Extracto
El tejido adiposo es ahora considerado como un órgano endocrino y metabólico implicado en las reacciones inflamatorias. La adiponectina, una hormona peptídica ácido 244-amino, se asocia con la resistencia a la insulina y la carcinogénesis. La curcumina (diferuloylmethane) es el curcuminoid principal de la especia popular de la India, la cúrcuma. La curcumina posee efectos antitumorales, incluyendo la inhibición de la neovascularización y la regulación del ciclo celular y la apoptosis. Sin embargo, los efectos de la adiponectina y la cúrcuma en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) no están claros. En este estudio, se evaluó la expresión de adiponectina en tumores emparejados y tejidos pulmonares normales de 77 pacientes con NSCLC usando la reacción en tiempo real en cadena de polimerasa, el Western Blot, e inmunohistoquímica. De Kaplan-Meier análisis de supervivencia mostró que los pacientes con una relación de la expresión de adiponectina baja (& lt; 1) tuvieron tiempo de supervivencia significativamente más larga que aquellos con expresión proporción alta (& gt; 1) (
p = 0,015
). La curcumina inhibe la capacidad migratoria e invasiva de las células A549 a través de la inhibición de la expresión de adiponectina al bloquear el receptor de adiponectina 1. Tratamiento de la curcumina inhibió también la
in vivo
el crecimiento tumoral de las células A549 y la expresión de adiponectina. Estos resultados sugieren que la adiponectina puede ser un indicador de pronóstico de NSCLC. El efecto de la curcumina en la disminución de la capacidad migratoria e invasiva de las células A549 mediante la inhibición de la expresión de adiponectina es probablemente mediada a través de las vías de NF-KB /MMP. La curcumina podría ser un agente terapéutico potencial adyuvante importante para el cáncer de pulmón en el futuro
Visto:. Tsai J-R, Liu P-L, Chen Y-H, Chou S-H, Cheng Y-J, Hwang J-J, et al. (2015) La curcumina inhibe células no pequeñas células de cáncer de pulmón metástasis a través de la adiponectina /NF-kB /MMP vía de señalización. PLoS ONE 10 (12): e0144462. doi: 10.1371 /journal.pone.0144462
Editor: Jeremy J. W. Chen, Instituto de Ciencias Biomédicas, TAIWAN
Recibido: 18 Agosto, 2015; Aceptado: 18 Noviembre 2015; Publicado: December 10, 2015
Derechos de Autor © 2015 Tsai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación: Este estudio fue apoyado por las subvenciones NSC 100 - 2320 - B - 037 - 012 - MY2 del Consejo Nacional de Ciencia de la República de China, Taiwán para Jong-peldaño Tsai.. El Consejo Nacional de Ciencia de R.O.C, Taiwán es una organización gubernamental que es externo a la universidad de los autores. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo y en Taiwán. A pesar de los grandes avances en la comprensión de la carcinogénesis pulmonar y en nuevos tratamientos en las últimas décadas, la tasa de supervivencia global a 5 años sigue siendo pobre. esfuerzo de investigación innovadora debe ser redirigido a investigar los posibles marcadores de pronóstico, mecanismos de la carcinogénesis pulmonar y terapia adyuvante.
El tejido adiposo es considerado actualmente como un órgano endocrino que segrega varias citoquinas (adipoquinas) [1], incluyendo la adiponectina y la leptina. La adiponectina es un polipéptido ácido 244-amino que modula numerosos procesos metabólicos tales como el catabolismo de ácidos grasos y regulación de la glucosa [2]. Ejerce efectos significativos sobre el metabolismo y la lipogénesis, así como en la regulación de las respuestas inflamatorias humanos [3]. En los adultos, las concentraciones de adiponectina están inversamente correlacionados con el porcentaje de grasa corporal y la resistencia a la insulina [4]. La adiponectina tiene antidiabético, propiedades anti-aterogénicas, anti-inflamatorias y anti-angiogénicos [5].
