Extracto
El aumento del estrés oxidativo en condiciones de hiperglucemia, a través de la interacción de los AGE con RAGE y receptores a través de la activación de la señalización mediada por la interleucina la transcripción, se ha informado en el cáncer. Proteínas modificaciones están siendo exploradas por su papel en el desarrollo y progresión del cáncer y de autoanticuerpos respuesta contra ellos está ganando interés como sonda para la detección temprana de la enfermedad. En este estudio se ha analizado la evolución de la histona H1 En caso de modificación de metilglioxal (MG) y sus implicaciones en la auto-inmunopatogenia de cáncer. histona modificada mostró modificaciones en los residuos aromáticos, cambió microambiente de la tirosina, la reticulación intermolecular y la generación de AGE. Se mostró enmascaramiento de parches hidrófobos y un cambio en el hipsocrómico en la fluorescencia específica ANS. MG oxida agresivamente la histona H1 que lleva a la acumulación de carbonilos reactivos. Lejos mediciones de CD UV mostraron di-carbonilo mejora de la estructura alfa y la inducción de la conformación de hoja beta inducida; y la desnaturalización térmica (Tm) estudios confirmaron la estabilidad térmica de la histona modificada. El análisis FTIR mostró cambio amida I banda, la generación de un grupo carboxietilo y vibraciones N-Cα en la histona modificada. El análisis CLEM confirmó la formación de Nε- lisina (carboxietil) y los estudios de microscopía electrónica reveló la formación de agregados amorfos. La histona modificada mostró unión con el ADN cooperativa alterado. H1 modificada induce anticuerpos alto título en conejos y la IgG aislada forma sueros de conejos inmunizados con la unión específica H1 exhibido modificado con su inmunógeno en el análisis de Western Blot. IgG aislada de los sueros de pacientes con cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de mama y el cáncer de cabeza y cuello mostró un mejor reconocimiento de neo-epítopos en la histona modificada, lo que refleja la presencia de autoanticuerpos circulantes en el cáncer. Dado que los informes sugieren un vínculo entre el eje AGE-RAGE y la carcinogénesis, glucoxidación de la histona H1 y su inmunogenicidad allana caminos para entender el papel de las proteínas nucleares glycoxidatively dañadas en el cáncer
Visto:. Mir AR, Uddin M, Khan M, Alam K, a Ali (2015) dicarbonilo inducidas por perturbaciones estructurales hacen histona H1 altamente inmunogénica y generar una respuesta auto-inmune en cáncer. PLoS ONE 10 (8): e0136197. doi: 10.1371 /journal.pone.0136197
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, CHINA
Recibido: 18 de abril de 2015; Aceptado: 31 de julio de 2015; Publicado: 28 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Mir et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una de las enfermedades más mortales responsables de un gran número de muertes en todo el mundo y su detección temprana ocupa el centro del escenario en la reducción de su impacto público en general [1-2]. En este sentido, la identificación y evaluación de los autoanticuerpos frente a proteínas modificadas en pacientes con cáncer mantiene la prominencia en el desarrollo de biomarcadores para la detección temprana de la enfermedad. Diversas modificaciones de la proteína después de la traducción (PTMs) que ocurren durante el desarrollo de los cánceres se supone que son importantes por su relevancia diagnóstica [3-4].
Detalles de PTM, como la formación de productos finales de glicación avanzada (AGE ) con papel en el desarrollo y la progresión de los cánceres también están surgiendo [5]. Se ha informado de que un cancerscreate favorables al medio ambiente para la producción de AGE debido a su mayor absorción de la glucosa para satisfacer sus necesidades energéticas [6-8]. Los productos de glicación formadas tienen el potencial de unirse a los macrófagos a través del receptor scavenger macrófago y, en rabias y así contribuir en el desarrollo del cáncer a través de sus capacidades de pro-inflamatorias y explotando el requisito para la activación de la interleucina 6 (IL-6) mediada transductores mitocondriales de señal y activadores de la transcripción 3 (STAT3) [9-11]. evidencias epidemiológicas sobre la heterogeneidad molecular de cáncer revelan los efectos genotóxicos de estrés carbonilo aguda, por lo que los pacientes con diabetes propensos a diversas formas de cáncer [12]. AGE genotoxicidad inducida en las células del túbulo con posibles implicaciones en el desarrollo del cáncer mejorada en enfermedades renales avanzadas también apunta hacia la misma correlación [13].
