Extracto
El tipo 2 transmembrana serina proteasa matriptase se expresa ampliamente en los carcinomas humanos y cánceres hematológicos. La actividad proteolítica de matriptase es un objetivo potencial de los medicamentos y sondas de imagen. Se evaluó el destino de matriptase activa después de la inducción de la activación matriptase zimógeno. La exposición de ocho células de carcinoma humano a pH inducida robusta activación matriptase zimógeno tampón 6,0 seguido por una rápida inhibición de la matriptase activo naciente por crecimiento de hepatocitos inhibidor del factor activador (HAI) -1. En consecuencia, no se detectó matriptase enzimáticamente activa en estas células. Algunos matriptase activo es, sin embargo, cobertizo rápidamente al medio extracelular por estas células de carcinoma. La falta de matriptase activa asociada a las células y el derramamiento de matriptase activo también se observaron en dos líneas de cáncer hematológico. derramamiento Matriptase se correlaciona estrechamente con la inducción de la activación matriptase, lo que sugiere que la activación matriptase y derramando están acoplados cinéticamente. El acoplamiento permite que una proporción de matriptase activo para sobrevivir HAI-1 inhibición por el rápido desprendimiento de la superficie celular. Nuestro estudio sugiere que el celular gratis, matriptase activa es escasa y podría no ser un blanco eficaz para el
in vivo
imagen y el desarrollo de drogas
Visto:. Chu LL, Xu Y, Yang JR, Hu YA, Chang HH, Lai HY, et al. (2014) Las células de cáncer humano Conservar los niveles modestos de enzimáticamente activa Matriptase Sólo extracelular-Milieu Después de inducir la activación de zimógeno. PLoS ONE 9 (3): e92244. doi: 10.1371 /journal.pone.0092244
Editor: Jian Cao, Universidad de Stony Brook, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Enero, 2014; Aceptado: 9 Febrero 2014; Publicado: 24 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Chu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (NCI) Subvenciones SR1 CA 123223 (M. Johnson y Lin C.-Y.); Departamento de Defensa de Taiwán Beca MAB-102-08 (a J.-K. Wang); y la subvención Chi-Mei Centro Médico CMNDMC-10211 (a J.-K. Wang y L.-L. Chu). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. C.-Y.L. es un inventor de patentes de los EE.UU.#6077938 y#6677377 y M.D.J. y C.-Y.L. son los inventores de la patente estadounidense#7.355.015. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Las proteasas catalizan la descomposición de las proteínas mediante la hidrólisis de enlaces peptídicos. A través de la proteólisis regulada de las proteínas, las proteasas están implicadas en muchos procesos fisiológicos muy controladas, tales como la replicación del ADN, la progresión del ciclo celular, la muerte celular, la angiogénesis, la coagulación sanguínea, la inflamación, la neurogénesis y la inmunidad. desregulación de la proteasa se ha implicado en una amplia gama de enfermedades, incluyendo el cáncer y los trastornos cardiovasculares. Las proteasas son, por lo tanto, considera que los objetivos eficaces para el desarrollo como dianas terapéuticas y biomarcadores. Los inhibidores del proteasoma, por ejemplo, se han utilizado para el tratamiento de neoplasias hematológicas [1], [2] y los niveles séricos de PSA la proteasa (antígeno específico de la próstata) se han utilizado como un biomarcador para el seguimiento de cáncer de próstata en varios contextos [3]. La invención de sondas basados en la actividad (ABP) permite la evaluación de la actividad de la proteasa dentro de células vivas o en organismos enteros [4]. A pesar del éxito de algunos medicamentos y sondas, sin embargo, la orientación actividad proteolítica para el desarrollo de fármacos y biomarcadores no siempre ha sido muy satisfactoria. Tan atractivo como son, diagnósticos y terapias proteasas de inspiración tienen muchas complejidades y limitaciones que deben tenerse en cuenta antes de desarrollar nuevos medicamentos o las sondas dirigidas a las proteasas y proteasas actividades inherentes. Estas limitaciones incluyen el estado activacional de las proteasas, la localización funcional de las proteasas y los inhibidores de proteasas endógenas, todo lo cual afecta a la actividad de la proteasa y puede a su vez afectará a la eficacia del inhibidor de la proteasa y sondas.
