueron transfectadas con 50 nM de siRNAs indicados, y 72 h más tarde, se extrajo el ARN total y los niveles de transcripción de 5-HT
1B y 5-HT
1D se determinaron por la norma RT-PCR como se describe en Materiales y métodos. GAPDH se utilizó como control de carga. mediada por siRNA (F-G) 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores desmontables inhibe la proliferación de células Paca. PANC-1 (F) y MIAPaCa-2 células (G) fueron transfectadas con 50 nM de siRNAs se indica, y después de 72 h, la proliferación se detectó mediante un ensayo MTS. Los datos se representan como media ± DE. * P & lt; 0,05 frente a las células de control. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente en tres ocasiones.
Desmontables de 5-HT
1B y 5-HT
1D expresión de receptores inhibe la proliferación /viabilidad de las células Paca
tuvo como objetivo investigar la implicación de estos receptores en la proliferación y el crecimiento de las células PACA. Con este fin, derribaron la expresión de cada subtipo de receptor en PANC-1 y MIAPaCa-2 células, utilizando pequeños ARN de interferencia específico (siRNA). A pesar de ser codificada por dos genes distintos, el ser humano 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D son especialmente similares en la secuencia [21]. Por lo tanto, como se muestra en la Figura 1B y C, 5-HT
tratamientos 1B siRNA condujo a una expresión relativamente baja de 5-HT nivel
proteína 1D, con una similar inferiores 5-HT
niveles de proteína 1B inducidas por la 5-HT
1D siRNA. Esto podría atribuirse al hecho de que tanto la 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D subtipos compartir una identidad de secuencia de ácido amino alta (~68% de homología de secuencia de aminoácidos), tienen propiedades de unión de ligandos similares y están farmacológicamente casi indistinguibles [37]. interacciones inducidas por similitudes Tales entre los dos tipos de receptores en el nivel de proteínas podrían produjeron después de la expresión génica (por ejemplo, durante la maduración de la proteína o plegable). Por lo tanto, la detección de la expresión de la proteína receptores mediante transferencia Western no era completamente suficiente para distinguir estos subtipos de receptores estrechamente relacionados para establecer su respectiva relevancia fisiológica. Para superar tal problema, a fin de investigar los efectos biológicos de la orientación de cada subtipo de forma individual, se utilizó el análisis de RT-PCR y examinó el efecto de los tratamientos de siRNA en los niveles de transcripción del gen correspondiente subtipo. Nuestros resultados muestran claramente que el 5-HT
1B siRNA específico y 5-HT
1D siRNA específicos se confirmaron para inhibir la expresión del ARNm correspondiente sin ningún efecto significativo en el otro subtipo cruz análogo tanto en PANC-1 y líneas MIAPaCa-2 de células (Fig. 1D y e). A continuación analizaron la proliferación después de 72 h de tratamiento siRNA de ensayo MTS. Como se muestra en la figura 1F y G, nuestros resultados demostraron que desmontables de 5-HT
1B y 5-HT
expresión 1D inhibió significativamente la proliferación tanto de las células PANC-1 y MIAPaCa-2. La baja regulación combinada de 5-HT
1B y 5-HT
subtipos 1D perjudica la proliferación más baja regulación de cualquier receptor sola (Figura S1), lo que sugiere los beneficios biológicos suministrados desde simultánea dirigida tanto a los receptores.
Orientación de 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores inhibe clonogenicidad celular de las células Paca
a fin de verificar el papel de la 5-HT-1-receptores serotoninérgicos en Paca la proliferación celular y la formación de colonias, se evaluó la capacidad clonogénico de células Paca siguiente knock-down de 5-HT
1B y 5-HT
1D expresión de receptores. Este ensayo es un
in-vitro
ensayo de supervivencia de células basado en la capacidad de una sola célula para crecer y formar focos en una colonia [36]. Desmontables de 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D, usando sus siRNAs específicas, notablemente inhibe la capacidad de PANC-1 y MIAPaCa-2 células para formar colonias (Fig. 2A y B, respectivamente). En general, estos hallazgos sugieren que 5-HT
1B y 5-HT
señalización mediada 1D está implicada en la proliferación y la capacidad de clonogénico de células Paca.