La detección de autoanticuerpos contra las proteínas generadas de forma aberrante procesados en el cáncer que son inmunogénicas y estimulan celular y la respuesta inmune humoral han dado lugar a una serie de investigaciones dirigidas a la detección de cáncer de autoantígenos en el patrón de la artritis reumatoide, en el que los anticuerpos anti IgG se han reportado como un biomarcador de diagnóstico [14]. Entre las proteínas, modificaciones post-traduccionales de las histonas, en particular, tienen un papel importante en la expresión génica y por lo tanto en el desarrollo y progresión del cáncer, y sus modificaciones también están siendo exploradas como posibles biomarcadores de la progresión de la enfermedad y el pronóstico [15-16].
Además, entre los agentes de la glicación metilglioxal (MG), un compuesto dicarbonilo generado por diversas vías metabólicas se ha identificado como un precursor importante en la modificación de varias proteínas, con 50.000 veces morereactivity que la de la glucosa, con tanto intracelular y proteínas extracelulares, en concentración fisiológica [17], así como a concentraciones más altas [18] y se ha asociado con un papel en una plétora de enfermedades [9, 19]. Metilglioxal mediada perturbaciones pueden inducir cambios estructurales y funcionales en el histona H1 proteína nuclear con posibles implicaciones en la inmuno-biología de varios tipos de cánceres
.
En este estudio, la histona H1 se incubó con concentraciones crecientes de metilglioxal para generar Siglos. cambios estructurales MG inducidos en la histona H1 se analizaron por UV, espectroscopia de fluorescencia y CD, electroforesis en gel de poliacrilamida, transformada de Fourier análisis infrarrojo espectroscópica (FTIR), la determinación del contenido de carbonilo, hidrofobicidad de la superficie (H
0) la estimación, la masa de cromatografía líquida espectroscopia (análisis de m /z), microscopía electrónica de barrido, y mediante el estudio de las interacciones modificados en la unión con el ADN. La posible inmunogenicidad de nativos y las histonas modificadas se comprobó en conejos. Autoanticuerpos circulantes presentes en los pacientes fueron evaluados tipos de cánceres withvarious para su unión a nativos y modificados MG histona H1 a través de estudios de inhibición de unión competitivos y directos en ELISA y mediante el ensayo de retardo en gel.
Materiales y Métodos
histona H1, 2,4-dinitrofenilo hidrazina (DNPH), ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico (ANS), dodecil sulfato de sodio (SDS), metilglioxal, clorhidrato de aminoguanidina, ácido penta-acético dietilentriamina (DTPA), sodio azida, bromuro de etidio, la proteína A-agarosa (columna 2,5 ml preenvasados), agarosa, azida de sodio, Tween-20, los tubos de diálisis, anti-humano y anti-IgG de conejo, conjugado de fosfatasa alcalina, fosfato de para-nitrofenilo, completo de Freund y adyuvantes incompletos se adquirieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EE.UU.. La acrilamida, bisacrilamida, persulfato de amonio (APS) y N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina (TEMED) eran de Bio-Rad Laboratories, EE.UU. hidróxido de sodio, ácido etilendiaminotetraacético (sal disódica), metanol, ácido acético glacial, iso- propanol, cloruro de sodio, carbonato de sodio, nitrito de sodio, nitrato de plata, xileno, hidróxido de sodio, formaldehído, bicarbonato de sodio, etanol, sulfato de amonio y persulfato de amonio se obtuvieron de Qualigens, India. Las placas de ELISA de microtitulación de fondo plano de poliestireno y los módulos se adquirieron de NUNC, Dinamarca. Todos los demás productos químicos /reactivos eran de la más alta calidad analítica disponible.
Determinación de la concentración de proteínas de la histona H1
coeficiente de extinción molar de timo de ternera histona H1 (1280 M
-1cm
-1) se utilizó para determinar la concentración de la proteína midiendo la absorbancia de las soluciones de proteína a 280 nm. peso molecular de la histona H1 timo de ternera era utilizado para los cálculos de 21500 Dalton.