El tipo 2 transmembrana serina proteasa (TTSP) matriptase es un ejemplo particularmente interesante de los retos que una proteasa puede presentar en cuanto a su elección como diana para el desarrollo de aplicaciones clínicas y las estrategias que podrían ser necesarias para emplear efectivamente los inhibidores de y sondas para la actividad matriptase . Matriptase se expresa ampliamente por los tejidos epiteliales y, de hecho se requiere para el mantenimiento de la integridad epitelial [5] - [7]. Matriptase se dysregulated comúnmente en carcinomas través de la expresión elevada, aumento de la activación de zimógeno, y un desequilibrio en la expresión de matriptase en relación con inhibidor del factor de crecimiento de hepatocitos activador (HAI) -1, el principal inhibidor de la proteasa endógeno de la actividad matriptase [8] - [10] . Además de las células epiteliales, matriptase también se expresa en los monocitos [11] - [13], mastocitos [14], los condrocitos [15] y las células progenitoras neurales [16], y matriptase ha sido implicado en la osteoartritis [15] y la aterosclerosis [13]. La expresión de matriptase en los mastocitos sugiere que matriptase tiene el potencial de contribuir a enfermedades relacionadas con la alergia, tales como el asma. Varios inhibidores catalíticos matriptase se han desarrollado, incluyendo moléculas pequeñas y los inhibidores basados en péptidos. Estos inhibidores Matriptase exhiben gran potencia frente a la actividad matriptase ensayos realizados con los
in vitro
ensayos que, en la mayoría de los casos, han hecho uso de dominio de serina proteasa matriptase recombinante [17] - [22]. inhibidores basados en anticuerpos dirigidos específicamente contra matriptase activa (a diferencia de la forma de zimógeno) También se han desarrollado [23] y se utiliza para detectar los tumores en los ratones a través de la unión a matriptase activo en la superficie de las células del cáncer [24], [25].
Matriptase se sintetiza como un zimógeno y se somete a autoactivación para adquirir su actividad similar a la tripsina potente. La activación de matriptase es seguido rápidamente por la inhibición de la matriptase activo naciente por la proteína HAI-1 y permanece unido a las células a través del dominio transmembrana de HAI-1. No está claro cuánto y por cuánto tiempo incipiente matriptase activo libre persiste en la superficie celular: parámetros que son importantes para cualquier justificación para el desarrollo de inhibidores y sondas basadas en la actividad Matriptase para aplicaciones clínicas. En el presente estudio, nos propusimos evaluar el destino de matriptase activa después de la inducción de la activación del zimógeno matriptase en el carcinoma de células de cáncer humano y hematológicos. Independientemente de la extensión de la activación inducida matriptase zimógeno, no se encontró, matriptase activo libre de persistir en las células cancerosas. Curiosamente, sin embargo, una pequeña proporción de la matriptase activo sobrevive HAI-1 inhibición por que se derrama rápidamente en el medio extracelular. Nuestro estudio sugiere que debido a la falta de matriptase activo libre presente en la superficie de las células cancerosas, la actividad catalítica matriptase es poco probable que presente un objetivo efectivo para aplicaciones clínicas.
Materiales y Métodos
Químicos y reactivos
gelatina y 5,5'-ditio-bis- (2-nitrobenzoico) (DTNB) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); N-terc-butoxicarbonilo (Boc) Gln-Ala-Arg-7-amido-4-metilcumarina (AMC) se adquirió de Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY); suero bovino fetal (FBS) se obtuvo de Omega Scientific (Tarzana, CA).
