Extracto
pérdida de PTEN y la activación constitutiva de la vía de señalización de PI3K se han asociado con el cáncer de próstata independiente de andrógenos avanzada. células de cáncer de próstata C42Luc PTEN deficientes sobreviven en medio libre de suero y muestran resistencia relativa a la apoptosis, incluso en presencia de la ZSTK474 inhibidor de PI3K. Sin embargo, cuando ZSTK474 se combina con la cicloheximida inhibidor de la traducción, las células sufren apoptosis C42Luc dentro de las 6 horas. Se identificaron desfosforilación de BAD (promotor muerte Bcl2-asociado) como principal molécula de apoptosis-regulador aguas abajo de PI3K, y la pérdida de MCL-1 (leucemia de células mieloides -1) como un objetivo importante de cicloheximida. La combinación de MCL-1 desmontables y expresión de BAD2SA mutante deficiente en la fosforilación es suficiente para desencadenar la apoptosis rápida en células de cáncer de próstata. Estos resultados establecen el mecanismo para la inducción sinérgica de la apoptosis por la combinación de un inhibidor de PI3K y de un inhibidor de la síntesis de proteínas en células de cáncer de próstata PTEN deficientes
Visto:. Yancey D, Nelson KC, Baiz D, Hassan S, Flores A, Pullikuth A, et al. (2013) y desfosforilación malo y disminución de expresión de MCL-1 inducen rápida apoptosis en células cancerosas de próstata. PLoS ONE 8 (9): e74561. doi: 10.1371 /journal.pone.0074561
Editor: Aamir Ahmed, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: 19 Noviembre 2012; Aceptado: 5 Agosto 2013; Publicado: 5 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yancey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por R01CA118329 subvención del Instituto Nacional del cáncer para George Kulik. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Antecedentes
Varios estudios han identificado la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) como uno de los principales factores en la carcinogénesis de próstata y la progresión a la resistencia terapéutica [1] - [3]. PI3K sirve como un mediador de la transducción de la señal intracelular mediante la generación de fosfatidilinositol (3-5) trifosfato (PIP3) a través de la fosforilación de fosfatidilinositol (4,5) -biphosphate (PIP2). Una vez generado, PIP3 recluta proteínas que contienen la homología de pleckstrin (PH) dominio (incluyendo AKT quinasa) a la membrana celular, donde se someten a un cambio conformacional. En Akt, esta conformacionales cambio resulta en una fosforilación de cebado en la treonina 308 por la quinasa dependiente de fosfoinosítido-1 (PDK1) seguido de una activación de la fosforilación en la serina 473 por objetivo mamífero de la rapamicina complejo 2 (mTORC2) [4]. Activado Akt se transloca al citoplasma y núcleo de fosforilar una serie de objetivos de abajo implicados en la supervivencia celular, el crecimiento, la proliferación y la progresión del ciclo celular [5]. La fosfatasa de lípidos y tumor supresor PTEN (fosfatasa y tensina suprimido homólogo en el cromosoma 10) sirve como un regulador negativo de Akt y de la vía PI3K por dephosphorylating PIP3 y convertir de nuevo a PIP2. En el cáncer de próstata, el principal mecanismo para PI3K desregulación es la pérdida de la función de PTEN a través de deleciones homocigóticas, pérdida de heterocigosidad o mutaciones inactivantes [6], [7], que conduce a la activación constitutiva de Akt.
andrógenos ablación induce la apoptosis en las células epiteliales de la próstata [8]. Sin embargo, las células de cáncer de próstata PTEN-negativo no experimentan apoptosis en ausencia de andrógenos [9]. Del mismo modo, los ratones con knockout PTEN próstata restringida han reducido los niveles de apoptosis y la disminución de la involución de la próstata sobre la castración [10]. Estos resultados sugieren que la activación constitutiva de la vía PI3K en los tumores de próstata avanzados PTEN nulo contribuye a la independencia de andrógenos mediante la inhibición de la apoptosis.