Modificación de la histona H1 por metilglioxal
El procedimiento dado por Roberts
et al
. [20] fue seguido. modificación de las histonas H1 se llevó a cabo en solución salina tampón fosfato (tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4 que contiene NaCl 150 mM). muestras de histona H1 (42 mM) fueron modificados por la incubación con concentraciones variables de metilglioxal (2,5, 5, 7,5 y 10 mM) durante 24 horas a 37 ° C. Todas las muestras se dializaron extensamente después de la incubación.
espectroscopia de absorbancia
El perfil de absorción de las histonas nativas y metilglioxal-modificado H1 se registró el Shimadzu espectrofotómetro (UV modelo 1700) en el intervalo de longitud de onda de 250 -500 nm utilizando cubetas de cuarzo de 1 cm de espesor a una temperatura constante.
estudios de fluorescencia
se registraron los espectros de fluorescencia de Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer a 25 ± 0,1 ° C en una célula de longitud de trayectoria de 1 cm a 3 nm ancho de la ranura.
Se midió la fluorescencia intrínseca excitando las muestras de proteína a 275 nm y el registro de los espectros de emisión en el rango de 300-400 nm.
la pérdida de la intensidad de fluorescencia (FI) se calculó mediante la siguiente ecuación:
electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio-
modificaciones mediadas metilglioxal en la histona H1 se analizaron mediante el uso de la no reducción no desnaturalizante dodecilsulfato de sodio verticales electroforesis de poliacrilamida gel (PAGE) como se describe por
Laemilli
, con ligeras modificaciones [21]. 25 g de muestras de histonas nativos y modificados se mezclaron con un cuarto volumen de tampón de muestra (50% de glicerol, y 0,002% de azul de bromofenol en M tris HCl 1, pH 6,8) y se aplicó en los pocillos de gel de poliacrilamida SDS 10%. El gel se hizo funcionar a 80 voltios durante 4 h a temperatura ambiente y después se tiñeron con nitrato de plata y fotografiado por el sistema Molecular Imager Gel Doc XR.
Otros estudios se llevaron a cabo en la histona H1 modificado por metilglioxal 7,5 mM con nativo histona H1 que sirve como control
Ensayo EDAD
fluorescencia de AGE específica se midió a 440 nm después de excitación a 370 nm y el aumento de la intensidad de fluorescencia (FI) se calculó mediante la siguiente ecuación.:
Determinación de la hidrofobicidad de la superficie (H
0)
la hidrofobicidad de la superficie se determinó con la sonda fluorescente de ácido 8-sulfónico 1-anilinonapthalene- (ANS) por espectroscopia de fluorescencia de acuerdo con una establecida Protocolo [22]. La relación molar entre la histona H1 y ANS se tomó como 1:10 y los espectros de emisión se registraron entre 400 a 600 nm. Variación porcentual de la intensidad de fluorescencia (FI) se calculó mediante la siguiente ecuación:
Determinación del contenido de carbonilo reactivos
La evaluación crítica del contenido de proteínas carbonilo sirve como biomarcadores de daño oxidativo de proteínas. Se analizó el contenido de carbonilo de nativo y metilglioxal modificado histona H1 (MG-H1) según el protocolo publicado, con ligeras modificaciones [23]. muestras H1 nativos y metilglioxal (7,5 mM) modificado histonas se añadieron con cantidades iguales de DNPH 10 mM en HCl 2,5 M. Las muestras se agitaron a intervalos regulares y se incubaron en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Estos se incubaron con 10% TCA durante 15 minutos a -20 ° C y se centrifugaron a 4 ° C durante 15 minutos a 9000 g. Los pellets de proteína se lavó tres veces con hielo frío de etanol /acetato de etilo (1: 1) Después de desechar el sobrenadante y se centrifuga durante 2 min a 9000 g entre todos los lavados. Después del último lavado, el sedimento se suspendió en 1 ml de 6 M de guanidina-HCl y se mezcla correctamente. Las muestras de proteína fueron luego disuelven completamente dejando a 37 ° C durante 15-30 min. Una vez que los pellets de proteína se disuelven completamente, la concentración de DNPH se determinó por medición de la absorbancia a 360 nm frente a cloruro de guanidinio (como en blanco) usando el coeficiente de extinción molar de 22.000 M
-1cm
-1. La absorbancia de las muestras fue tomada a 276 nm y el contenido de proteínas carbonilo se expresó como nmoles mg
-1 de proteína.