Cultivos celulares
células de cáncer de mama humano MCF7 y MDA-MB-468 se mantiene en un mínimo esencial modificado mejorada medio (IMEM), suplementado con 10% FBS. células de cáncer de próstata humano LNCaP, PC3, DU145 y, células de cáncer de ovario humano OVCAR-3, células de mieloma múltiple humana células RPMI 8226 y las células de linfoma de Burkitt humanos Ramos se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS. células de cáncer de mama humanas Células de cáncer de ovario humano OV-2008 SK-BR-3, de queratinocitos humanos HaCaT, y se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% FBS. Las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2. Todas las células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, Virginia), excepto HaCaT (CLS celular Líneas Service GmbH, Eppelheim Alemania) y OV2008 (amablemente suministrada por el Dr. Gaetano Marverti, Universidad de Modena y Reggio Emilia, Italia) [26] .
Los anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales humanos matriptase M24 y M69 fueron usados para análisis de inmunoblot para detectar matriptase total y matriptase activado, respectivamente [27] - [29]. El mAb M69 inmovilizado en perlas de Sepharose se utilizó para los estudios immunodepletion.
ensayo de actividad tríptica después de la inducción de la activación de zimógeno matriptase
Para la inducción de la activación del zimógeno matriptase en células de carcinoma, las células se cultivaron en placas de 150 mm o placas de 6 pocillos. Las células se lavaron con PBS tres veces y después se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente con 150 mM de tampón de fosfato de pH 6,0 (7 ml para 150 mm platos y 1 ml de placa de 6 pocillos) o 150 mM de tampón de fosfato de pH 8,0 como un no -activación de control. En algunos casos, PBS se utilizó como control no activación. Después de la incubación, se añadió base 2 M Trizma para llevar el pH a 8,0. Las células se rasparon de los platos o en los pozos para dar una suspensión combinada que contiene una mezcla de las células y arrojar las proteínas. Una proporción de esta mezcla se sometió a centrifugación a 10.000 rpm usando una centrífuga de mesa Eppendorf durante 1 min. El sobrenadante se recogió como la fracción cobertizo y el sedimento celular se resuspendió en tampón fosfato 150 mM pH 8,0 para el mismo volumen que la muestra antes de la centrifugación para obtener la fracción de células. El procedimiento de desguace de las células del disco y el procesamiento por centrifugación dosis no da lugar a la liberación de matriptase o HAI-1 de las células. El procedimiento fue diseñado para generar la célula y tampón acondicionado en condiciones idénticas, con respecto al pH y la fuerza iónica en el tampón para el ensayo proteolítica. Para las dos células de cáncer hematológicos que crecen como cultivos en suspensión, la relación del número de células en relación con el volumen de la solución tampón de fosfato era 5 × 10
5 células /200 l de tampón. La actividad matriptase en 195 l de las fracciones cobertizo y celular se evaluó mediante la medición de 7-amino-4-metil-cumarina de liberación (AMC) a partir de un sustrato sintético Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (5 l de una solución madre 5 mM) microflúor en placas de 96 pocillos de microtitulación negras (Thermo Scientific). La escisión del sustrato fluorogénico sintético se registró usando un lector de microplacas 2 Wallac 1420 Victor con una longitud de onda de excitación de 360 nm y detección de emisión a 480 nm.
inmunodepleción
El mAb M69 se acopló covalentemente a Sepharose 4B en gel /ml 5 mg como se describe anteriormente [28]. Para immunodepletion, las muestras (200 l) se incubaron con 15 l de M69-Sepharose de rotación en la cámara fría durante 2 horas. El sobrenadante se separó de las perlas por centrifugación y se recogió como la fracción no unida. Las perlas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 1% de Triton X100 cuatro veces después de lo cual las proteínas capturadas se eluyeron de las perlas con tampón de glicina 0,1 M pH 2,4, seguido de neutralización con la base 2 M Trizma.
Western Blot
Las células se lisaron en PBS que contenía 1% de Triton X-100 y 1 mM de DTNB. DTNB se añadió al tampón de lisis para evitar la escisión de enlaces disulfuro [30]. La concentración de proteína se determinó mediante ensayo de proteínas de Bradford y se analizaron por Western blot cantidades iguales de proteínas o proporciones iguales de lisados de células y tampones acondicionado. Las muestras de proteína se diluyeron en 5 x tampón de muestra que no contiene agente reductor, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. Las proteínas se resolvieron mediante 7,5% SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y luego probaron con los diferentes mAbs. La unión de los anticuerpos monoclonales se detectó usando anticuerpos secundarios conjugados con HRP, y se visualizó usando quimioluminiscencia Western Lightening® Reactivo Plus (Perkin-Elmer, Boston, MA).
