Extracto
contactodesde-1 se ha demostrado para promover la metástasis del cáncer. Sin embargo, los mecanismos subyacentes no están claros. Presentamos aquí que desmontables de contactina-1 en células de cáncer de pulmón A549 reducción de la invasión de células A549 y la capacidad de la célula para crecer en agar blando sin afectar a la proliferación celular. Reducción de contactina-1 resultó en la regulación positiva de la E-cadherina, en consonancia con E-cadherina es inhibidor de la invasión de las células cancerosas. En un esfuerzo por investigar los mecanismos por los que contactina-1 reduce la expresión de E-cadherina, se observó que contactina-1 juega un papel en la activación de AKT, como desmontables de contactina-1 de activación de AKT atenuada. Además, la inhibición de la activación de AKT mejora de forma significativa la expresión de E-cadherina, una observación que imita la situación observada en contactina-1 desmontables, lo que sugiere que la activación de AKT desempeña un papel en la regulación negativa mediada por contactina-1 de E-cadherina. Además, hemos sido capaces de demostrar que desmontables de contactina-1 no redujo aún más la capacidad de invasión de las células A549, cuando la activación de AKT fue inhibida por un inhibidor de AKT. Para apoyar aún más nuestros resultados, overexpressed Cntn-1 en dos líneas celulares de cáncer Cntn-1 nulo de mama que expresan E-cadherina. Tras la sobreexpresión, Cntn-1 reduce los niveles de E-cadherina en una línea celular y el aumento de la activación de AKT en la otra. Por otra parte, en nuestro estudio de 63 cánceres primarios de pulmón, se observó un 65% de los cánceres de pulmón primario que es contactina-1 positivo y en estos carcinomas, el 61% eran de E-cadherina negativo. En conjunto, aportar pruebas de que contactina-1 juega un papel en la regulación a la baja de E-cadherina en el cáncer de pulmón y que la activación de AKT contribuye a este proceso. En un estudio de los mecanismos responsables de la contactina-1 para activar AKT, hemos demostrado que desmontables de Cntn-1 en las células A549 no aumentar la expresión de PTEN pero upregulated PHLPP2, una fosfatasa que desfosforila AKT. Por tanto, estas observaciones sugieren que la contactina-1 mejora la activación de AKT en parte mediante la prevención de PHLPP2 mediada por AKT dephosphrorylation
Visto:. Yan J, Wong N, Hung C, Chen WX-Y, Tang D (2013) Contactin- 1 reduce la expresión de E-cadherina Via La activación de AKT en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (5): e65463. doi: 10.1371 /journal.pone.0065463
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 29 de octubre de 2012; Aceptado: April 26, 2013; Publicado: 28 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Yan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación contó con el apoyo del cáncer de próstata Canadá a D. Tang. Los autores también desea reconocer el apoyo financiero de la asistencia sanitaria de San José en Hamilton, Ontario, Canadá, para el Centro de Hamilton para la Investigación Renal (HCKR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La proteína de adhesión celular neural contactina-1 (Cntn-1) consta de seis dominios Ig, cuatro motivos de fibronectina similares, y un glicosilfosfatidilinositol (GPI) -moiety [1]. El resto GPI ancla Cntn-1 a la superficie de la membrana externa de las neuronas centrales y periféricas [2], [3]. Cntn-1 juega un papel en la extensión de axones y formación de uniones septadas-como entre axones y myelinating células gliales [4] - [6], Además, Cntn-1 actúa como un ligando para el receptor de Notch en el cerebro que resulta en oligodendrocitos maduración [7]. De acuerdo con estas observaciones in vitro, en estudios in vivo revelan un papel crítico de Cntn-1 en la formación de guiado de los axones y sinapsis [8] - [10]. Desmontables de Cntn-1 en
Xenopus
embroys dio lugar a la desorientación y la defasciculation de los axones del nervio trigémino [11]. Considerando que, en ratones deficientes en Cntn-1 mueren en pocas semanas debido a la ataxia severa [4], [8].