dicroísmo circular Determinación
dicroísmo circular evalúa los cambios en la proteína secundaria estructura, plegado y sus propiedades de unión. Hemos llevado a cabo el análisis espectral UV lejano de CD de la histona H1 nativa y su homólogo MG modificamos usando J-815 JASCO espectropolarímetro. El instrumento se fijó a un microordenador con un soporte de celda controlada por termostato conectado al baño de agua RTE 110 de Neslab con una precisión de la temperatura de ± 0,1 ° C. Las exploraciones se tomaron a intervalos de longitud de onda de 1 nm a 25 ° C. Todas las exploraciones se registraron a intervalos de longitud de onda de 1 nm. Los espectros se recogieron a 50 min nm
-1 exploración velocidades, 0,1 nm de paso de datos y un tiempo de respuesta de 2 s. Los espectros se registraron en la región UV distantes entre longitudes de onda de 190 a 250 nm y la concentración de proteína fue de 0,2 mg /ml. Los resultados se obtuvieron en elipticidad residual molar (θ) (deg /cm
2 /dmol) a una longitud de onda λ, basado en la ecuación dada más abajo [24] .¿Dónde θ
obs es la elipticidad observada en grados,
C
p es la fracción molar y
l
es la longitud de la trayectoria de la luz en centímetros. El contenido de α-helicoidal de diferentes muestras de la histona H1 se calcularon a partir de valores theta a 222 nm (MRE
222) usando la siguiente ecuación.
térmica Estudios de desnaturalización (Tm) por CD Far-UV
el termo-estabilidad de la estructura secundaria de la histona H1 y su MG forma modificada se analizó mediante espectroscopia de CD Far-UV a 222 nm de 20 ° C a 90 ° C usando una pendiente de temperatura de 1 ° C /min.
Fourier Transform Infrared espectroscópico Análisis-reflectancia total atenuada (FTIR-ATR)
infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) se llevó a cabo para analizar la estructura secundaria de la histona H1 y MG modificado histonas utilizando Perkin Elmer espectrofotómetro FT-IR. lecturas espectrales infrarrojos se registraron entre 1000 cm
-1 a la 4000 cm
-1. estudios de FTIR se realizaron a 10 mg /ml de concentración de proteína.
espectroscopía de masas de cromatografía líquida (análisis de m /z)
El sistema de HPLC se conectó a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (LCMS-IT-TOF, Shimadzu) equipado con una interfaz de electropulverización, operado en un modo de ion positivo con una tensión fija en 4,5 kV. La temperatura del gas de ion turbo era 250 ° C. El análisis de MS de exploración completa se llevó a cabo en el intervalo de la relación /z 0 a 240 m. Los resultados obtenidos para MS proteínas histonas se compararon con el de la norma CEL.
Se observaron [25]
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) estudios
Los detalles micro-arquitectura de nativos y modificados MG histonas utilizando electrónica de barrido. muestras secadas al aire se adsorbieron sobre membrana de ultrafiltración de celulosa. Las muestras se recubrieron con oro y montados en una cinta de carbono rejillas de acero inoxidable recubiertos operan un voltaje de aceleración de 15 kV y en condiciones de bajo vacío. Las imágenes fueron tomadas usando un JSM-6510LV (JEOL JAPÓN) microscopio electrónico de barrido se ejecuta [26]
Los cambios en la interacción con el ADN:. Dicroísmo circular (CD) Análisis
La interacción de los nativos y MG H1 histona modificada con DNA se analizó por espectroscopia de CD. Se incubaron 50 mg /ml de DNA durante 1 hora con 0,2 mg /ml de H1 nativo y MG modificados H1 respectivamente en tampón 0,05 M Tris, pH 7,4. Las muestras se sometieron a centrifugación a 14.000 rpm durante 8 minutos y CD espectros se registraron para el sobrenadante. DNA nativo de misma concentración se tomó como control. Para evitar cualquier interferencia de las proteínas, se tomaron todas las medidas a longitudes de onda más largas entre 220 cm
-1 a la 330 cm
-1.