Gelatina zymography
Los geles de gelatina fueron emitidos por la adición de gelatina (concentración final de 1 mg /ml) a 7,5% en geles de SDS poliacrilamida. Las muestras de proteína se incubaron con tampón de muestra SDS a temperatura ambiente durante 5 min en ausencia de un agente reductor. Después de la electroforesis, los geles de gelatina se lavaron con 2,5% de Triton X-100 /PBS tres veces y después se incubaron mM de tampón Tris pH 8,0 IN100 a 37 ° C durante la noche. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie.
Resultados
células de cáncer de mama MCF7 constitutivamente activan matriptase pero el matriptase activa libre no permanecen asociados con las células
para comenzar a explorar si la actividad matriptase proteolítica asociada con células de cáncer de mama podría utilizarse como un objetivo para el desarrollo de fármacos y /o sondas de formación de imágenes, que mide la escisión del sustrato Boc-Gln-Ala-Arg-AMC por cáncer de mama MCF7 células antes y después de la inducción de la activación robusta matriptase zimógeno (fig. 1A). activación de zimógeno Matriptase aparentemente se produce constitutivamente en las células MCF7 desde la 120-kDa matriptase-HAI-1 complejo fue fácilmente detectado además de la 70-kDa matriptase zimógeno en lisados de células antes de la inducción de la activación matriptase zimógeno (Fig. 1A carril 1) . Después de la inducción de la activación matriptase zimógeno por la exposición de las células a un tampón de pH 6 durante 20 minutos [27], [31], [32], la mayor parte del zimógeno matriptase 70k-Da se convirtió a la 120-kDa matriptase-HAI- 1 complejo (Fig. 1A carril 4). A continuación mide la cantidad de actividad tríptica asociado con MCF7 bajo condiciones constitutivas o inducidas por ácido que produce los dos niveles diferentes de activación matriptase. Dada la posibilidad de que HAI-1 podría unirse e inhibir la matriptase activo después de ambas proteínas se habían liberado de la membrana celular, que mide la actividad tríptica asociado con la superficie de las células en ausencia del detergente no iónico Triton X-100 . En estas condiciones apenas había ninguna escisión de los sustratos fluorescentes por las células MCF7 si la activación matriptase era constitutiva o inducida por la exposición robustamente ácido (Fig. 1B, la curva 1 y 4). Estos datos sugieren que estas células de cáncer de mama no retienen libre, matriptase activa independientemente de los niveles de activación de zimógeno matriptase.
a.
Células de cáncer de mama humano MCF7 fueron incubadas con un tampón de pH 6 para inducir la activación matriptase zimógeno (
a.
derecha, Ley.) o con el tampón de pH 6 suplementado con NaCl 150 mM como control no activación (
a.
la izquierda, para no actuar .). Se prepararon lisados celulares y las muestras retenidas para el análisis de (carriles 1 y 4). Los lisados de células restantes fueron sometidas a inmunodepleción con el matriptase específica activa mAb M69 inmovilizado en perlas de Sepharose para agotar la matriptase activado, predominantemente el complejo de 120 kDa (carriles 2 y 5, y D). El matriptase activado unido al anticuerpo se recuperó por un pH de elución 2,4 tampón seguido de neutralización pH (Carril 3, E). Estas muestras se analizaron a continuación para las especies matriptase por SDS-PAGE (sin hervir las muestras o el uso de agentes reductores) y Western blot utilizando la matriptase total de mAb M24.
B.
Las células, los lisados immunodepleted, y los eluatos se ensayaron la actividad tríptica por escisión de un sustrato fluorogénico sintético con Arg como P1 sitio. Para el ensayo de tripsina, las células permanecieron intactas en ausencia de Triton X-100. NA significa no activación; L para la carga de immunodepletion, D para la fracción immunodepleted; E para la fracción eluida; A para la activación; RFU para la unidad de fluorescencia relativa.