A pesar de la pérdida de la función Cntn-1, como resultado de la eliminación de genes o mutaciones espontáneas en
Cntn-1 |, afecta a los sistemas nerviosos central y periférico, pero no las uniones neuromusculares (NMJs) en ratones [8], [12], las mutaciones en el
Cntn-1 | gen ha sido implicados a deteriorar la función NMJs en los seres humanos [13]. Una mutación que resulta en la introducción de un codón de parada prematuro en el tercer dominio Ig se asoció con una forma familiar de miopatía congénita letal en los seres humanos [13]. A pesar de la acumulación de la investigación sobre la función Cntn-1, se sabe poco acerca de su función fuera del sistema nervioso. A pesar de que los análisis de transferencia Northern de páncreas, pulmón, riñón y músculo esquelético reveló solamente niveles bajos de Cntn-1 transcripciones [14], su función en estos tejidos y la expresión en otros tejidos aún no se ha determinado. Sólo recientemente han habido informes de Cntn-1 de expresión en las enfermedades fuera del sistema nervioso, especialmente con su implicación en el cáncer. Cntn-1 se detectó en cáncer de pulmón primario y desmontables de Cntn-1 en células de cáncer de pulmón inhibido específicamente sus metástasis, pero no la formación de tumores de xenoinjerto en ratones inmunodeficientes locales [15]. Esto es en parte debido al papel esencial de Cntn-1 en la reorganización del citoesqueleto de actina y las estructuras de adhesión focal [15]. Además, la metástasis mediada por Cntn-1 está regulada por VEGF-C y Cntn-1 mejora unida a GTP de RhoA, que es atribuible a la invasión del cáncer de pulmón promovido-Cntn-1 y la metástasis [15], [16]. pacientes con cáncer de pulmón con altos niveles de Cntn-1 tienen un mal pronóstico [15]. De acuerdo con estos informes, factores que potencia la metástasis del cáncer de pulmón también aumenta Cntn-1 [17]. Además, Cntn-1 ha sido reportado en melanoma [18] y se asocia con la metástasis en el cáncer gástrico, carcinoma de células escamosas oral, y cáncer de esófago [19] - [22].
A pesar de la acumulación de evidencia que soporta un papel de Cntn-1 en la metástasis del cáncer, los mecanismos subyacentes responsables de este proceso sigue siendo poco clara. Para investigar más a fondo la oncogénesis mediada por Cntn-1, hemos derribado Cntn-1 en células de cáncer de pulmón A549. Esto condujo a una regulación al alza de la E-cadherina. En el carcinoma de pulmón primario, altos niveles de Cntn-1 coexistieron con bajos niveles de E-cadherina. Mecánica, Cntn-1 juega un papel en la activación de AKT, que a su vez inhibe la expresión de E-cadherina.
Materiales y Métodos
Líneas celulares, plásmidos y los inhibidores de
El cáncer de pulmón líneas celulares (A549 y H1299), líneas celulares de cáncer de mama (MCF7, BT549, BT474, MDA-MB-453, T47D y ZR751), líneas celulares de cáncer de riñón (A498 y 786-0), una línea celular de cáncer de cuello uterino (HeLa) , una línea celular de glioblastoma (U87) y las células 293T de riñón (293 células epiteliales embrionarias humanas) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A549, BT549, H1299, T47D, BT474, ZR751, MDA-MB-453 y 786-0 células se cultivaron en RPMI 1640 los medios de comunicación. MCF7, células HeLa y 293T se cultivaron en DMEM y las células A498 y U87 se cultivaron en medio MEM. Todos los medios se complementaron con 10% de FBS (Sigma Aldrich, Oakville, ON) y 1% de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Burlington, ON). La identidad de A549 se confirmó por análisis STR llevado a cabo por DDC médico (Fairfield, OH). Cntn-1 shRNA se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) y Cntn-1 isoforma 3 cDNA se adquirió de Abierto Biosystems (Huntsville, AL). El inhibidor de AKT VIII se adquirió de Calbiochem (EMD, Mississauga, ON). promotor de la E-cadherina constructo de luciferasa dirigido fue proporcionado amablemente por el Dr. Antonio García de Herreros, Universitat Pompeu Fabra, España [23].