Los estudios inmunológicos y Western Blot
Al azar se seleccionaron criados conejos hembra blancos de Nueva Zelanda con un peso desde 1 hasta 1,5 Kg para immunizationas por el protocolo establecido de nuestro laboratorio [27]. suero de inmunoglobulina G (IgG) de los animales de experimentación se aisló mediante cromatografía de afinidad en proteína A-agarosa columna [28] y Western Blot se realizó de acuerdo con el protocolo dado en el folleto técnico para el sistema ECL Plus Western Blot (Amersham, Reino Unido) a establecer la especificidad de los anticuerpos generados contra nativos y modificados histonas H1 en los conejos [29].
Recogida de muestras de sangre para estudios clínicos
con el fin de investigar la presencia de autoanticuerpos contra nativa y MG modificado histona H1, los sueros se obtuvieron de pacientes con cáncer (n = 83) de diferentes grupos de edad que asisten a la JN El Hospital Medical College, Aligarh, India, después del consentimiento informado. Las muestras se obtuvieron después de cuidadoso examen clínico de los pacientes con diagnóstico histopatológico comprobado. La población incluyó a pacientes con cáncer de pulmón (n = 27), próstata (n = 19), mama (n = 22) y pacientes con cánceres de cabeza y cuello (n = 15) .No eran 49 mujeres con una edad media de 38,5 ± 22,9 años y 34 machos de 36 ± 18,3 años con una edad media. La edad de todos los pacientes se redujo entre 15 a 63 años. Las muestras de individuos sanos (n = 40; 20 machos & amp; 20 mujeres con una edad media de 36 ± 18,6 años) sirvieron como control. Las muestras de suero se calentaron a 56 ° C durante 30 min para inactivar las proteínas del complemento y se almacenaron a -20 ° C con azida de sodio 0,2%. La unión de anticuerpos en suero se evaluó mediante ELISA.
Declaración de Ética
Este estudio fue debidamente aprobado por el Comité Institucional de Ética (1617 /FM /22-01-2013) y el Comité de Ética Animal (8289 /OAH /21-02-2013), debidamente registrada con el Comité para los fines de control y supervisión de los experimentos con animales (CPCSEA) India (registro no. 401 /RO /C /2001 /CPCSEA), atthe JN Medical College, Facultad de la medicina, la UMA.
las muestras de sangre fueron recolectadas de los pacientes y sujetos sanos después de consentimiento verbal informado. El modo del consentimiento fue debidamente aprobado por el comité ético. Un buen registro de todos los pacientes e individuos sanos se ha mantenido.
El aislamiento de IgG mediante cromatografía de afinidad
inmunoglobulina sérica G (IgG) se aisló mediante cromatografía de afinidad en proteína A-agarosa columna [ ,,,0],28]. Serum (0,5 ml) diluido con un volumen igual de PBS (pH 7,4) se aplicó en la parte superior de la columna pre-equilibrada con el mismo tampón. El lavado se recicló a través de 2-3 veces y el material no unido se eliminó mediante lavado extensivo con PBS. La IgG unida se eluyó con ácido acético 0,58% en cloruro de sodio 0,85% y se recoge en un tubo que contenía 1,0 ml de 1,0 M Tris-HCl (pH 8,5). Fracciones de 3 ml se recogieron y se leyeron a 280 nm. Se determinó la concentración de IgG considerando 1,4 OD280 = 1,0 mg de IgG /ml. El aislado IgG se dializó frente a PBS y se almacenó a -20 ° C con azida de sodio 0,1%.
Unión directa ELISA
ELISA se llevó a cabo en placas de poliestireno de fondo plano como se describe anteriormente [27] . Poliestireno PolySorp pocillos de microtitulación se recubrieron respectivamente con 100 l de proteínas nativas o metilglioxal modificada (10 g /ml). La absorbancia (A) de cada pocillo se controló a 410 nm en un lector de microplacas automático. Cada muestra se realizó por duplicado y los resultados se expresaron como la media de dos lecturas.