El papel de la adiponectina en la carcinogénesis es controvertida [5]. En las neoplasias malignas asociadas con la obesidad, como el cáncer de endometrio, cáncer de mama después de la menopausia, cáncer de colon, cáncer renal, y neoplasias malignas hematológicas, la expresión de adiponectina se correlacionó positivamente con el riesgo de malignidad. Además, las concentraciones bajas de adiponectina han sido reportados en el cáncer gástrico y de próstata [6]. Sin embargo, en los cánceres que no son asociadas con la obesidad, como el cáncer de pulmón, la adiponectina sérica no es un predictor importante de riesgo [7].
receptores de adiponectina 1 y 2 actúan directamente sobre las células tumorales mediante la unión y la activación de los receptores de adiponectina y las vías de señalización corriente abajo [5]. La adiponectina posee anti-angiogénesis y antitumoral capacidad, que se efectúa a través de la apoptosis de células endoteliales mediada por caspasa [8]. También puede inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis de hígado mediante la supresión de la angiogénesis tumoral y la regulación negativa de la ROCK /IP10 /metaloproteinasa de matriz (MMP) -9 vía [9].
Sin embargo, la adiponectina es un marcador potencial de la progresión del cáncer de próstata [ ,,,0],10]. En condrosarcoma, que media la migración de las células de condrosarcoma humanas por la regulación positiva de la transcripción de la integrina alpha2beta1 y la activación de receptor AdipoR, AMPK, p38, y las vías de NF-kB [11]. Sin embargo, su papel en el cáncer de pulmón sigue siendo poco clara [12,13]. Petridou et al. informaron que los niveles circulantes de adiponectina no se correlacionan con las etapas del cáncer de pulmón [14]. La expresión del receptor de adiponectina 1 es un factor pronóstico favorable para el cáncer de pulmón [15].
La curcumina (diferuloylmethane), un compuesto natural extraído de
Curcuma longa
, se ha utilizado desde la antigüedad en el Oriente como un agente curativo para diversas enfermedades. La curcumina tiene varias actividades farmacológicas, incluyendo anti-inflamatoria [16], [16] antioxidante, antimicrobiana [17], y los efectos contra el cáncer [18-21]. Sus efectos contra el cáncer se manifiestan durante la proliferación celular, invasión, metástasis, apoptosis, y la angiogénesis [22]. Por ejemplo, la curcumina puede inducir la apoptosis celular en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [23,24]. La base molecular de su efecto anticancerígeno se atribuye a su efecto sobre varios objetivos, incluyendo factores de transcripción, reguladores del crecimiento, moléculas de adhesión, genes apoptóticos, reguladores de la angiogénesis, y moléculas de señalización celular [25]. A pesar de que la curcumina inhibe la migración de células de cáncer de pulmón y la invasión a través de Rac-1 o Wnt /B-catenina vías, aún se desconoce el mecanismo de regulación de la curcumina en el cáncer de pulmón.
La mayoría de los cánceres de pulmón son diagnosticados en una etapa avanzada cuando el tratamiento es relativamente ineficaz. Cómo aumentar los tratamientos quimioterapéuticos actualmente disponibles con las hierbas medicinales complementarios, que pueden reducir los efectos secundarios y la toxicidad sin comprometer la eficacia terapéutica, se ha convertido en un método popular de las últimas décadas. La curcumina es un tal candidato potencial. Este estudio exploró las funciones de diagnóstico y pronóstico de la adiponectina en el CPNM. Con
in vitro
cultivo de células A549 y en un modelo animal, hemos demostrado el papel potencial de la curcumina para tratar el cáncer de pulmón. También se investigó el mecanismo molecular exacto de la curcumina en la mediación de la adiponectina efecto. En consecuencia, también se explorará el potencial de la curcumina como un agente adyuvante en el tratamiento del cáncer de pulmón.
Resultados
Los datos demográficos y la expresión de adiponectina en pacientes NSCLC
De los 77 CPNM pacientes en este estudio, 58 (75%) habían confirmado histológicamente adenocarcinoma y 19 (25%) tenían carcinoma de células escamosas. Su edad promedio fue de 61,6 ± 10,3 años (rango, 36-78 años). la expresión de adiponectina no se correlacionó con tumor (T), los ganglios linfáticos (N), y etapas. pacientes con CPNM con metástasis tenían significativamente una mayor relación de la expresión de adiponectina (Tabla 1). El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con CPNM con una baja relación de la expresión de adiponectina tenían un tiempo de supervivencia significativamente más larga que los que tienen una alta proporción de la expresión de adiponectina (
p = 0,015
) (figura 1). relaciones de riesgo multivariados ajustados se calcularon a partir de regresión de Cox con las variables adicionales de sexo (masculino vs. femenino), metástasis, tumor, la afectación ganglionar, y las etapas (Tabla 2). El grupo de alta expresión de adiponectina tenía un 2,40 veces mayor riesgo de mortalidad (
p
= 0,04) que el grupo de baja expresión.