Desmontables de Cntn-1 |
horquilla shRNA (control /Control y Cntn-1) se expresa por un vector basado shRNA-retroviral (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Desmontables de Cntn-1 se llevó a cabo de acuerdo con nuestras condiciones publicadas [24] - [26]. Brevemente, un vector de expresión de gag-pol, un vector de expresión de rev y un vector de expresión de envoltura (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ON) fueron transitoriamente co-transfectadas con un plásmido retroviral diseñada en células 293T. El medio que contiene el virus se cosechó 48 horas después, se filtró a través de un filtro de 0,45 M, y se centrifugó a 20.000 g durante 120 minutos para concentrar los retrovirus. Se añadió polibreno (10 g /ml, Sigma Aldrich, Oakville, ON) antes de que se seleccionan la infección y las células para la integración estable con puromicina (1 mg /ml, Sigma Aldrich, Oakville, ON).
retroviral sobreexpresión de Cntn-1 |
humano Cntn-1 isoforma 3 ADNc fue comprado (Open Biosystems, Huntsville, aL) y modificado además para generar la longitud completa isoforma 1 de Cntn-1. Los cebadores de PCR se sintetizaron flanquean el fragmento terminal C presente en la isoforma 1 pero que falta en isoforma 3. Se aisló ARN de las células A549 con TRIZOL (Life Technologies, Burlington, ON) y se utiliza como plantilla para RT-PCR. El fragmento de PCR C terminal resultante se ligó en pBluescript KS + y posteriormente cortado en el sitio de restricción para MfeI; un sitio único presente en la isoforma 1 y 3 isoforma, unos cuantos pares de bases cadena arriba antes de que las dos secuencias difieren. El fragmento C terminal se ligó con la isoforma comercialmente adquirida 3. La longitud total isoforma 1 de ADNc para Cntn-1 fue clonado posteriormente en un vector retroviral, pBabe. La confirmación de clones positivos se determinó por secuenciación del ADN. La sobreexpresión de Cntn-1 se llevó a cabo utilizando un gag-pol vector de expresión y un vector que expresa el sobre (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ON). Todas las etapas se llevaron a cabo de la misma manera descrita anteriormente para la caída de Cntn-1. El vector pBabe sin Cntn-1 se utilizó como un control de vector vacío.
Ensayo de proliferación celular
Un total de 1000 células A549 de shCTRL y células shCNTN-1 se sembró en una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C durante 5 días. La proliferación se midió usando el kit de ensayo de proliferación celular WST-1 (Millipore, Mississauga, ON) según las instrucciones del fabricante. Las lecturas de absorbancia se midió con un lector de placas a 420mn.
Invasión de ensayo
Modificado Boyden cámaras fueron adquiridos comercialmente que consiste en inserciones con una membrana de poro de 8 micras recubiertas con Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ON ) colocado en una placa de 24 pocillos. Invasión ensayos se realizaron de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Brevemente, los insertos de Matrigel se les dio 2 horas para rehidratar a 37 ° C antes de su uso en presencia de 0,5 ml de medio. El medio completo (0,5 ml) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) se colocó en la cámara inferior. Un total de 5 × 10
4 células se sembraron en la cámara superior de la pieza de inserción en 0,5 ml de medio libre de suero durante 22 horas. Las células que pasaron a través de las membranas se fijaron y se tiñeron con violeta cristal (0,5%, Sigma Aldrich, Oakville, ON). Porcentaje de células invasivas se calculó dividiendo el número de células que pasan por el tamaño de poro de la membrana de Matrigel 8 micras por el número de células que migran a través de la membrana de control y multiplicando por 100.
independiente de anclaje Ensayo de Crecimiento
shCTRL A549 y células shCNTN A549 se sembraron en pocillos individuales de placas de seis pocillos a una densidad de 10
4 células /pocillo en 2 ml de medio 2X que contiene 0,25% de agarosa. Después de 3 semanas, 5 campos aleatorios por pocillo se examinaron para las colonias y se contaron bajo un microscopio de contraste de fase. área de la colonia media se determinó usando el software Image Pro 5.0. Cada experimento se realizó por triplicado y se repitió tres veces.