Competición ELISA
La especificidad antigénica de los anticuerpos se determinó mediante ELISA de competición [27] cantidades de inhibidores .Varying (0-20 mg /ml) se mezclaron con una cantidad constante de afinidad de IgG purificada y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 h, y durante la noche a 4 ° C. El complejo inmune formado de este modo se recubrió en los pocillos en lugar de la IgG. Las etapas restantes fueron los mismos que en el ELISA de unión directa. El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula:
ensayo
desplazamiento de banda
Para la detección visual de anticuerpo de unión a antígeno y la formación del complejo inmune, ensayo de retardo en gel se realizó [30]. Los complejos inmunes se prepararon mediante la incubación de cantidad constante de histonas nativos y modificados-MG con cantidades variables de afinidad purificados IgG inmune a partir de sueros de pacientes con cáncer en TBS durante 2 horas a 37 ° C y durante la noche a 4 ° C. Se añadió una cuarta parte de la muestra de colorante a la mezcla y electroforesis en 10% SDS-PAGE durante 4 horas a 80 V. Los geles se visualizaron mediante tinción de nitrato de plata [21].
El análisis estadístico de los resultados
Todas las mediciones se realizaron por duplicado. Los resultados se expresan como media ± S. D. A dos colas
p
valor inferior a 0,05 se consideró como significativo.
Resultados
espectroscopia de absorbancia
espectro de absorción UV de la histona H1 nativo mostró una pico característico de las proteínas en 277 nm. La histona H1 modificado por 2,5, 5, 7,5 y 10 mM de metilglioxal exhibió 67,87%, 90,16%, 94,54% y 96,64% hyperchromicities en los picos espectrales respectivamente. Una joroba como máximo llegó a ser prominente a 340 nm de las proteínas modificadas a las concentraciones más altas de MG. Los resultados se muestran en la figura 1.
intrínseca fluorescencia
Se obtuvo el máximos de fluorescencia para la histona H1 nativa a 305 nm, un rasgo característico de la emisión de tirosina. La incubación de la histona H1 con concentraciones crecientes de metilglioxal condujo a una disminución sustancial en la intensidad de fluorescencia. La modificado metilglioxal histona H1 2,5, 5, 7,5 y 10 mM exhibió una disminución del 31,31%, 49,68%, 81,78% y 95,31% en la intensidad de fluorescencia intrínseca en comparación con la histona H1 nativo. La concentración creciente de metilglioxal en las muestras de proteína condujo a un desplazamiento hacia el rojo de 3, 6, 8 y 10 nm de longitud de onda de emisión. Por otra parte, se observaron picos joroba adicional como en la proteína modificada a 440 nm. Los resultados se muestran en la Figura 2.
Análisis electroforético
Página de resultados mostraron un aumento en la movilidad electroforética de las muestras de proteínas modificadas en comparación con la histona nativa. Las proteínas modificadas presentan una mayor banda de tensión frente a la histona nativa. Una banda extra también apareció en las proteínas modificadas con un peso molecular mayor que el de la histona H1 nativo. Los resultados se presentan en la figura 3.
PAGE de nativo y modificado MG histona H1: 25 g cada una de la histona H1 nativo y 2,5, 5, 7,5 y 10 mM modificado metilglioxal homólogos se cargaron en los pocillos de 10 gel de poliacrilamida% en condiciones no desnaturalizantes (carril 1-5), el carril 6 muestra el marcador de peso molecular.
AGE ensayo
En condiciones idénticas, la histona H1 nativa no dio EDAD apreciable fluorescencia. Las intensidades de fluorescencia observados para nativos y modificados histona H1 eran 7.886 a 430 nm y 446 nm a 39.21, respectivamente. MG-H1 exhibió aumento 79,88% en la intensidad de fluorescencia de AGE. Los resultados se muestran en la figura 4.
hidrofobicidad de la superficie (H
0)
Una disminución significativa en la intensidad de fluorescencia en ANS MG modificado H1 en comparación con la histona nativa era observado. MG nativos y modificados H1 mostró intensidades de fluorescencia de 26,12 a 279 nm y 5,21 a 276 nm que corresponde a una disminución en la intensidad de fluorescencia ANS por 79,97% en el caso de la histona modificada. Un desplazamiento hacia el azul de 3 nm también se observó en el caso de la proteína modificada. Los resultados se muestran en la figura 5.