Los niveles de expresión de adiponectina, Los receptores de adiponectina, y MMP en pacientes NSCLC
Los niveles de expresión de adiponectina, receptores de adiponectina, y se analizaron las MMP de los pacientes con CPNM (figura 2). La tinción inmunohistoquímica y transferencia Western de tejido de cáncer de pulmón mostraron un incremento en la expresión de la adiponectina y la adiponectina receptor 1 en el tejido de cáncer de pulmón que en el tejido pulmonar normal (Fig 2A-2C). Todos los MMPs también aumentaron en el tejido de cáncer de pulmón que en el tejido pulmonar normal (Fig 2D-2F).
Las muestras (A) (cáncer de pulmón y los correspondientes tejidos pulmonares normales adyacentes) se analizaron con anticuerpos frente a la adiponectina , receptor de adiponectina 1, y el receptor de adiponectina 2 por tinción inmunohistoquímica (tinción DAB y la contratinción de hematoxilina). Para los controles negativos, el anticuerpo fue sustituido con IgG de control. (B-C) Los niveles de expresión de adiponectina, la adiponectina receptor 1, y el receptor de adiponectina 2 en tres pares de cáncer de pulmón y los tejidos normales analizados por Western Blot. (D-F) zimografía de gelatina se utiliza para analizar la actividad de MMP-2 /MMP-9, MMP-1 /MMP-3 y MMP-13 /MMP-14. *
p Hotel & lt; 0,05 vs. el tejido pulmonar normal, con datos representativos de tres pacientes diferentes con NSCLC. T, tumor; N, normal, ADN, la adiponectina; AdipoR1, receptor de adiponectina 1; AdipoR2, receptor de adiponectina 2.
Efecto citotóxico de la curcumina en la expresión de receptores de adiponectina y la adiponectina en las células A549
Las células A549 fueron tratados con diferentes concentraciones de curcumina. El ensayo MTT revelado que la curcumina tuvo un efecto citotóxico en las líneas celulares de A549 a concentraciones & gt; 75 M (Fig 3A). Western Blot reveló también que la expresión de adiponectina en las células A549 se redujo significativamente a una concentración de curcumina & gt; 50 M (Figura 3B). La expresión de la proteína del receptor de adiponectina 1 y la adiponectina receptor 2 no cambió con el tratamiento de cúrcuma incluso a altas concentraciones. La transfección de las células A549 con el vector de la adiponectina o pequeños ARN de interferencia plásmido (siRNA) aumentó con éxito o silenciado la expresión de la adiponectina, como se demuestra por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y transferencia de western (Fig 3C y 3D).
(A) la viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de MTT. El efecto citotóxico de la curcumina fue evidente a concentraciones & gt; 75 M. niveles (B) Expresión de adiponectina, la adiponectina del receptor 1, y los receptores de adiponectina 2 en células A549 se analizaron mediante transferencia western a diferentes concentraciones de curcumina. (C-D) inducción exógena y el silenciamiento de la expresión de adiponectina en las células A549. expresión /proteína adiponectina mRNA en células A549 aumentó significativamente después de la expresión de adiponectina exógeno como se analiza por PCR en tiempo real. la expresión de adiponectina disminuyó significativamente después de silenciamiento adiponectina siRNA mediada. NC-siRNA sirvió como control negativo. fotos representativos de tres experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05 frente al control. Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.