PANC-1 (A) y MIAPaCa-2 células (B) se transfectaron (una vez /semana) con siRNAs indicados. Las células se incubaron durante 14 días, las colonias se tiñeron con cristal violeta y las regiones de distribución de colonias de área se midieron densitométricamente al final de los 14 días. Los histogramas muestran los porcentajes de las colonias formadas después de 14 días de la primera transfección. Los datos se expresan como la media de los porcentajes de formación de colonias ± SD de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 frente a células control
Orientación de 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores deteriora la invasión celular /migración de las células Paca
pancreático adenocarcinoma ductal se caracteriza por fenotipo altamente invasiva y fuerte capacidad metastásica [38]. Debido a que la expresión de 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D es elevada en las células Paca, se evaluó si estos receptores están implicados en la promoción de tales fenotipo invasivo. Por lo tanto, derribaron estos receptores en las células PANC-1 y la 2-MIAPaCa de siRNAs y evaluamos los cambios en su capacidad invasiva por
in vitro ensayo de invasión
utilizando cámaras de Boyden recubiertas con Matrigel. Este ensayo imita la
in vivo
proceso de invasión y mide el número de células de cáncer que pasan a través de una matriz de la membrana basal hacia medios que contienen quimioatrayentes [39]. El hallazgo más sorprendente fue que desmontables de 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D redujo significativamente la invasión de las células PANC-1 por aproximadamente el 76% y 66%, respectivamente (Fig. 3A), y redujo la invasión de MIAPaCa-2 células en aproximadamente 75% y 71%, respectivamente (Fig. 3B). A continuación examinó la implicación de 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D en la mediación de PANC-1 motilidad celular usando el ensayo de cero a las 12 h y 24 h puntos de tiempo. El análisis reveló que la distancia cubierta por células que migran se redujo significativamente cuando las células transfectadas con 5-HT
1B o 5-HT
receptores 1D siRNAs en comparación con las células expuestas a la silenciación no ARNsi de control (Fig. 3C ). Estos resultados demuestran una correlación entre el comportamiento de la movilidad de células Paca y 5-HT
expresión /1D 1B. En general, estos datos indican que el 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D jugar un papel en la mediación de PaCa células migración y la invasión.
Panc-1 células (A) y MIAPaCa-2 las células (B) se transfectaron con 50 nM de siRNAs indicados (para 72 h), y el mismo número de células viables se sembraron sobre filtros Transwell recubiertas con Matrigel en las cámaras de invasión de Matrigel. El número de las células que invadió después de 24 h se determinó como en el protocolo. Magnificación, 100 ×. Los histogramas muestran la media de los porcentajes de la invasión ± SD de tres experimentos. * P & lt; 0,05 frente a las células de control. (C) La participación de 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores en la regulación de la PANC-1 motilidad celular analizados por el ensayo de cicatrización de heridas. Un único cero se hizo en el centro de la monocapa de células confluentes, y las monocapas heridos fueron transfectadas con siRNAs indicados. La reparación de heridas se controló durante 24 h y se visualizó al microscopio con aumento original × 100. Las imágenes fueron tomadas inmediatamente (0 h), y después de 12 h y 24 h de rayar las culturas. El histograma muestra los porcentajes de la migración de células, y los datos se expresan como media de los porcentajes de migración ± SD de tres experimentos independientes. * Representa una diferencia significativa entre los grupos indicados (P & lt; 0,05).
5-HT
1B y 5-HT
1D receptores están implicados en la regulación de la integrina β1 expresión en células Paca
Después de encontrar que el 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D están sobreexpresados en las células Paca, sugerente de alteraciones significativas de crecimiento de la promoción de señalización corriente abajo, el próximo investigado algunos efectos moleculares aguas abajo de desmontables de estos receptores. La familia de las integrinas de los receptores de trans-membrana une la matriz extracelular (ECM) al citoesqueleto de actina intracelular en los puntos de interacción adhesiones focales. Además de este papel estructural, la agrupación de integrinas puede iniciar eventos de señalización intracelulares que promueven la proliferación celular, la supervivencia y la migración en ambos contextos de células normales y tumorigénicos [40]. De familia de las integrinas, β1-subtipo se sabe que inducen la actividad de FAK y Src mediante el reclutamiento y la activación de Src /FAK quinasa dual complejo [41]. Porque, baja regulación de la 5-HT
receptores 1B /1D suprime las células Paca la migración /invasión (Fig. 3), se examinó si estos receptores regulan la expresión de la integrina β1. Empleamos Western blot y análisis de RT-PCR para determinar la expresión de la proteína integrina β1 y los niveles de ARNm, respectivamente, después de silenciamiento de estos receptores. Se encontró que el 5-HT
1B y 5-HT
receptores 1D caída inducir significativamente baja regulación de β1 expresión de la integrina en proteínas y nivel de ARNm en las células PANC-1 y MIAPaCa-2 (Fig. 4A y B).
(a-B) El efecto de los siRNA mediada por 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores de baja regulación de la integrina β1 /aguas abajo de señalización mediada por ECM en PANC -1 (A) y MIAPaCa-2 células (B). (Panel superior) Las células fueron transfectadas con 50 nM de siRNAs indicados, y después de 72 h, se extrajo el ARN total y los niveles de transcripción de 5-HT
1B y 5-HT
1D se determinaron por la norma RT- PCR como se describe en Materiales y Métodos. GAPDH se utilizó como control de carga. (Panel inferior) Las células fueron transfectadas con 50 nM de siRNAs se indica, y después de 72 h, los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western. ß-actina se utilizó como control de carga. (C-D) El efecto de 5-HT
1B y 5-HT
1D receptores de baja regulación en el proceso de EMT en PANC-1 (C) y MIAPaCa-2 células (D). ß-actina se utilizó como control de carga. Tubulina se utilizó como control de carga.