análisis de transferencia de Western
Los lisados celulares se prepararon en un tampón que contenía Tris 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, 1 mM EDTA, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, pirofosfato sódico 25 mM, NaF 1, 1 mM β-glicerofosfato, ortovanadato de sodio 0,1 mM, PMSF 1 mM, 2 mg /ml de leupeptina y 10 mg /ml de aprotinina (Sigma Aldrich, Oakville, ON). Un total de 50 g de lisado celular, a menos que se especifique lo contrario, se separó en gel de SDS-PAGE y se transfirieron a Hybond ECL Amersham membranas de nitrocelulosa (Amersham, Baie d'Urfé, QC). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y después se incubaron con los anticuerpos indicados a 4 ° C durante la noche. anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiadas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Se detectaron señales utilizando un Western Blot kit ECL (Amersham, Baie d'Urfé, QC). Los anticuerpos primarios y secundarios y las concentraciones utilizadas fueron: (amp 1:200, I +; D Systems, Minneapolis, MN) anti-Cntn-1; anti-AKT (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-AKT fosforilación Ser473 (1:1000, Señalización Celular, Danvers, MA), anti-GSK3 fosforilación Ser9 (1; 1000, Señalización Celular, Danvers , MA), anti-GSK3 (1:1000, Upstate Biotechnology, Billerica, MA), anti-E-cadherina (1:2500, BD Biosciences, Mississauga, ON), anti-Caracol (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-PHLPP2 (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), anti-GAPDH (1:5000, Señalización celular, Danvers, MA), anti-actina (1:1000, Santa Cruz), anti-cabra (1:3000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-ratón (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ON) y anti-conejo (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ON)
la tinción de inmunofluorescencia
las células fueron tratadas como se define en las leyendas de las figuras. La tinción de inmunofluorescencia se llevó a cabo por las células de fijación con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos y se permeabilizaron con 0,05% de saponina (Sigma Aldrich, Oakville, ON) durante 15 minutos. Anti-Cntn-1 (1:20, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) y anti-E-cadherina (1:200, BD Biosciences, Mississauga, ON) se añadieron a las diapositivas a 4 ° C durante la noche entonces. Después del lavado, los anticuerpos secundarios, FITC o rodamina (TRITC) burro IgG (1:200, Jackson ImmunoResearch Lab, West Grove, PA), se aplicaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El portaobjetos se cubrió posteriormente con medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Laboratories, Burlingam, CA). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Axiovert 200).
luciferasa ensayo
A549 A549 y Ctrl shRNA Cntn-1 en las células shRNA fueron co-transfectadas con pGL3 promotor-E-cadherina constructo de luciferasa (proporcionado amablemente por el Dr. Garcia de Herreros) y el plásmido pCH110-lacZ con Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Burlington, ON). Después de 48 horas, la luciferasa (Promega, Madison, WI) y la actividad β-galactosidasa se determinó. La actividad de luciferasa se normalizó a ß-galactosidasa dividiendo la señal de actividad de la luciferasa con la señal de la actividad β-galactosidasa.
La inmunohistoquímica (IHC)
microarrays de tejidos (TMA) se desliza (LC723, LC10013) que contiene 63 adenocarcinomas de pulmón fueron adquiridos de los Estados Unidos Biomax (Rockville, MD). TMA diapositivas se desparafinaron en xileno, despejado en serie de etanol, y durante 30 minutos en tampón de citrato de sodio (pH = 6,0) en un vapor de los alimentos tratados térmicamente. Los anticuerpos primarios específicos para Cntn-1 (1:50, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) y E-cadherina (1:400, BD Biosciences, Mississauga, ON) se incubaron con las secciones durante la noche a 4 ° C. Los controles negativos se incubaron con un ratón no específica, de cabra o IgG de conejo. Biotinilado secundario IgG y el reactivo Vector ABC (Vector Laboratories, Burlingam, CA) se añadieron posteriormente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los lavados se realizaron con PBS. reacción de cromógeno se llevó a cabo con diaminobenzidina (Vector Laboratories, Burlingam, CA), y contratinción con hematoxilina (Sigma Aldrich, Oakville, ON). TMA diapositivas fueron escaneados utilizando un ScanScope y analizados mediante el software ImageScope (Aperio, Vista, CA). También se examinaron manualmente todos los puntos (núcleos teñidos). . Las puntuaciones obtenidas utilizando el software Imagescope se convirtieron a un HSCORE usando la fórmula [(HSCORE =% X positivo (intensidad + 1)] [27], [28] Las puntuaciones fueron asignados a una escala de 0 a 3 (0 - negativo o tinción de fondo, 1 - tinción débil, 2 - tinción modesta, 3 -. tinción fuerte)