efectos de la curcumina y la adiponectina sobre la capacidad migratoria e invasiva de las células A549
migración celular se analizó mediante el ensayo cero herida, mientras que la invasividad se determinó por Matrigel recubierto de ensayo de cámara de Boyden. En comparación con el grupo de control, la capacidad migratoria e invasiva de las células A549 fue significativamente inhibida con el tratamiento de cúrcuma en una forma dependiente de la dosis (
p
& lt; 0,05) (Fig 4A y 4B). Por otro lado, la adiponectina recombinante aumentó la capacidad invasora y migratoria de las células A549 de una manera dependiente de la dosis (
p
& lt; 0,05). (Fig 4C y 4D)
(A) migración celular se determinó usando el ensayo cero herida y se analizó usando el software Wimasis WimScratch. La capacidad migratoria de las células A549 se inhibió significativamente mediante el aumento de la dosis de curcumina en comparación con el grupo control (
p
& lt; 0,05). (B) invasividad se determinó por el ensayo de cámara de Boyden recubierta con Matrigel. La curcumina disminuyó significativamente la capacidad invasora de las células A549 (
p
& lt; 0,05) cuando la concentración de curcumina fue & gt; 25 uM. (C-D) La aplicación de la adiponectina recombinante (rADN) aumentó significativamente la capacidad migratoria e invasiva de las células A549 (
p Hotel & lt; 0,05). Los resultados de tres experimentos independientes se muestran; los ensayos se realizaron por triplicado.
funciones de regulación de los receptores-1 y la adiponectina adiponectina receptor 2 en la migración y la invasión de las células A549
Las células A549 fueron transfectadas con siRNA adiponectina, la adiponectina receptor 1 siRNA, y la adiponectina receptor 2 plásmido siRNA. transfección plásmido redujo significativamente los niveles de expresión de la adiponectina, receptor de adiponectina 1, y el receptor de adiponectina 2 en las células A549, como se confirmó por transferencia de western (Fig 5A-5C). Silenciamiento de la expresión de adiponectina no afectó a la expresión tanto de la adiponectina receptor 1 y el receptor 2, pero silenciar la expresión del receptor de adiponectina 1 bloqueó el efecto de la adiponectina, que mejoró la capacidad migratoria e invasiva de las células A549. Sin embargo, silenciar la expresión del receptor de adiponectina 2 no antagonizar el efecto de la adiponectina sobre la migración y capacidad de invasión de las células A549 (figura 5D y 5E).
(C-A) Los niveles de expresión de la adiponectina, receptor de adiponectina 1, y la adiponectina receptor 2 se analizaron por transferencia de Western después de la transfección con el vector de la adiponectina o silenciamiento por siADN, siAdipoR1, y siAdipoR2. (D-E) La capacidad migratoria e invasiva de las células A549 se inhibió después de silenciamiento del receptor de adiponectina 1 de expresión mediante transfección con siAdipoR1.
vías de regulación de la curcumina en la expresión de adiponectina
las células A549 se trataron con diversos tipos de inhibidores, incluyendo los inhibidores de PI3K /Akt y MAP quinasa vías {PI3K (LY294002; 10 M), AKT (API-59; 3 M), y los inhibidores de MAPK [PD98059 (10 mM) , SB203580 (10 mM), y SP600125 (10 M) para ERK, p38-MAPK y JNK, respectivamente]}, para 1 h y después con la curcumina (50 M) durante 24 h. Los inhibidores de ERK y p38 bloquearon el efecto inhibidor de la curcumina sobre la expresión de la adiponectina (Fig 6A). Además, la adiponectina recombinante aumentó la expresión de AKT (Fig 6B). ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) mostró que la adiponectina regula la expresión de NF-kB a través de la ruta AKT (figura 6C).
células A549 (A) fueron tratados con diferentes inhibidores de la vía PI3K /AKT y MAP quinasa {(PI3K (LY294002; 10 M), AKT (API-59; 3 M), inhibidores de MAPK [PD98059 (10 mM), SB203580 (10 mM), y SP600125 (10 M) para ERK, p38-MAPK y JNK, respectivamente] } durante 1 h y después con la curcumina (50 M) durante 24 h. la expresión de adiponectina fue analizada por Western Blot. expresión (B) AKT fue analizada por Western Blot con diferentes concentraciones de adiponectina recombinación. (C) La actividad de p65 /p50 de las células A549 fue analizado por la Agencia Europea después del tratamiento con la adiponectina recombinante o inhibidor de AKT (API-59; 3 M)., respectivamente
Co-inmuno-precipitación (Co-IP) de ensayo
Este ensayo mostró que la adiponectina constaba de monómero, dímero, y multímero (Fig 7A). la curcumina y silenciar la transfección adiponectina disminuye con éxito la expresión de monómero adiponectina y dímero. La cúrcuma también disminuyó la expresión de p65, tal como se muestra mediante los ensayos EMSA (Figura 7B y 7C) Co-IP y. la expresión de adiponectina mejorada mediante transfección con adiponectina también aumentó la expresión de NF-kB. La adiponectina puede trasladar al núcleo para unirse con p65 nuclear.