La falta de libre matriptase, activa asociada con las células se debe a la rápida inhibición de la matriptase activa por HAI-1. Anteriormente, hemos generado un anticuerpo monoclonal matriptase que reconoce específicamente y se une a la forma activada de matriptase (si es o no está en un complejo con HAI-1), sin reacción cruzada con matriptase zimógeno [33], [34]. Utilizamos este mAb, M69, unido a las perlas, para eliminar cualquier matriptase activado que estaba presente en los lisados celulares por immunodepletion. Como era de esperar, el 120-kDa matriptase-HAI-1 complejo se eliminó de manera eficiente a partir de los lisados de células MCF7 por este proceso (Fig. 1A, la comparación de los carriles 2 y 5 con los carriles 1 y 4, respectivamente). El 70-kDa proteína matriptase banda presente en las dos muestras no se agota por el mAb matriptase activado, lo que indica que la banda de proteína matriptase 70-kDa en ambas preparaciones contiene poco o nada de matriptase activo y es zimógeno matriptase. Como era de esperar, las muestras immunodepleted no tenían actividad de escisión contra el sustrato fluorescente (Fig. 1B). Las especies activadas matriptase unido a las perlas M69 mAb-Sepharose utilizadas para immunodeplete las muestras se eluyeron usando pH 2,4 tampón de glicina. Hemos demostrado anteriormente que este tampón ácido causa la disociación del complejo matriptase-HAI-1 [33]. Neutralización típicamente resulta en la re-asociación de algunos de los HAI-1 y activa matriptase dejando el resto de la matriptase activo disociado en la forma no complejada después de la neutralización del eluato, con el resultado de que la matriptase activo se detectó por análisis de transferencia de Western usando matriptase un total de mAb predominantemente como una banda de 70 kDa. La intensidad de esta banda matriptase activo 70-kDa era proporcional a la intensidad de la 120-kDa matriptase-HAI-1 banda complejo detectado en ambas situaciones (Fig. 1A, carriles 3 y 6). Esto disocia matriptase actividad tríptica exhibido activo según la evaluación de la escisión del sustrato fluorogénico (Fig. 1B, la curva 3 y 6). Las tasas de escisión de sustrato observaron una buena correlación con los niveles de la matriptase activa detectada por análisis de transferencia de Western. Estos análisis confirman que las especies matriptase asociados a células 120-kDa es un complejo de matriptase activo inactivado y que la especie eluida 70-kDa es de hecho matriptase activo.
Una proporción de matriptase activo fue derramada para el medio extracelular
a pesar de la rápida inhibición mediada por HAI-1 de la matriptase activo asociado con la célula, matriptase activo libre fue de hecho derramada en el medio extracelular antes de HAI-1 de inhibición (Fig. 2). Cuando las células de cáncer de mama MCF7 fueron transitoriamente expuestos a pH 6,0 tampón seguido de neutralización a pH 8,0, se detectó una fuerte actividad tríptica contra el sustrato fluorescente en la mezcla de las células y tampones acondicionado (arrojar fracción) (Fig. 2A). Cuando se separaron las células y las fracciones cobertizo, la actividad tríptica sólo se detectó en las fracciones de cobertizo (sobrenadante) y no asociados con los sedimentos celulares. Estos datos indican que junto con la inducción de la activación matriptase zimógeno, algunas proteasas activos con actividad tríptica se desprenden en el medio extracelular. Para hacer frente a la cuestión de si esta vertiente actividad proteolítica se deriva de matriptase activa a fin de determinar si M69-cuentas podrían immunodeplete la actividad de las muestras (Fig. 2B y C). Immunodepletion del material desprendido de las células de control tratadas con no resultó en un cambio significativo en la intensidad de la banda matriptase 70 kDa (Fig. 2B, carriles 1 y 2) y no se detectó matriptase en el material eluido de las perlas (Fig . 