carbonilo reactivos contenido
La cuantificación espectrofotométrica de carbonilos reactivos unidos a proteína después de la reacción con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) mostró valores de absorbancia de 0,055 y 0,624 para los nativos y modificados histona H1, respectivamente, a 370 nm. El contenido en carbonilo fue de 2,47 /mg nmol de proteína en la histona H1 nativo y 28,36 /mg nmol de proteína en el caso de modificación de histona H1 metilglioxal que representa un 11,48 veces aumentan de carbonilos reactivos. Los resultados se muestran en la Figura 6.
dicroísmo circular espectros
análisis espectral de CD no mostró una diferencia visible en elipticidades molares de histona nativo y modificado en tres longitudes de onda a saber., 190 nm, 201 nm y 222 nm. Se observó un aumento de la elipticidad positiva a 190 nm, una disminución de la elipticidad negativa a 200 nm y un aumento de la elipticidad negativa a 222 nm. La elipticidad observada a 190 nm para la histona nativo y metilglioxal modificado H1 fue 0,909 MDEG y 1.249 MDEG respectivamente. Se obtuvo el elipticidad negativa a 200 nm y 222 nm. A valores de la histona H1 nativo y modificado metilglioxal 200 nm CD (θ) eran - 33.615 MDEG y - 33.132 MDEG y a 222 nm los valores fueron de -8,39 y -10,2, respectivamente. Los resultados se muestran en la Figura 7.
térmica Estudios de desnaturalización (Tm) de Far-UV CD
Los cambios en las características estructurales secundarias obtenidas a través de estudios de temperatura de fusión siguiendo el despliegue los patrones de las proteínas a través de la pérdida de elipticidad a 222 nm, mostraron apertura hélice temprano en la histona nativo en comparación con el MG modificado histona. La temperatura de fusión punto medio (Tm) de MG nativo y modificado histona H1 llegó a ser de 53 ° C y 64 ° C respectivamente. Los resultados se dan en la figura 8.
FTIR-ATR espectroscópica de análisis
resultados de FTIR de la histona H1 nativa mostraron vibración de estiramiento de C = O, una característica banda amida I en 1635 cm
-1. Sin embargo, la modificación post, la banda amida I quedó desplazado a 1640 cm
-1. Aunque no apareció ninguna banda profundas en la región de amida II, sin embargo, la diferencia de porcentaje de transmitancia en esta región era visible. Registramos menos transmitancia para la histona nativo en comparación con su forma modificada. Asimismo, se observó un grupo adicional en la proteína modificada que mostró una banda que se extiende a 1731 cm
-1. Este estiramiento no se observó en la forma nativa. La histona modificada también exhibió una banda adicional en 1066 cm
-1, que estaba ausente en la forma nativa en esta región. Se observaron grandes bandas en la región con números de onda entre 3000 cm
-1 a la 3500 cm
-1. Esta región fue más amplio para la histona modificada que para la proteína nativa. Los resultados se muestran en la Figura 9.
cromatografía líquida espectrometría de masas
Los espectros de masas de la norma CEL fue tomada para investigar la presencia de CEL y sus formas de descomposición inducida por la colisión en el nativo y histonas modificadas. El pico de base y dos espectros de masas de iones producto de la norma CEL se observaron a m /z 219,0145 valora, 84,1024 y 130,1032, respectivamente (Fig 10A). Ninguno de estos picos como se observa en la CEL estándar se encontró en el caso de la histona H1 nativa (figura 10B); la histona H1 modificado dio el producto de iones más prominentes a m /z de 84.1086. Se observaron los picos menos intensos a m /z 130,1208 y 219,1432 del (figura 10C).
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
Microscopía Electrónica de Barrido ha sido ampliamente utilizado para revelar alta -Resolución detalles estructurales de las proteínas. Como se observa en las imágenes de SEM, la formación de agregados es clara debido a la modificación de la histona H1 por MG (Figura 11A). histona nativa parece bastante diferente de su forma modificada (figura 11B).