células (A) A549 tratados con curcumina, silenciados, o transfectadas con la adiponectina se lisaron y la adiponectina fue co-inmunoprecipitó utilizando anticuerpo adiponectina. Inmunotransferencia con los anticuerpos indicados confirmó la co-precipitación del monómero adiponectina, dímero, y multímero. (B) Co-inmunoprecipitación se realizó con anti-adiponectina y los anticuerpos anti-p65. El eluido p65 se separó en SDS-PAGE y inmunotransferencia con los anticuerpos correspondientes, que mostraron asociación sustancial de la adiponectina con el componente p65. (C) La activación de NF-kB por la sobreexpresión o el silenciamiento de adiponectina se determinó por la EMSA. La adiponectina aumento de la translocación nuclear de p65 /p50 y la activación de NF-kB, pero silenciar la expresión de adiponectina tenido el efecto contrario.
En vivo
y
in vitro
efecto de la adiponectina sobre la expresión de MMP
transfección con adiponectina aumentó con éxito los niveles de expresión de MMP-2, -9, -1, y -14 en células A549. Sin embargo, la expresión de MMP-3 y -13 no cambió con la expresión de adiponectina mejorada o silenciados (Fig 8).
zimografía de gelatina se utiliza para analizadas las actividades de MMP-2 /MMP-9, MMP- 1 /MMP-3 y MMP-13 /MMP-14. (A-F) Las actividades de MMP-9, -1 y -14 se incrementaron después de la sobreexpresión de la adiponectina y disminuyó con el silenciamiento de la adiponectina. La expresión de MMP-3 y -13 no cambió a pesar del aumento de adiponectina o el silenciamiento.
En vivo
efecto de la curcumina sobre el crecimiento tumoral y la expresión de adiponectina y MMP
tratamiento curcumina disminuyó significativamente la
in vivo
crecimiento del tumor y la expresión de adiponectina en comparación con el grupo control (DMSO) (
p
& lt; 0,05) (Fig 9A y 9B), pero la expresión tanto de la adiponectina receptor 1 y el receptor 2 no cambió (Fig 9C). el tratamiento de cúrcuma también se redujo significativamente los niveles de todas las MMP, excepto MMP-1 que se mantuvo libre de influencias, en comparación con el grupo control (figura 9D-9F).
(A) Los tamaños de los tumores de los ratones tratados con curcumina eran disminuido significativamente en comparación con los del grupo de control después de 14 días. la expresión de adiponectina (B) Tumor de los ratones tratados con curcumina se redujo significativamente en comparación con la del grupo control. (C) La expresión del receptor de adiponectina tanto 1 y 2 del receptor en los ratones tratados con curcumina no cambiaron
in vivo
. (D-F) Los niveles de expresión de MMP-2, -9, -3, -13, -14 y se redujeron con el tratamiento de cúrcuma
in vivo
. MMP-1 de expresión no se alteró.
Discusión
La quimioterapia es el tratamiento primario para el cáncer de pulmón avanzado [26], a pesar de la terapia dirigida es más popular. Los efectos secundarios graves de la quimioterapia por lo general limitan su aplicación clínica. En consecuencia, los médicos están cada vez más interesados en la medicina natural desde las últimas décadas debido a su seguridad y eficacia como terapia adyuvante. La curcumina, un compuesto fenólico derivado de la planta
Curcuma longa
, se ha utilizado durante siglos por sus propiedades antiinflamatorias, quimiopreventivo y potenciales propiedades quimioterapéuticos. Hasta la fecha, la evidencia actual muestra que la curcumina puede bloquear la proliferación de células de cáncer, la transformación, y la invasión [27]. Este estudio mostró que la curcumina puede inhibir la capacidad migratoria e invasiva de las células A549
in vitro
de una manera dependiente de la dosis. Además, la curcumina también disminuyó significativamente el
in vivo
crecimiento del tumor.