2B, carril 3), consistente con ausencia o el bajo nivel de la vertiente liberan, matriptase activa en estas condiciones. Por el contrario, después de la activación matriptase inducida por el ácido, el agotamiento de las M69-cuentas redujo significativamente los niveles de matriptase total presente en la fracción cobertizo (Fig. 2B, comparar el carril 5 con el carril 4), y una banda fuerte matriptase 70-kDa es presente en el eluido de las perlas (Fig. 2B, carril 6). Esto es consistente con la presencia de libre matriptase, activo en el tampón de condicionado de las células en las que la activación matriptase había sido inducida por la exposición al ácido. Cuando se ensayó la actividad tríptica usando el ensayo de sustrato fluorógeno, se encontró que la actividad proteolítica se redujo drásticamente después de immunodepletion (Fig 2C, comparar las curvas A-L y A-D), lo que confirma que la mayoría de la actividad tríptica presente en la fracción cobertizo era imputable a la libre matriptase, activa. La presencia de matriptase activo en la fracción cobertizo fue confirmado por detección de una actividad gelatinolítica 70-kDa en la fracción cobertizo (Fig. 2D, carril 1) y el agotamiento de la gelatinasa de 70 kDa por las perlas de mAb matriptase activados (Fig . 2D, carril 2). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que mientras que las células de cáncer de mama MCF7 constitutivamente activan matriptase en condiciones normales, la inmensa mayoría de la matriptase activa es inhibida rápidamente por HAI-1, aunque una pequeña proporción de la enzima activa puede ser rápidamente verter en el medio extracelular. El derramamiento de matriptase activo al medio extracelular de esta manera es consistente con la detección de matriptase activo en los medios de comunicación de las células de cáncer de mama acondicionado en nuestro estudio inicial [35].
A.
se indujeron las células MCF7 para activar matriptase por un tampón de pH 6,0 seguido de neutralización a pH 8,0. La mezcla de las células y el tampón (combinar), se analizaron las células sedimentadas después de la centrifugación (Cell), y el sobrenadante tampón (arrojar fracción) solo (Shed) para la actividad tríptica por escisión de un sustrato fluorescente sintético con Arg como P1 sitio . RFU significa unidad fluorescente relativa. B. La vertiente fracciones recogidas de las células MCF7 después de la inducción de la activación matriptase (Acta.) Y el control no activación (para no actuar.) Fueron sometidos a immunodepletion con Matriptase activado perlas mAb M69. Las fracciones cobertizo (L, carriles 1 y 4), las fracciones empobrecido (d, carriles 2 y 5) y las fracciones eluidas (E, carriles 3 y 6) se analizaron para las especies matriptase por Western blot utilizando el mAb M24.
C.
Y
D. Francia El cobertizo fracción recogida de pH 6 células MCF7 tampón expuestos fue immunodepleted usando perlas de M69. La fracción cobertizo (L, carril 1) y la fracción immunodepleted (D, carril 2) se analizaron para la actividad tríptico (panel de
C
) y la actividad gelatinolytic por zimografía de gelatina (panel de
D
, Gel. Zym.). RFU significa unidades fluorescentes relativas; A-L para carga activado; A-D para la empobrecida activado.