PCR en tiempo real análisis
El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Life Technologies, Burlington, ON). la transcripción inversa se realizó usando superíndice III (Life Technologies, Burlington, ON) según las instrucciones del fabricante. en resumen, 2 g de ARN se convirtió en ADNc a 65 ° C durante 6 minutos, seguido de 2 minutos de incubación en hielo, 25 ° C durante 11 minutos, 50 ° C durante 60 minutos y 70 ° C durante 15 minutos. cebadores de PCR en tiempo real utilizados para la actina, PHLPP2, SIP1, Slug, Twist, E47 y e-cadherina se enumeran en la Tabla 1. La eficiencia de la PCR para cada conjunto de cebadores es la siguiente: 93% de actina, SIP1 86%, 97% Slug, E47 96%, el 92% de la torcedura, PHLPP2 92% y e-cadherina 85%-PCR en tiempo real se realizó a través de ABI 7500 Fast Real-. Sistema de tiempo de PCR (Applied Biosystems, Burlington, ON) en presencia de SYBR verde según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Burlington, ON). En pocas palabras, cada reacción consistía en 1 l de cDNA, 0,25 l cebador directo (10 M), 0,25 l cebador inverso (10 M), 4,75 l H
2O y 6,25 l de mezcla maestra de SYBR verde. La reacción de PCR se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos a 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Todas las muestras se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante la t de Student y p & lt;.. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
resultados
Cntn-1 reduce la expresión de E-cadherina
Cntn-1 juega un papel crítico en la metástasis de las células de cáncer de pulmón A549 [15]. Para investigar más mediada por Cntn-1 metástasis del cáncer de pulmón, hemos derribado Cntn-1 en las células A549. Mientras desmontables de Cntn-1 no afectó a la proliferación celular (Figura 1A), la capacidad de la célula para crecer en agar blando y para invadir matrigel se redujo significativamente (Figura 1B, C). Estos resultados están en línea con el informe que desmontables de Cntn-1 no afectó a la formación de tumores de xenoinjertos, pero redujo la capacidad de metástasis de las células [15].
células A549 (A) fueron transfectadas establemente con el control (CTRL) o Cntn-1 shRNA. Desmontables de Cntn-1 fueron confirmados por Western Blot (recuadro). 1000 células fueron sembradas en placas de las células 96. La proliferación celular se ensayó diariamente usando WST-1 kit de ensayo de proliferación de células durante cinco días. Los experimentos fueron repetidos tres veces. Los resultados típicos de una sola repetición se muestran. (B) Para examinar la capacidad de la célula para crecer en agar blando, 10
4 Las células se sembraron en agar medio que contiene por 3 semanas. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces. imágenes típicas de un experimento se muestran (panel izquierdo). Los tamaños de colonias en agar blando se calcularon utilizando ImagePro programa de software 5.0 y presentados como media ± desviación estándar. *:
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células A549 shCNTN-1 (2 de cola prueba t de Student). (C) A549 shCTRL y shCNTN fueron examinados por su capacidad para pasar a través de una membrana de control y matrigel. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces. imágenes típicas de un experimento se muestran (panel izquierdo). La invasión se cuantificó (panel derecho).
La capacidad de invasión de los cánceres de células epiteliales de origen es atribuible a la pérdida de la proteína de adhesión celular epitelial, E-cadherina [29], [30]. Para examinar si la E-cadherina contribuye a la invasión de células medaited-Cntn-1, hemos sido capaces de demostrar que desmontables de Cntn-1 aumentó significativamente la expresión de E-cadherina (Figura 2A). Esta regulación positiva fue, en parte debido a la elevación en la transcripción E-cadherina, evidenciado por el aumento de la E-cadherina mRNA (Figura 2B) y la actividad del promotor de E-cadherina (Figura 2C). Además, en consonancia con Cntn-1 está anclado en la superficie celular [3] y el sitio de la función para la E-cadherina también estar en la superficie de la célula, desmontables de Cntn-1 no sólo reduce sustancialmente el contenido de la superficie celular de Cntn-1 ( Figura 2D), sino también el aumento de la superficie celular E-cadherina (Figura 2E). En conjunto, las observaciones anteriores demuestran que Cntn-1 reduce la expresión de E-cadherina, al menos in vitro.