Las proteínas de la familia Bcl-2 juega un papel central en la regulación de la apoptosis mediante la permeabilización mitocondrial membrana externa (MOMP) y la liberación de proteínas inductoras de apoptosis, tales como el citocromo c, SMAC, y el factor inductor de apoptosis (AIF) secuestrado dentro de la mitocondria [11]. La familia de proteínas BCL-2 se divide en tres grupos basados en la funcionalidad y la presencia de conservado BCL-2 de homología de dominios (BH1-4): proteínas multidominio anti-apoptóticos, proteínas pro-apoptóticas multidominio, y BH3-sólo las proteínas. Las interacciones entre estos grupos de las proteínas Bcl-2 dictan si una célula vive o muere. Multi-dominio proteínas anti-apoptóticas tales como Bcl-2, Bcl-XL, y MCL-1 MOMP prevenir mediante la interacción con el secuestro y las proteínas Bcl multidominio pro-apoptóticos BAK y BAX [12]. BAK y BAX tienen dominios BH1-3 que permiten para la oligomerización en la membrana mitocondrial externa y posterior MOMP a través de la formación de poros [13]. Los BH3-sólo las proteínas, como el mal, NOXA, y PUMA [14] - [16], se unen competitivamente y neutralizar las proteínas anti-apoptóticas, permitiendo BAX /BAK oligomerización y promoción de la muerte celular, mientras que la subasta y Bim también pueden interactuar con y activar BAX y BAK, inserción en la membrana facilitar y MOMP [11].
BH3-sólo las proteínas de la función de la familia de Bcl-2 como centinelas que regulan la apoptosis y la supervivencia en respuesta a estímulos extracelulares a través de la unión a la ranura hidrófoba de sus parejas anti-apoptóticos. Cada proteína BH3 sólo tiene un perfil único de parejas de unión. Por lo tanto, BAD se ha demostrado que se unen a y neutralizar BCL-2, Bcl-XL, y BCL-W [14], [17], desplazando BAK y BAX y la promoción de la formación de poros. Sin embargo, otras proteínas anti-apoptóticas como MCL-1 y A1 no son neutralizados por el mal, sino que están unidos y se neutraliza por NOXA y PUMA, respectivamente [15], [17], [18].
anteriormente, hemos demostrado que el aumento de expresión BAD promueve la proliferación celular del cáncer de próstata [19]. Al mismo tiempo, el estado de fosforilación de BAD juega un papel importante en la regulación de la apoptosis al servir como un punto de varias vías de señalización anti-apoptóticas, incluyendo PI3K constitutivamente activa [20] convergencia. BAD fosforilación en las serinas 112 y 136 (basado en la secuencia de ratón) [21], [22] facilita la interacción con chaperones 14-3-3, mientras que la fosforilación en S155 dentro del dominio BH3 interrumpe la unión a Bcl-XL o BCL-2 [23 ]. Como resultado de ello, la fosforilación inactiva la función pro-apoptótica de BAD mediante la prevención de la interacción con Bcl-2 y Bcl-XL. Estos resultados anteriores sugieren que la inhibición de PI3K y posterior desfosforilación BAD serían desencadenar la apoptosis en células de cáncer de próstata PTEN-negativas. Sin embargo, encontramos que a pesar de la rápida desfosforilación BAD, la inhibición de PI3K con ZSTK474 induce la apoptosis en células de cáncer de próstata C42Luc en puntos de tiempo relativamente tardías (entre 12-24 horas).
Hemos descubierto que MCL-1 de expresión confiere resistencia a tratamientos con inhibidores de PI3K y desfosforilación malo. Por el contrario, la combinación de MCL-1 pérdida (inducida por cicloheximida o desmontables shRNA) y desfosforilación BAD desencadena la apoptosis rápida. Estos resultados identifican BAD y MCL-1 como los principales centinelas de señalización pro-apoptóticos en las células de cáncer de próstata PTEN-deficientes estudiados.
Resultados
La combinación del inhibidor de PI3K ZSTK474 y la proteína cicloheximida inhibidor de la síntesis induce apoptosis rápida en células de cáncer de próstata C42Luc
la vía de señalización de PI3K se activa constitutivamente en las células de cáncer de próstata C42Luc debido a una deleción de un alelo de la fosfatasa lipídica PTEN y una mutación de desplazamiento de marco en el otro alelo [ ,,,0],24]. Como resultado, estas células de cáncer de próstata no son dependientes de andrógenos o de otros factores de supervivencia externos. Cuando la vía PI3K es inhibida por ZSTK474, las células sufren apoptosis C42Luc, como se desprende de las células con microscopía de lapso de tiempo (Figura 1A, barras a cuadros) controlar.