Para determinar si otras células de cáncer de mama que expresan Matriptase también regulan matriptase de una manera similar a las células MCF7, se analizaron muestras generadas usando MDA-MB-468 y SK células BR-3 de cáncer de mama en condiciones de crecimiento normales y cuando se someten a la activación matriptase zimógeno inducida por el ácido. especies matriptase y la actividad proteolítica se evaluaron como antes a través de una combinación de ensayo fluorescente de escisión de sustrato, immunodepletion y análisis de inmunotransferencia (Fig. 3). De manera similar a las células MCF7, MDA-MB-468 células constitutivamente activan matriptase (Fig. 3A carril 1), y puede ser inducida para activar enérgicamente matriptase seguido por una rápida inhibición mediada por HAI-1 en respuesta a la exposición celular a un tampón ligeramente ácido (Fig . 3A carril 2). El 120-kDa matriptase-HAI-1 complejo está immunodepleted específicamente utilizando las perlas activadas mAb matriptase (Fig. Carril 3A 3) y la mayoría de la matriptase-ácido disociado activo libre se eluyó y se mantuvo sin complejar después de la neutralización (Fig. 3 carril 4 ). Se detectó actividad tríptica sólo en las fracciones cobertizo y no en las fracciones de células (Fig. 3B), la mayoría de los cuales fue immunodepleted con el matriptase activado mAb M69 (Fig. 3C), lo que confirma la presencia de matriptase activo en el medio extracelular. Los terceros células de cáncer de mama, SK-BR3 asemeja MCF7 y MDA-MB-468 con respecto a la activación matriptase inducida por el ácido (Fig. 3D, carril 1), immunodepletion, y la elución de matriptase activado no complejado de las perlas de mAb matriptase activados ( La Fig. 3D, carriles 2 y 3). Una vez más, la actividad tríptica generado junto con la inducción de la activación de zimógeno matriptase fue derramada y no retenido con las células (Fig. 3 E), y la mayoría de la actividad tríptica arrojar fue derivado de matriptase activo (Fig. 3 F).
Un
y
D
: MDA-MB-468 y SK-BR-3 células de cáncer de mama humano fueron inducidos para activar matriptase (o no) por el pH 6 (o control) buffer-exposición. Los lisados celulares preparados a partir de las células se sometieron a inmunodepleción para eliminar matriptase activado. Los lisados de células de control no activación (N), las células activadas con ácido (A), el M69 agotan lisados (D), y la fracción eluida (E) se analizaron para las especies totales matriptase por inmunotransferencia usando el matriptase mAb M24.
B Opiniones y
E
. MDA-MB-468 (
B
) y SK-BR-3 (
E
) se trataron con tampón de pH 6,0 para inducir la activación matriptase. Después de la neutralización, la mezcla de las células y el tampón (combinar), se analizaron las células sedimentadas después de la centrifugación (Cell), y el sobrenadante tampón (arrojar fracción) solo (Shed) para la actividad tríptica.
C
y
F
. SK-BR-3 lisados de células MDA-MB-468 y, preparado después de la inducción de la activación matriptase se immunodepleted usando el mAb M69. Se analizaron los lisados celulares (A-L) y las fracciones immunodepleted (A-D) para la actividad tríptico.
Reglamento de matriptase en la próstata y las células de cáncer de ovario
También es Matriptase expresados en cáncer de próstata, y las tres líneas de cáncer de próstata más comúnmente utilizados, DU145, PC3 y LNCaP todos expresan matriptase aunque DU145 expresa mucho menos que las otras dos líneas (Fig. 4A, izquierda, carriles 1, 3 y 5). Las tres líneas activan matriptase en respuesta a la exposición al ácido extracelular tal como se indica por la presencia de la kDa matriptase-HAI-1 complejo 120 (Fig. 4A, izquierda, carriles 2, 4 y 6), que también se detecta cuando las muestras son inmunotransferencia usando el mAb M69 activado matriptase-específica (Fig. 4A, derecha, carriles 2, 4, y 6). la exposición al ácido de las células también induce el desprendimiento de la actividad tríptica en el medio extracelular por PC3 y las células LNCaP, pero no por las células DU145 (Fig. 4 B-D). Al igual que con las líneas de células de cáncer de mama, la mayoría de la actividad tríptica arrojar desprende de, la PC3 y las células LNCaP, se confirmó que se asocia con matriptase activo por immunodepletion como se describió anteriormente (datos no mostrados). La falta de actividad detectable tríptico derramada por las células DU145 aparece debido al bajo nivel de expresión matriptase en esta línea celular. Estos datos sugieren que las células del cáncer de próstata se parecen a las células del cáncer de mama en relación con la inhibición mediada por HAI-1 rápida de matriptase activa celular y para el derramamiento de algunos niveles de matriptase activo libre en el medio extracelular.
. Las células de cáncer de próstata humano, DU145 (DU), PC3 (PC3) y LNCaP (LN) se expusieron a pH 6,0 (o control) de tampón de inducir la activación matriptase. Los lisados celulares a partir de células pH 6 expuestas (A, carriles 2, 4 y 6) y las células de control no activación (N, carriles 1, 3, y 5) se analizaron para las especies totales matriptase (izquierda) utilizando el mAb M24 y activado matriptase usando el mAb M69 (derecha).