(A) Los lisados celulares se prepararon a partir de las líneas celulares indicadas, seguida de la detección de E-cadherina, Cntn -1 y actina por Western blot (panel izquierdo). Los experimentos fueron repetidos tres veces. Los niveles de E-cadherina se cuantificaron y se representan (media ± SD). *:
p Hotel & lt; 0,05 por dos colas de la t de Student. (B) en tiempo real PCR análisis de la expresión de E-cadherina en las líneas celulares indicadas. β-actina se utilizó como control interno. E-cadherina mRNA en células A549 shCNTN se muestra como un cambio veces a la de las células A549 shCTRL. *:
p Hotel & lt; 0,05 por dos colas de la t de Student. las células (C) shCTRL A549 y A549 shCNTN fueron transfectadas transitoriamente con E-cadherina promotor impulsado luciferasa y un CMV impulsados LacZ construir durante 48 horas, seguido de la evaluación de las actividades de luciferasa y β-gal. Los experimentos fueron repetidos tres veces. (D) La tinción de inmunofluorescencia de A549 y A549 shCTRL shCNTN para Cntn-1. (E) La tinción de inmunofluorescencia para la E-cadherina en las líneas celulares indicadas. Los núcleos se counterstained con DAPI.
A fin de determinar la relación entre Cntn-1 y E-cadherina, hemos examinado 63 carcinomas primarios de pulmón (Tabla 2). Aproximadamente el 65% (41/63) y 35% (22/63) de los carcinomas primarios de pulmón expresados fácilmente detectable (Cntn-1
+) e indetectable Cntn-1 (Cntn-1
-), respectivamente, por IHC (Figura 3A). Esto es consistente con la incidencia publicado por Cntn-1
+ frente Cntn-1
- carcinomas primarios de pulmón [15]. Además, en nuestro análisis de 46 estadios I /II y 17 etapas III /IV carcinomas de pulmón primario (Tabla 2), aproximadamente el 61% de las fases I /II y el 76% de los estadios III /IV carcinomas son Cntn-1-positivo (Figura 3B), lo que indica un papel de Cntn-1 en la progresión del cáncer de pulmón.
sesenta y tres carcinomas primarios de pulmón de microarrays de tejidos se tiñeron IHC para Cntn-1 y e-cadherina. (A) las imágenes típicas de los cánceres de pulmón con niveles altos y bajos de Cntn-1. El porcentaje de carcinomas de pulmón con niveles altos o bajos de Cntn-1 se indica. (B) micromatrices de tejido fueron escaneados y analizados con ImageScope. Se analizó Cntn-1 de expresión tras la progresión del cáncer de pulmón. (C) las imágenes típicas de los cánceres de pulmón con niveles altos y bajos de E-cadherina. El porcentaje de carcinomas de pulmón con niveles altos o bajos de E-cadherina se indica. (D) En base a la tinción IHC, se calculó la proporción de carcinomas Cntn-1-positivas que expresaron niveles altos o bajos de E-cadherina. (E) Cáncer de pulmón primario fue manchada por IHC Cntn-1 y E-cadherina. Regiones positivo para Cntn-1 y negativo para E-cadherina (caja azul, círculo azul), positivo para Cntn-1 y positiva de la E-cadherina (caja verde), negativo para Cntn-1 y positivo para E-cadherina (caja roja ) y ambos Cntn-1 y e-cadherina negativo (cuadro negro) se puede observar.
también analizamos la expresión de e-cadherina en el carcinoma de pulmón primario. E-cadherina
+ y E-cadherina
- Se observaron carcinomas (Figura 3C) con la mayoría de los casos son la E-cadherina-negativas (63% o 40/63). Esto está en línea con una serie de publicaciones que demuestran el 60% -70% de adenocarcinoma de pulmón que expresan la reducción de expresión de E-cadherina [31], [32]. Sin embargo, otros también han informado de porcentajes más bajos, menos del 50% de los cánceres de pulmón que expresan reduce E-cadherina [33], [34]. Es importante destacar que aproximadamente el 61% de los carcinomas Cntn-1 positivas son también E-cadherina-negativas (Figura 3D). Sin embargo, lo hicimos observar carcinomas que fueron negativos para ambos Cntn-1 y E-cadherina (datos no mostrados), lo que sugiere que Cntn-1 no es el único factor que inhibe la expresión de E-cadherina. En apoyo a esta sugerencia, mientras que las regiones Cntn-1 de cáncer de pulmón negativo podrían ser positivas E-cadherina, del mismo paciente la expresión carcinomas de pulmón positivo Cntn-1 redujo los niveles de E-cadherina (Figura 3E). Tomados en conjunto, nuestra investigación apoya el concepto de que Cntn-1 facilita la progresión del cáncer de pulmón /metástasis en parte a través de la regulación por disminución de la E-cadherina.