A) las células C42Luc se trataron con 5 M ZSTK474, 100 mg /ml de cicloheximida, o la combinación, y la apoptosis registraron durante 24 horas usando microscopía de lapso de tiempo. El porcentaje acumulado de las células que entran en apoptosis (redondeo y formación de ampollas en la membrana), se muestra en los puntos de tiempo específicos durante 24 h. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar. *,
p Hotel & lt; 0,05. B) ensayo de activación de caspasa-3 en células C42Luc trató con 5 mM ZSTK474, 100 mg /ml de cicloheximida, o la combinación. Después de 6 h de tratamiento, se lisaron las células, y la actividad de caspasa-3 en los lisados celulares se midió con un sustrato fluorogénico (DEVD-AFC). Los datos se presentan como plegable inducción de la intensidad de fluorescencia normalizada con el control (DMSO). *,
p Hotel & lt; 0,0001. C) La tinción de inmunofluorescencia de la caspasa 3 escindida (rojo) y TUNEL (verde) en células C42Luc tratados con DMSO, 5 mM ZSTK474, 100 mg /ml de cicloheximida, o la combinación. DAPI se utilizó para visualizar los núcleos. Cada fila de paneles representa el mismo campo de visión. D) transferencia de Western de células C42Luc tratados con 5 M ZSTK474, 100 mg /ml de cicloheximida, o la combinación. lisados de células enteras se recogieron en los tiempos indicados y se probaron para pBAD (Ser112) y BAD total.
La comparación de la dinámica de la apoptosis en células C42Luc tratados con el inhibidor de PI3K ZSTK474 solo y en combinación con la traducción cicloheximida inhibidor ha demostrado que la combinación induce la apoptosis más rápidamente, con un número sustancial de células que mueren al cabo de 6 horas. Después del tratamiento con cicloheximida ZSTK474 o solo, apoptosis sólo se hizo aparente a las 12 horas, con un número sustancial de células que mueren 24 horas después de los tratamientos (Figura 1A). La inducción de la apoptosis por el tratamiento de combinación fue confirmada mediante la medición de la actividad de caspasa con los ensayos de TUNEL (Figura 1B, C) DEVD-AMC, la detección de la forma activa de la caspasa 3 escindida de, y el sustrato fluorogénico.
publicaciones anteriores de varios laboratorios, incluyendo el nuestro, mostraron que la fosforilación de la BH3-única proteína BAD juega un papel central en la regulación de la apoptosis aguas abajo de la vía de señalización de PI3K en diversas líneas celulares, incluyendo las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y C42 [20], [25] , [26]. Sin embargo, la desfosforilación BAD no fue diferente entre las células tratadas con ZSTK474 solo o con la combinación de ZSTK474 y cicloheximida (Figura 1D). Estos resultados sugieren que la desfosforilación BAD es irrelevante o insuficiente para una rápida inducción de la apoptosis en células de cáncer de próstata C42Luc.
Pérdida de MCL-1 sensibiliza a las células de cáncer de próstata a la apoptosis inducida por el inhibidor de PI3K ZSTK474
para dilucidar el mecanismo de la apoptosis inducida por la rápida cicloheximida en combinación con ZSTK474, dirigimos nuestra atención a otras proteínas de la familia Bcl-2. Desde BAD desfosforilado puede unirse BCL-XL, Bcl-2 y Bcl-W, pero no puede interactuar con MCL-1, la hipótesis de que MCL-1 podría ser responsable de la apoptosis en células de retraso con TAB desfosforilado. Otra línea de evidencia para apoyar un papel de MCL-1 en la regulación de la apoptosis es su relativamente corta vida media, lo que permite la regulación dinámica de los niveles MCL-1 por estímulos extracelulares [27] y hace MCL-1 especialmente sensibles a la inhibición de la traducción por cicloheximida
células de cáncer de próstata comúnmente se expresan tres proteínas Bcl anti-apoptóticos:. BCL-XL, Bcl-2, y MCL-1 [28], [29]. Análisis de anti-apoptóticos de la familia Bcl2 niveles de expresión de proteínas en células C42Luc tratados con agentes pro-apoptóticos mostró que MCL-1 de expresión se redujo sustancialmente en las células tratadas con cicloheximida durante 6 horas, y en las células tratadas con la combinación de ZSTK474 y cicloheximida (figura 2A). En contraste, no se detectaron reducciones significativas en la expresión de BCL-2 y Bcl-XL en células tratadas con una combinación de inhibidores. Aún así, esta evidencia correlativa deja abierta la posibilidad de que otras proteínas de vida corta pueden contribuir al aumento de la apoptosis en las células tratadas con ZSTK474 y cicloheximida.