invasión tumoral y metástasis es un proceso de múltiples etapas complicado que implica la adherencia, la degradación de la matriz circundante, la migración, la proliferación y la angiogénesis [ ,,,0],28]. La curcumina posee una alta capacidad antimetastásica natural. Se puede disminuir la invasión de B16F-10 células de melanoma mediante la inhibición de la expresión de MMP-2 y MMP-9 y mejorar la expresión de proteínas antimetastásicos (E-cadherina y los inhibidores de tejido de MMP-2) [29,30]. En un modelo de tumor de xenoinjerto de cáncer de próstata o cáncer de mama, la curcumina también mostró alto efecto antimetastásico por la supresión de la expresión de MMP-9, NF-kB, y ciclooxigenasa-2 [31,32]. En este estudio, la curcumina puede inhibir la migración y la invasión de A549 de una manera dependiente de la dosis
in vitro
. En nuestro modelo de xenoinjerto con A549, la curcumina puede disminuir significativamente el crecimiento del tumor y tiene un efecto de supresión similar de la expresión de MMPs, a excepción de MMP-1 y -13.
El tejido adiposo se considera como un sistema endocrino que puede secretar una gran cantidad de hormonas y citoquinas, que se conocen como adipocitocinas [33]. La adiponectina representa la proteína de tejido adiposo más abundante con sensibilizante a la insulina, anti-inflamatorio, y las propiedades anti-aterogénicos [34,35]. Además, la adiponectina puede jugar un papel en el desarrollo y la progresión de diversos tipos de tumores malignos [35]. El nivel de adiponectina sérica se asocia inversamente con el riesgo de tumores malignos relacionados con la obesidad, como el de mama, endometrio y próstata, pero se correlaciona positivamente con el cáncer gástrico y la leucemia [35].
Sin embargo, el papel pronóstico de adiponectina circulante en el cáncer de pulmón sigue siendo controvertida [12,14]. En este informe, la expresión de adiponectina no se correlaciona con TN cáncer de pulmón y etapas. pacientes con cáncer de pulmón con una baja proporción de la expresión de adiponectina mostraron mayor tiempo de supervivencia que aquellos con alta expresión. Por lo tanto, la expresión de adiponectina puede ser un factor pronóstico de NSCLC.
En este estudio, también se demostró que los pacientes con CPNM con metástasis tienen relación de la expresión de adiponectina significativamente más altos que los que no tienen metástasis. La sobreexpresión de adiponectina por transfección puede aumentar la capacidad invasiva y metastásica de las células A549, quizás a través de la activación de MMPs (1, 9, 14). La adiponectina puede inhibir de colon [36,37] y la migración de células del hígado [37] El cáncer de próstata sino que promueve y endometrial crecimiento carcinoma. Por lo tanto, el papel de la adiponectina en la carcinogénesis es variable en diferentes tipos de células de cáncer
Hasta el momento, se han identificado tres tipos de receptores de adiponectina:. Los dos receptores principales AdipoR1 y AdipoR2 y un receptor similar a la familia de las cadherinas. AdipoR1 y AdipoR2 son siete proteínas trans-membrana que pueden mediar la oxidación de ácidos grasos y absorción de glucosa a través de la unión adiponectina. receptores de adiponectina funcionales se expresan normalmente en las células epiteliales del pulmón. El uso de la tinción inmunohistoquímica, Jamshid et al. demostró que la expresión de AdipoR1 y AdipoR2 es menor en el tejido NSCLC que en el tejido pulmonar normal. Aquí, hemos demostrado un aumento de la expresión de la proteína AdipoR1 y tinción inmunohistoquímica en tejidos de NSCLC. Silenciamiento de la expresión de AdipoR1 puede bloquear el efecto de la adiponectina sobre la migración y capacidad de invasión de las células A549. El bloqueo de la expresión AdipoR2 no influyó en la capacidad migratoria de las células A549.
La curcumina se ha convertido en un agente adyuvante eficaz en la terapia del cáncer, ya que puede modular la actividad de varios factores de transcripción y sus vías de señalización [38]. Se puede inducir la apoptosis celular a través de la activación de la vía p38 en el cáncer de pulmón y tumor de ovario [39]. Sin embargo, el papel regulador de la curcumina en la expresión de adiponectina sigue sin estar clara. Hemos demostrado que la curcumina inhibe la expresión de adiponectina a través de la p38 y ERK. Por otra parte, la adiponectina puede inducir la activación de la vía AKT, que también está implicada en la activación de la vía NF-kB en el cáncer de pulmón.