Resultados de la CD de las interacciones proteína-ADN
El análisis dicroico circular de las interacciones entre la histona H1 y el ADN mostraron marcadas variaciones en las propiedades espectrales de la histona nativa, su forma modificada y el ADN nativo. ADN nativo mostró una banda positiva a 277 nm (θ = 8,542) y una banda negativa a 243nm (θ = 5.851). Las interacciones entre la histona H1 con el plomo ADN para disminuir en pico positivo a 276 (θ = 4,9123) y un aumento en el pico negativo a 245 (θ = 5,092). Los resultados de MG modifican la histona y el ADN eran diferentes de ADN y H1-DNA ya que dio pico intermedio en 277 (θ = 5,882) y un aumento en el pico negativo a 243 (θ = 4,394), respectivamente. Los resultados se muestran en la Figura 12.
estudios de Western Blot
25 g de nativos y MG-H1 apareció como bandas claras en gel de poliacrilamida después de la tinción de plata. La proteína modificada mostró banda de estiramiento, formación de entidad de mayor peso molecular y un aumento de brillo en comparación con la contraparte nativa. En el análisis imunoblot, los anticuerpos inducidos contra la MG-H1 mostraron unión específica para el inmunógeno con poco reconocimiento de los epítopos en la histona H1 sin modificar. Esto reitera nuestros resultados ELSIA. El resultado se da en la figura 13.
A1 y A2 representSDS PAGE de nativos y MG-H1, respectivamente. B1 y B2 son las inmunotransferencias que muestran la unión de anticuerpos anti-MG-H1 a H1 nativo y MG H1-respectivamente.
La unión de autoanticuerpos en suero en pacientes con cáncer a H1 nativo y MG modificó la histona H1
porcentaje significativamente más alto de autoanticuerpos en suero de todos los tipos de cáncer mostraron una mayor unión con metilglioxal modificada H1 en comparación con la forma nativa en los experimentos de unión ELISA directo. Del total de muestras de suero 83, 54 muestras (65,06%) exhibieron apreciablemente mayor unión a la MG-H1as frente a su contraparte nativa, mostrando así un mejor reconocimiento de la histona H1 modificado. Estos incluyen 19 muestras de cáncer de pulmón, 12 muestras de cáncer de próstata, 15 muestras de cáncer de mama y 8 muestras ofhead y el cáncer de cuello. Los resultados se presentan en la figura 14A-14D.
(A) La unión de autoanticuerpos en suero en pacientes con cáncer de pulmón (sueros no. 1 a 27) para nativo (□) y MG modificado histona H1 (■). suero humano normal (NHS) sirvió como control negativo. Los espectáculos de histograma significan los valores de absorbancia. (B) La unión de autoanticuerpos en suero en pacientes con cáncer de próstata (sueros no. 28-46) a los nativos (□) y MG modificó la histona H1 (■). suero humano normal (NHS) sirvió como control negativo. Los espectáculos de histograma significan los valores de absorbancia. (C) La unión de autoanticuerpos en suero en pacientes con cáncer de mama (sueros no. 47-68) a los nativos (□) y MG modificó la histona H1 (■). suero humano normal (NHS) sirvió como control negativo. Los espectáculos de histograma significan los valores de absorbancia. (D) La unión de autoanticuerpos en suero en pacientes con cáncer de cabeza y cuello (sueros no. 69-83) a los nativos (□) y MG modificado histona H1 (■). suero humano normal (NHS) sirvió como control negativo. Los espectáculos de histograma significan los valores de absorbancia.
La unión de IgG de pacientes con cáncer de H1 nativo y modificado MG histona H1
A fin de evaluar la especificidad fina de autoanticuerpos en pacientes con cáncer, se IgG aislado de muestras de suero que muestran mayor unión hacia MG modificado histona H1 y evaluado por la inhibición de ELISA. IgG se mezcló con cantidades variables de nativo y MG-H1 (0-20 mg /ml) y se incubó durante 2 horas a 37 ° C y durante la noche a 4 ° C. La inhibición de anticuerpos observada H1 fornative y las histonas H1-MG fue del orden de 19,4% -36,2% y 49,2% -76,5% respectivamente.El porcentaje de inhibición por H1 nativo en la unión de los anticuerpos de pulmón decir, de próstata, de mama, y la cabeza