A) Western blot de células C42Luc tratados con 5 M ZSTK474, 100 g /ml de cicloheximida, o la combinación durante 6 horas. Lisados de células enteras se probaron para MCL-1, BCL-2, y BCL-XL para comparar los efectos del inhibidor de la síntesis de proteínas y se sondaron para pBAD (S112) y pAKT (S473 y T308) para verificar los efectos del inhibidor de PI3K. B) Análisis de la apoptosis por microscopía de lapso de tiempo. células C42Luc fueron transfectadas transitoriamente con el vector lentiviral que codifica GFP y shRNA MCL-1-específico o revueltos de control shRNA, y se trataron con 5 mM ZSTK474 48 h después de la transfección. El porcentaje de células apoptóticas en los puntos de tiempo indicados después de los tratamientos se determinó como en la Figura 1A. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar. *,
p Hotel & lt; 0,005; #,
p Hotel & lt; 0,001 El recuadro muestra el Western blot de MCL-1 endógeno y los niveles de β-actina (control de carga) en las células C42Luc 48 horas después de la infección con el vector lentiviral que expresa MCL-1 shRNA específica o revueltos. C) ensayo de activación de la caspasa-3 de células transfectadas con shRNA C42Luc focalización MCL-1 o revueltos de control shRNA. La activación de caspasa se midió después de 6 horas las células se trataron con DMSO o 5 ZSTK474 M. Los tratamientos se añadieron 48 horas después de la transfección. *,
p Hotel & lt; 0,01; **,
p Hotel & lt; 0,05. D) Análisis de la apoptosis por microscopía de lapso de tiempo en las células transfectadas con shRNA C42Luc (barras rayadas MCL-1-específicos) o revueltos shRNA (barras a cuadros) y doxiciclina-inducible Bandera-MCL-1. El porcentaje acumulado de células apoptóticas en los puntos de tiempo indicados se determinó como en la Figura 1A 24 horas después del tratamiento doxiciclina. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar. *,
p Hotel & lt; 0,01 #,
p Hotel & lt; 0,05. El recuadro muestra el Western blot de la bandera de etiquetado MCL-1 inmunoprecipitó con resina anti-FLAG y se sondeó para MCL-1 de expresión.
Para probar directamente el papel de MCL-1 como el principal mediador de cycloheximide- la apoptosis inducida en células C42Luc, que disminuyó MCL-1 de expresión de proteínas mediante el uso de shRNA desmontables. Análisis de la apoptosis mediante el ensayo de la caspasa y la microscopía de lapso de tiempo en las células infectadas con un vector lentiviral que expresa ya sea shRNA MCL1 específica o revueltos de control shRNA mostró que ZSTK474 induce apoptosis de manera más eficiente en las células con desmontables de MCL-1 (Figura 2B, C) . Por el contrario, la expresión ectópica de un Flag-MCL-1 constructo inducible por doxiciclina disminución de la apoptosis en células transfectadas con MCL-1 shRNA a niveles comparables como los de las células transfectadas con shRNA revueltos (Figura 2D). Aumento de la apoptosis también se observó en las células tratadas ZSTK474 en el que MCL-1 de expresión fue derribado mediante una segunda MCL-1 específica de construcción de shRNA que tenía como objetivo 3'-UTR (Figura S1). Tomados en conjunto, los resultados de estos experimentos sugieren que MCL-1 pérdida contribuye a la sensibilización inducida por cicloheximida a la apoptosis inducida por ZSTK474.