Cntn-1 disminuye la expresión de E-cadherina a través de la mejora de la activación de AKT
para examinar los mecanismos responsables de la regulación a la baja mediada por Cntn-1 de expresión de E-cadherina, en primer lugar, determinar si Cntn-1 afecta a la expresión de caracol. Caracol es el inhibidor más ampliamente estudiado de E-cadherina transcripción [23]. En las células A549, desmontables de Cntn-1 no cambia la expresión de Snail (Figura 4A), lo que sugiere que el caracol no puede ser el principal factor implicado en la inhibición mediada por Cntn-1 de expresión de E-cadherina en células A549. Tras el examen de otros factores de transcripción E-cadherina, SIP1 y la expresión de Slug disminuyeron después Cntn-1 desmontables en las células A549 (Figura 4 B, C). Sin embargo, no se observaron cambios para E47 y Twist (datos no mostrados).
(A) Los lisados celulares de las líneas celulares indicadas se examinó para la expresión caracol por Western blot. Los experimentos se realizaron tres veces. Se muestran las imágenes típicas (recuadro) y la cuantificación de la expresión de Snail. en tiempo real el análisis de PCR de SIP1 (B) y (C) Slug expresión en las líneas celulares indicadas. β-actina se utilizó como control interno. El ARNm en las células A549 shCNTN se muestra como un cambio veces a la de las células A549 shCTRL. *:
p Hotel & lt; 0,05 por dos colas t de Student
Otros y recientemente hemos demostrado que la actividad AKT reduce la expresión de E-cadherina [35] - [39. ] y la actividad AKT desempeña un papel crítico en la tumorigénesis y metástasis [40] - [42]. Hemos examinado por tanto, si AKT contribuye a la regulación negativa mediada por Cntn-1 de E-cadherina. Para investigar esta posibilidad, se determinó el estado de activación de AKT en las células control A549 y A549 en las células en las que Cntn-1 fue derribado. En comparación con las células shCTRL, desmontables de Cntn-1 redujo significativamente la activación de AKT (Figura 5A). Para confirmar aún más cambios en la activación de AKT, hemos demostrado que, en comparación con las células shCTRL fosforilación de la serina 9 de GSK3, un objetivo AKT bien establecida [41], se redujo significativamente en Cntn-1 desmontables células (Figura 5B). En conjunto, estas observaciones ponen de manifiesto que Cntn-1 juega un papel en la activación de AKT.
(A) Los lisados celulares de A549 shCTRL y A549 shCNTN se examinó para p-AKT y AKT total en un Western blot (panel izquierdo) . la activación de AKT se cuantificó (panel derecho). También se determinaron (B) la fosforilación en Ser9 de GSK3 (pGSK3β), GSK3, y la expresión de GAPDH en el A549 y shCTRL shCNTN A549 células.
A continuación, determinamos si la modulación de la actividad de AKT contribuye a Cntn-1 disminución inducida por la expresión de E-cadherina. La inhibición de la activación de AKT con un inhibidor de AKT aumentó la expresión de E-cadherina en células A549 (Figura 6A), lo que indica que la reducción de la activación de AKT en desmontables de Cntn-1 puede contribuir a la inhibición observada de la invasión de células A549 (Figura 1). Para probar esta posibilidad, hemos sido capaces de demostrar que, si bien desmontables de Cntn-1 reduce la invasión de células A549 tras el tratamiento DMSO (control de la vesícula), desmontables de Cntn-1 no inhibió aún más la invasión de células A549 cuando la activación de AKT fue inhibida (Figura 6B) . En conjunto, estas observaciones apoyan la idea de que Cntn-1 inhibe la expresión de E-cadherina a través de la mejora de la activación de AKT. Como la reducción de la E-cadherina juega un papel vital en la metástasis del cáncer [29], [30], pérdida de E-cadherina, por tanto, contribuye a la metástasis del cáncer de pulmón.