En conclusión, la adiponectina puede ser un nuevo potencial marcador de pronóstico de NSCLC. Excepto para la quimioterapia clásico,
in vivo
y
in vitro
resultados corroboran que la curcumina puede ser utilizado como un agente adyuvante en la terapia del cáncer de pulmón en el futuro. Sin embargo, la mala absorción, el metabolismo y la biodisponibilidad de la curcumina puede limitar su aplicación clínica. Varias formulaciones han sido preparados que incluyen nanopartículas, liposomas, micelas, y complejos de fosfolípidos, que podrían aumentar la biodisponibilidad y promover la circulación más larga, mejor permeabilidad, y la resistencia a los procesos metabólicos de la curcumina [40].
Materiales y Métodos
muestra de tumor colección
el CPNM y los tejidos normales correspondientes se obtuvieron de 77 pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica entre 2004 y 2011 en la División de Cirugía Torácica, Departamento de Cirugía, Kaohsiung Medical University hospital. Las muestras de tejido se colocaron inmediatamente en nitrógeno líquido para su envío al laboratorio y luego se almacenan en congeladores -80 ° C hasta que el aislamiento de ARN y la extracción de proteínas. procedimientos de estadificación completas, incluyendo la radiografía de tórax, broncoscopia, tomografía computarizada del cerebro y de la cavidad torácica, ecografía y gammagrafía ósea, se llevaron a cabo para determinar con precisión las características del tumor de acuerdo con el Sistema Internacional en la estadificación TNM para el cáncer de pulmón [41]. Todos los pacientes fueron seguidos hasta marzo de 2012. Los detalles de sus datos demográficos y de supervivencia se actualizan.
Ética declaración
La Junta de Revisión Institucional Koahsiung del hospital de la universidad médica de Investigación aprobó el protocolo de estudio (KMUH -IRB-990357). Todas las participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito.
extracción de RNA y PCR en tiempo real
El ARN total se aisló de los tejidos tumorales de pulmón congelado de pacientes con CPNM y los correspondientes tejidos pulmonares normales adyacentes. ARN aislado de tejido normal de pulmón, tejido tumoral de pulmón, y las células de cáncer de pulmón se analizaron mediante PCR en tiempo real, que se realizó como se describe anteriormente [42]. Los siguientes cebadores para PCR en tiempo real fueron diseñados utilizando el software Primer Express (RealQuant, Roche, Mannheim, Alemania), utilizando las secuencias publicadas: humano adiponectina sentido de cebadores: 5'-GGC GGT GAT GAT AGA GGC AC-3 'y el cebador antisentido adiponectina : 5'-CGC TTG TTG TCC TTC AAG AG-3 'y humano cebador sentido GAPDH: 5'-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3' y el cebador antisentido GAPDH: 5'-CCG CAA TAC GAC CAA ATC C-3 ' .
los datos de fluorescencia se adquirieron en el extremo de la extensión. Se realizó el análisis de fusión para todos los productos para determinar la especificidad de la amplificación. Además, los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1% para confirmar la presencia de tamaños de las bandas correctas. La expresión relativa se calculó como una proporción de la expresión en el tejido de cáncer de pulmón en comparación con la expresión en el tejido adyacente normal (lesión tumor /tejido normal & gt; 1, de alta expresión, y & lt; 1, baja expresión) [42-44 ].
inmunohistoquímicos tinción
Tumor especímenes fueron disecados de tejido pulmonar humano, se fijaron en solución de formalina tamponada al 4% durante la noche, se incluyeron en parafina, y se cortaron en secciones de espesor de 5 micras. Las secciones de parafina fueron des-con parafina con xileno y se tiñeron con anti-adiponectina humana (GeneTex, Irvine, CA, EE.UU.), receptor de adiponectina 1 (AdipoR1), y la adiponectina receptor 2 (AdipoR2) (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las secciones se incubaron con anticuerpo secundario de rábano picante conjugado con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Para las reacciones de color, diaminobencidina (DAB) se utilizó y contratinción con hematoxilina. Para los controles negativos, el anticuerpo fue sustituido con IgG de control.