BIM está implicado en la regulación de la apoptosis en células C42Luc
BIM y Noxa , BH3-sólo las proteínas de la familia Bcl2, se han identificado como socios de MCL-1 de unión. NOXA se une predominantemente a MCL1, mientras que BIM también se puede unir otras proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl2, así como se unen y activan BAX [15], [30]. NOXA, pero no BIM, se informa, involucrado en el complejo de la proteína que se dirige a MCL-1 para la degradación [31]. De hecho, en las células tratadas con cicloheximida C42Luc, NOXA se degradó mientras que la expresión BIM se mantuvo constante (Fig. 3A). Por lo tanto, nos centramos en el análisis de BIM. De acuerdo con informes anteriores, BIM se detectó en los inmunoprecipitados con los granos de la bandera de células C42Luc que expresan FLAG-MCL-1 (Fig. 3B). Para probar si BIM está implicado en la inducción de apoptosis por la combinación de cicloheximida y ZSTK474, hemos utilizado dos shRNAs-BIM específica para derribar expresión de la proteína BIM endógeno. Reducción significativa de la actividad de caspasa, así como disminución de la apoptosis tanto en las células C42Luc-shBIM1 y C42Luc-shBIM2 en comparación con las células control C42Luc, se detectó después de los tratamientos con cicloheximida y ZSTK474 (Fig. 3C, D), lo que confirma el papel de BIM en la apoptosis de las células C42Luc. Además, se observó disminución de la apoptosis tanto en células C42Luc-shBIM2 C42Luc-shBIM1 y comparación con las células C42Luc transfectadas con un constructo que expresa MCL-1-específica shRNA, lo que indica que BIM está implicado en la iniciación de la apoptosis "aguas abajo" de la pérdida de MCL-1.
a) NOXA expresión se reduce en las células C42Luc tratados con la combinación de ZSTK474 y cicloheximida. Western blot de MCL-1, NOXA, BIM y β-actina (control de carga) en las células tratadas durante 4 y 6 horas con cicloheximida. B) Co-inmunoprecipitación de MCL-1 y BIM a partir de células que expresaban inducible por doxiciclina FLAG-MCL-1. C) La apoptosis en las células que expresan C42Luc dos shRNA-BIM específica y en las células parentales se evaluó mediante microscopía de lapso de tiempo. Las células se trataron con vehículo ((-) DMSO) o combinación de cicloheximida y ZSTK474 (+). Cantidad de la apoptosis (%) se determinó como en la Figura 1A. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar. Se presentan los datos para 6 horas post-tratamiento. Las diferencias en el% de apoptosis entre las células de control (que expresan revueltos shRNA) y células C42Luc Bim1 o C42Luc BIM2 fueron estadísticamente significativas (p & lt; 0,05 y p & lt; 0,0001, respectivamente). Inserto muestra disminución de la expresión de BIM en las células que expresan de forma estable shRNA BIM-específica. D) La apoptosis en las células C42Luc que expresa uno de dos BIM específica shRNA o el control de vectores se evaluó midiendo la actividad de la caspasa. Las células se trataron durante 6 horas con vehículo ((-) DMSO) o la combinación de cicloheximida y ZSTK474 (+). Las diferencias en la actividad caspasa entre células control y células C42Luc Bim1 o C42Luc BIM2 fueron estadísticamente significativas (p = 0,002 y p = 0,05, respectivamente). Las células E) C42Luc o células que expresan de forma estable C42LucBIM2 BIM-orientación shRNA fueron transfectadas con el vector lentiviral que expresa GFP y bien revueltos (SCR) o MCL-1 shRNA2 específico de. Por ciento de la apoptosis en células positivas para GFP se determinó por microscopía de lapso de tiempo. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran la media y el error estándar de cuatro campos visuales. Cualitativamente se obtuvieron resultados similares en células C42LucBIM1. beta actina se utilizó como control de carga en (A) y (C).
desfosforilación BAD es responsable de la rápida apoptosis inducida por el inhibidor de PI3K ZSTK474 más cicloheximida
Más temprano, hemos demostrado que el tratamiento con un inhibidor de PI3K provoca la desfosforilación malo en S112 y S136; que también se utiliza shRNA desmontables para demostrar que los malos es necesaria para la inducción de la apoptosis mediante inhibidores de PI3K en células de cáncer de próstata [20]. Sin embargo, varios objetivos de PI3K de señalización además de BAD estaban implicados en la inhibición de la apoptosis [32]. Para determinar si la desfosforilación BAD es suficiente para inducir la apoptosis rápida en presencia de cicloheximida, las células fueron transfectadas con C42Luc una mala mutante deficiente fosforilación-inducible por doxiciclina, donde Ser112 y Ser136 se sustituyeron por alaninas (BAD2SA). Tras el tratamiento con cicloheximida, las células transfectadas con BAD2SA demostraron un aumento significativamente la apoptosis en comparación con las células transfectadas con el tipo salvaje BAD (WT-BAD) (Figura 4A y B). Consistente con un papel central de BAD en la regulación de la apoptosis, el tratamiento de células de la próstata con un BAD-mimético ABT-737 (basado en el dominio BH3 de BAD) aumento de la apoptosis inducida cuando se combina con cicloheximida, similar a la combinación de cicloheximida con el inhibidor de PI3K ZSTK474 (Figura 4C).