B Opiniones,
C
, y
D
. Las células humanas de cáncer de próstata, DU145 (
B
), PC3 (
C
) y LNCaP (
D
) fueron tratados con tampón de pH 6,0 para inducir la activación matriptase. Después de la neutralización, la combinación de la célula y las fracciones de cobertizo (combinar), las fracciones de células solas (celulares), y la fracción cobertizo solo (arrojar) se analizaron para la actividad tríptica. RFU significa unidades fluorescentes relativas.
dos líneas celulares de cáncer de ovario que expresan matriptase, OCAR3 y OV2008, también fueron estudiadas y revelaron características idénticas con respecto a la activación matriptase inducida por la exposición a un tampón de pH 6,0 con la rápida formación de complejos activados matriptase-HAI-1, que se agotaron por el mAb M69 (Fig. 5A). Ni la línea celular retiene la actividad asociada a las células con tripsina, pero derramó la actividad en el búfer, lo cual se comprobó que se derivan de matriptase activa de immunodepletion utilizando el mAb M69 (Fig. 5 B y C). El cobertizo matriptase exhibió actividad gelatinolytic, que a su vez se agota por el mAb M69 (Fig. 5D).
Un
. Las células humanas de cáncer de ovario OVCAR3 fueron inducidos para activar matriptase por pH 6,0 (o control) de amortiguamiento. Los lisados celulares se immunodepleted con el mAb M69. Los lisados celulares de las células de control no activación (N, carril 1), las células activadas pH 6 (A, carril 2), y la fracción immunodepleted (D, carril 3) se analizaron para las especies matriptase por transferencia de Western usando el mAb M24 .
B Opiniones. y C. Las células fracciones (celulares), las fracciones de cobertizo (arrojar), y las fracciones de cobertizo Matriptase empobrecido activados (agotan) de OVCAR3 (
B Opiniones.) y células OV2008 (
C
.) fueron analizados para la actividad tríptico. RFU significa unidades fluorescentes relativas.
D.
OV2008 se indujeron las células de cáncer de ovario humano para activar matriptase por el pH del tampón de 6,0. La fracción cobertizo (carril 1) y la fracción cobertizo matriptase-agotado activado (carril 2) se analizaron para la actividad gelatinolítica matriptase por zimografía de gelatina.
La mayoría de la matriptase activado derramada por las células de cáncer hematológico es derramada matriptase activo como libre
matriptase también se expresa en las células de cáncer hematológico, pero, en marcado contraste con las células de origen epitelial, que no expresan ninguna o muy bajos niveles de HAI-1 [36], [37]. Para explorar la activación matriptase y la dinámica de vertimiento en los cánceres de este tipo transitoriamente expuestos RPMI 8226 células de mieloma múltiple humanos y células de linfoma de Burkitt Ramos a pH 6,0 tampón seguido de un ajuste a pH 8 con tampón Tris como habíamos hecho con los cánceres epiteliales. Se detectaron altos niveles de actividad tríptica en la mezcla de las células y el tampón (arrojar fracción) (Fig. 6A), y cuando las células y arrojar fracciones se separaron por centrifugación, la actividad tríptica sólo se detectó en la fracción cobertizo, y no se asoció con las células. Además, la actividad tríptica se eliminó completamente cuando las fracciones de cobertizo se agotaron usando las perlas de mAb matriptase activados, confirmando que matriptase activo es la fuente de la actividad tríptica detectado.
A
y
B.
células de linfoma de Burkitt humano Ramos (
Un
) y RPMI 8226 células de mieloma múltiple humano (
B Opiniones) fueron tratados con tampón de pH 6,0 para inducir la activación matriptase. Después de la neutralización, la combinación de la célula y la fracción cobertizo (combinar), la fracción de células solo (celular), y la fracción cobertizo solo (arrojar) se analizaron para la actividad tríptica.
C
y
D
.