células A549 (A) fueron tratados con un inhibidor de AKT (inhibidor de AKT VIII) a concentraciones crecientes y luego se examina para e-cadherina, la activación de AKT (pAKT), la expresión de AKT y actina. (B) A549 y A549 células shCTRL shCNTN-1 eran modelo de tratamiento (DMSO, la parte superior dos paneles) o tratados con un inhibidor de AKT (dos paneles inferiores), seguido por la determinación de sus inserciones de invasión Matrigel capacidad. Los experimentos fueron repetidos tres veces. Ambos se muestran las imágenes típicas y cuantificación de la capacidad de invasión de las células. *:.
p Hotel & lt; 0,05 por dos colas t de Student
Cntn-1 aumenta la activación de AKT mediante la reducción de la expresión PHLPP2
AKT se regula la actividad por tanto fosfatasas ascendentes y descendentes, PTEN y PHLPP (dominio PH de repetición rica en leucina proteína fosfatasa). Por lo tanto, determinar si uno o ambos fosfatasas están implicadas en Cntn-1 inducida por la reducción de caída-de la activación de AKT. En comparación con las células shCTRL, desmontables de Cntn-1 no afectó significativamente la expresión de PTEN (Figura 7A). Sin embargo, la reducción en Cntn-1 aumentó significativamente la expresión PHLPP2 en células A549 (Figura 7B). Además, la regulación positiva de PHLPP2 en-1 Cntn desmontables células A549 fue en parte atribuible al incremento en PHLPP2 mRNA (Figura 7C), que puede ser el resultado de cualquiera de la regulación positiva de la transcripción de genes PHLPP2 o estabilización de PHLPP2 mRNA.
(a) A549 y A549 shCTRL shCNTN-1 lisados celulares se examinaron para la expresión de PTEN por Western blot (arriba). Los experimentos se realizaron tres veces. imágenes típicas de un solo experimento se muestran (panel izquierdo). la expresión de PTEN también se cuantificó (panel derecho). (B) la expresión PHLPP2 en el A549 shCTRL y líneas de células A549 shCNTN fueron examinados por Western blot (arriba). Los experimentos fueron repetidos tres veces. imágenes típicas de un solo experimento se muestran (panel izquierdo). PHLPP2 expresión se cuantificó (panel derecho). *:
p Hotel & lt; 0,05 por dos colas de la t de Student. (C) Análisis de PCR en tiempo real de la expresión PHLPP2 en las líneas celulares indicadas. β-actina se utilizó como control interno.
Cntn-1 regulación de la E-cadherina y la activación de AKT no es única para el A549
Para determinar si Cntn-1 regula E- cadherina y AKT en otras líneas celulares de cáncer, se examinaron una serie de mama, riñón, pulmón y cánceres de cuello uterino para Cntn-1 y e-cadherina expresión. A pesar de la amplia variedad de cánceres examinados, Cntn-1 no es una proteína expresada universalmente en el cáncer (Figura S1). Además, puesto que las líneas celulares de cáncer de mama examinados dos expresan E-cadherina, se procedió a examinar si Cntn-1 lata de actividad de E-cadherina y AKT regulado en estas dos líneas celulares. Tras la sobreexpresión ectópica de Cntn-1 en BT549, se observó una disminución en la expresión de E-cadherina en comparación con el control de vector vacío sin cambios en la activación de Akt (Figura S2). Por el contrario, la sobreexpresión de Cntn-1 en las células MCF7 condujo a un aumento en la activación de AKT en comparación con el control de vector vacío (Figura 8A, B), sin embargo, no hubo cambio observado en la E-cadherina (Figura 8C, D). En base a estas evidencias, Cntn-1 mediada por la regulación de E-cadherina y AKT no se limita a cáncer de pulmón y puede desempeñar un papel en otros tipos de cáncer que expresa Cntn-1.
(A) Cntn-1 se sobreexpresa en se recogieron las células MCF7 y lisados de células y se ejecutan en Western blot para Cntn-1, p-AKT, AKT y la expresión de actina. (B) La tinción de inmunofluorescencia para Cntn-1 en las líneas celulares indicadas. (C) Los lisados celulares se obtuvieron de las líneas celulares indicadas. Sólo 10 g de lisados celulares se ha ejecutado en western blot para E-cadherina y la expresión de actina. (D) La tinción de inmunofluorescencia para la E-cadherina en las líneas celulares indicadas. Los núcleos se counterstained con DAPI
Discusión
Cntn-1 es una proteína de adhesión neuronal con funciones en la formación de guiado de los axones y sinapsis [8] -. [10].