a) la activación de caspasa 3 en células C42Luc y C42LucBAD2SA que expresa un mutante deficiente en la fosforilación de BAD. Las células fueron tratadas con 100 mg /ml de cicloheximida durante 6 horas antes del ensayo. *,
p Hotel & lt; 0,01. B) Análisis de la apoptosis por microscopía de lapso de tiempo. células C42Luc fueron transfectadas transitoriamente con un doxiciclina-inducible HA-BAD2SA o de tipo salvaje HA-BAD, y se trataron con doxiciclina (Dox) 48 horas después de la transfección. Después de 18 h de tratamiento Dox, las células fueron tratadas con 100 mg /ml de cicloheximida, y el porcentaje acumulado de las células apoptóticas se determinó por microscopía de lapso de tiempo. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar. *,
p Hotel & lt; 0,01 #,
p Hotel & lt; 0,03. El recuadro muestra el análisis de transferencia Western de BAD fosforilada (pBAD112) y la expresión total del BAD en las células C42Luc recogidos 18 horas después del tratamiento Dox. bandas inferiores corresponden a la proteína endógena, mientras que las bandas superiores corresponden a construcciones expresaron de manera inducible HA-BAD. C) células C42Luc fueron tratados con 100 mg /ml de cicloheximida en combinación con 10 mM ABT-737, un mimético de BH3 basado en el dominio BH de BAD o ZSTK474. La apoptosis se analizó mediante microscopía de lapso de tiempo. se muestra la muerte celular acumulada en los puntos de tiempo indicados. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar. *,
p Hotel & lt; 0,01 **,
p Hotel & lt; 0,05 #,
p Hotel & lt; 0,001 ##,
p Hotel & lt; 0,002 .
simultánea desfosforilación BAD y la pérdida de MCL-1 es suficiente para inducir la apoptosis en células de rápida C42
para confirmar que la desfosforilación BAD y la pérdida de MCL-1 son suficientes para inducir la apoptosis rápida, C42Luc células fueron co-transfectadas con BAD2SA y MCL-1shRNA, y la apoptosis se evaluó mediante microscopía de lapso de tiempo. Las células co-transfectadas con BAD2SA y MCL-1 shRNA mostraron significativamente más apoptosis en comparación con las células transfectadas con la combinación de WT-BAD y MCL-1 shRNA o BAD2SA y revueltos shRNA (Figura 5). Estos resultados identifican BAD y MCL-1 como actores clave en la regulación de la apoptosis en células de cáncer de próstata C42Luc.
C42Luc células fueron co-transfectadas con cualquiera de MCL-1 específica de shRNA o revueltos shRNA en combinación con cualquiera de los BAD2SA o WT-BAD constructo. 48 horas después de la transfección, se analizó la apoptosis por microscopía de lapso de tiempo. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar. *,
p Hotel & lt; 0,05 **,
p Hotel & lt; 0,005 ***,
p
. & Lt; 0,001
Para frente a la generalidad de la inducción de apoptosis por la combinación de cicloheximida y ZSTK474 en células de cáncer de próstata, se evaluó la apoptosis en WFU3, PC3 y DU145 células por microscopía de lapso de tiempo y la caspasa-3 ensayos fluorométricos. PTEN
- /- células epiteliales de la próstata WFU3 ratón mostraron la inducción de la apoptosis comparable a las células C42Luc (Figura S2). En contraste, la inducción de la apoptosis en células PC3 y DU145 por combinación de cicloheximida y ZSTK474 fue sustancialmente menor en comparación con las células C42Luc (comparar las figuras 1A y 6C), a pesar de la desfosforilación de BAD y la pérdida de MCL-1 de expresión en las células tratadas (Figura 6A, B, C). Sin embargo, cuando estas líneas celulares fueron co-transfectadas con vectores de expresión que codifica MCL-1 shRNA y BAD2SA con sitios de fosforilación mutadas, se observó la inducción sustancial de la apoptosis en todas las líneas celulares (Figura 6D, la Figura 5). Este resultado nos llevó a la hipótesis de que una sensibilidad diferente a la apoptosis en líneas celulares puede depender de perfiles de expresión de la familia Bcl2 en estas células.