Western Blot
Western Blot se realizó como se describió anteriormente [42], después de lo cual las membranas fueron tratados con PBS que contenía 0,05% de Tween 20 y 2% de leche desnatada durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron por separado con el ratón anti-humano adiponectina (GeneTex, Irvine, CA, EE.UU.), AdipoR1, AdipoR2, p65, p50, MMPs (2, 9, 1, 3, 13, 14) (Santa Cruz, CA, EE.UU.), histona H1, AKT /pAKT, P38 /pP38 (Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), y β-actina (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) durante 1 h. Después del lavado, las membranas se incubaron con el conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-cabra o IgG de ratón a temperatura ambiente. La inmunodetección se realizó utilizando el reactivo de quimioluminiscencia más NEN y la exposición a Biomax MR Film (Kodak, Rochester, NY, EE.UU.).
Cultivo de células de NSCLC
células de adenocarcinoma de pulmón A549 (ATCC CCL-185) se cultivaron en matraces que contenían medio de crecimiento F12K suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), penicilina 100 U /ml, y 100 pg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2.
Silenciamiento de la expresión de la adiponectina, receptor de adiponectina 1, y el receptor de adiponectina 2 en células A549
siRNA, una secuencia de ARN 21 nucleótidos de doble cadena específica homólogo al gen diana, era utilizado para silenciar la expresión de AdipoR1 y AdipoR2. Adiponectina humana siRNA cebador sentido: 5'-GUG UGG UGG GAU AGA CUU ATT-3 'y el cebador antisentido: 5'-UAA GUC UCC AAU CCC ACA CTT'-3 (Santa Cruz, CA); AdipoR1 humano siRNA cebador sentido: 5'-GGA CAA CGA CUA UCU GCU ACA-3 'y el cebador antisentido: 5'-UAG UCU AGC AGA UCG UUG UCC-3'; y AdipoR2 siRNA cebador sentido: 5'-GGA GUU UCG UUU CAU GAU CGG-3 'y el cebador antisentido: 5'-CCG AUC agosto AAA CGA AAC UCC-3'. Se utilizaron (Sigma-Aldrich, Singapur)
El efecto silenciador de siRNA transfección se evaluó mediante PCR en tiempo real e inmunotransferencia. Brevemente, las células fueron cultivadas en una placa de seis pocillos y transitoriamente transfectadas con 20 nM siRNA utilizando 8μL SIPORT amina (Ambion, Austin, TX, EE.UU.) para un volumen total de 0,5 ml de la transfección. Después de incubación a 37 ° C, bajo 5% de CO2 durante 5 h, se añadió
1,5 ml de medio de crecimiento normal y se incubaron las células durante 48 h.
ensayo de MTT para la viabilidad celular
MTT ensayos se realizaron como se describe anteriormente [42].
in vitro
la migración /invasión
analiza
La capacidad migratoria de las células se ensayó en una ensayo de denudación monocapa, como se describe anteriormente [42]. Las células confluentes fueron heridos por raspado con una punta de pipeta de 100 l, que denudado una tira de la monocapa que era 300 micras de diámetro. Lavamos la cultura dos veces con PBS y se añadieron 5% de SFB como medio. Después de 24 horas, las células migraron en el área denudada y se fotografiaron. Las zonas fueron analizados utilizando el software Wimasis WimScratch, una herramienta de imágenes basado en web de nueva generación para el análisis de la migración celular. técnicas de detección de bordes pueden reconocer fácilmente el borde de ataque y la zona de discontinuidad. Los usuarios pueden cargar las imágenes y el análisis se iniciará automáticamente.
invasión celular se cuantificó usando un ensayo de cámara de Boyden modificada Matrigel. La cámara de invasión BioCoat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células (4 × 10
4) en medio libre de suero se sembraron en filtros recubiertos con Matrigel. En las cámaras inferiores, 5% de FBS se añadió como un quimioatrayente. Después de la incubación durante 24 h, la membrana se lavó brevemente con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehído. La cara superior de la membrana se limpió suavemente con un algodón. La membrana se tiñó utilizando hematoxilina y se retira.