A) El tratamiento con combinación de cicloheximida y ZSTK474 desencadena MCL-1 pérdida en el PC3, C42Luc y células DU145, así como la desfosforilación BAD en PC3 PTEN deficientes y las células C42Luc. Los lisados celulares preparados 6 horas después de los tratamientos se probaron para pS112BAD, BAD total y MCL-1, utilizando β-actina como control de carga. Apoptosis en C42Luc, PC3 y DU145 células se evaluó por (b) medir la actividad de la caspasa 3 con el sustrato fluorogénico o (C) por microscopía de lapso de tiempo. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar. D) Desmontables de MCL-1 y la expresión ectópica de BAD fosforilación deficiente fueron suficientes para inducir la apoptosis en células de cáncer de próstata. células PC3 o DU145 fueron co-transfectadas con MCL-1-específica shRNA o revueltos de control shRNA en combinación con una construcción de expresión BAD2SA o WT-BAD. 48 horas después de la transfección, se analizó la apoptosis por microscopía de lapso de tiempo. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran las desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar.
De hecho, se ha informado anteriormente de que las células PC3 expresan mayores niveles de BCL-XL, mientras que las células DU145 muestran una disminución de la expresión de BAX ( Fig. 7A) [33], [34]. Puesto que se ha demostrado que la caída de Bcl-XL sensibiliza a las células a la apoptosis [35], nos centramos en las pruebas de la función de la expresión de Bax en respuesta apoptótica de las células DU145. DU145 células fueron transfectadas con GFP-BAX o expresión de GFP vectores, y la apoptosis en células positivas para GFP fue seguido por microscopía de lapso de tiempo. células DU145 transfectadas con GFP-BAX mostraron un aumento de la apoptosis cuando son tratados con la combinación de ZSTK474 y cicloheximida. Por lo tanto, la expresión de BAX restaura la sensibilidad de las células de cáncer de próstata DU145 a la apoptosis inducida por la combinación de tratamientos (Figura 7).
A) análisis de transferencia de Western de la expresión de BAX en PC3, C42Luc, y las células DU145. Los lisados celulares preparados 6 horas después de los tratamientos se sondearon con anticuerpos contra BAX y β-actina. B) Análisis de transferencia Western de las células transfectadas con la proteína verde fluorescente (GFP) o GFP-BAX quimera. C) La expresión de GFP-BAX acelera la apoptosis en las células DU145. Las células fueron transfectadas con GFP o GFP-BAX y la apoptosis se analizaron mediante microscopía de lapso de tiempo. Al menos 100 células se contaron para cada tratamiento. Las barras de error muestran las desviaciones estándar de la media de cuatro campos elegidos al azar.
Discusión
comprender el mecanismo de la inducción de la apoptosis es necesaria para mejorar la eficacia de los inhibidores de PI3K
desregulación de la vía PI3K ha sido bien documentado en una variedad de tipos de cáncer, con aproximadamente el 40% PI3K alteraciones en la señalización en los sitios primarios de tumor de próstata [36], [37] y 100% de señalización alterada en los sitios metastásicos [38]. En el cáncer de próstata, los mecanismos principales para PI3K desregulación son pérdida de la función de PTEN a través de deleciones homocigóticas, la pérdida de heterozigosidad o inactivación de las mutaciones, conduce a la activación constitutiva de la señalización de PI3K /Akt. La pérdida funcional de PTEN se asocia con la progresión del cáncer avanzado, de alto grado de Gleason y mal pronóstico en general, lo que subraya la necesidad de opciones de quimioterapia para tumores con PI3K activa /señalización Akt [39] - [41].
Varios inhibidores de moléculas pequeñas de la vía PI3K, incluyendo los inhibidores pan-PI3K ZSTK474 (Zenyaku Kogyo Co) y BKM120 (Novartis), y el BEZ235 inhibidor dual de PI3K /mTOR (Novartis) ya han entrado en ensayos clínicos de fase temprana para el tratamiento de neoplasias malignas sólidas , incluyendo el cáncer de próstata [42] - [44]. Sin embargo, los ensayos anteriores no informaron de mejoras significativas en los resultados clínicos [45], [46].
Se necesita una mejor comprensión de los mecanismos de resistencia de las células del cáncer a la inhibición de PI3K para seleccionar regímenes terapéuticos óptimos para los tumores con activo la señalización de PI3K. En concreto, la información sobre las proteínas que controlan la apoptosis en células de cáncer de próstata PTEN-deficientes podría guiar la selección de agentes para aumentar la sensibilidad de las células de cáncer de próstata a la apoptosis.
BAD y MCL-1 son moléculas críticas apoptosis reguladora en la próstata las células cancerosas
Nuestro trabajo anterior describe una red de señalización de señalización convergentes vías que controlan la fosforilación de BAD y, por tanto, la apoptosis en células de cáncer de próstata [20]. También puso de manifiesto que desmontables BAD hace que las células de cáncer de próstata LNCaP PTEN-deficientes insensibles a la apoptosis inducida por los inhibidores de PI3K. Estos datos, junto con los anteriores resultados presentados aquí muestran aumento de la apoptosis en las células que expresan BAD2SA mutantes deficientes en la fosforilación, sugieren que el BAD es un regulador crítico de la apoptosis dirigida por la señalización de PI3K. Por lo tanto, la fosforilación de BAD parece ser un biomarcador útil para predecir la eficacia antitumoral de los inhibidores de PI3K. Análisis de la fosforilación de BAD es particularmente relevante considerando que otras vías de señalización activadas por tirosina quinasas receptoras y los receptores acoplados a proteína G pueden fosforilan BAD incluso cuando la vía PI3K está inactivo. Por lo tanto, a pesar de Akt desfosforilación (usado de forma rutinaria como un marcador de la actividad de la vía PI3K), las células pueden no someterse a la apoptosis si BAD es fosforilada por otras vías de señalización.
Nuestros datos demuestran que la desfosforilación malo en sí mismo es insuficiente para inducir un rápido apoptosis en células de cáncer de próstata. Análisis de los mecanismos de la rápida apoptosis inducida por la combinación de inhibidores de PI3K y inhibidores de la traducción identificado MCL-1 como una molécula crítico apoptosis-regulador. Su expresión, cuando disminuido, coopera con BAD en la inducción de la apoptosis. Malos y MCL-1 se expresan de forma ubicua en los tumores de próstata [28] y podría ser regulados de forma dinámica por la fosforilación [20] (en el caso de malo) y tanto la fosforilación y ubiquitinación (en el caso de MCL-1) [47].
la sobreexpresión de MCL-1 se ha asociado con el cáncer avanzado de próstata, incluyendo tumores primarios de alto grado de Gleason y los tumores metastásicos, y malignidades hematopoyéticas [28], [48]. MCL-1 se ha identificado como un regulador crítico de la supervivencia celular, y está sujeto a múltiples niveles de regulación. Transcriptionally, los niveles MCL-1 mRNA se inducen rápidamente por una serie de vías de transducción de señales, incluyendo las vías de MAP /ERK, PI3K /Akt, y JAK /STAT, con la activación aberrante en una variedad de tumores malignos [49]. MCL-1 mRNA también está estrechamente regulada por mir29 b [50]. proteínas MCL-1 tiene una alta tasa de rotación a través de la degradación de proteínas dependiente de ubiquitina por el proteosoma 26 S. En las células sanas, el dominio BH3 de la ligasa E3 MULE se une al surco hidrofóbico de MCL-1 específicamente y desplaza su interacción con BAK y BH3-sólo centinelas [51]. MCL-1 es fosforilada por la glucógeno sintasa quinasa-3β (GSK3) hincapié en las células, donde la vía PI3K /Akt está inactivo y preparado para la ubiquitinación por la ligasa E3 β-TrCP [27], [47]. La alta tasa de rotación de MCL-1 permite la regulación dinámica de MCL-1 de expresión en los niveles de transcripción, traducción, y la degradación. Estos múltiples niveles de regulación de relieve el papel de MCL-1 como un regulador crítico de la apoptosis y atractiva diana terapéutica, así como un biomarcador potencial.
Antes, MCL-1 estaba implicada en la señalización antiapoptótica por IL-